专利名称：雅致枝霉△的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是一种雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子序列及其应用。从雅致枝霉总DNA中克隆出这一Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子，并与不同的表达载体连接，转化不同的微生物，使其转基因微生物表达其下游基因的方法和应用。
背景技术：
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFA)是指含有两个或两个以上双键、碳原子数为16至22的直链脂肪酸。PUFAs的生物合成是在饱和脂肪酸合成途径上扩展的，由两个主要反应组成，即碳链的延长和脱氢。硬脂酸(Stearic acid，C180)脱饱和成为油酸(Oleic acid，OA.181Δ9n-9)，然后转化成亚油酸(Linoleic acid，LA.182Δ9，12n-6)，LA的碳链延长和脱氢则有两个不同的代谢方向n-6和n-3。LA是n-6和n-3系列不饱和脂肪酸的共同前体，并在此基础上经一系列的碳链延长和脱氢反应合成花生四烯酸(Arachidonic acid，AA.204Δ5，8，11，14n-6)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA.205Δ5，8，11，14，17n-3)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA.226Δ4，5，8，11，14，17n-3)等有生物活性的长链多不饱和脂肪酸(Long-chain polyunsaturated fatty acids，LC-PUFAs)。
脂肪酸脱氢酶催化与载体结合的脂肪酸在脂酰链上脱氢形成双键，脂肪酸脱氢酶在很多生物中普遍存在，对PUFAs的生物合成起着决定性的作用。脂肪酸脱氢酶可以分为三种1)脂酰ACP(Acyl-ACP)脂肪酸脱氢酶，这类酶只存在于微生物质体中，是一种可溶性的脱氢酶，它催化与脂酰载体蛋白(acyl carrier protein，ACP)结合的脂肪酸脱氢；2)脂酰CoA(Acyl-CoA)脂肪酸脱氢酶，这类酶属于膜整合酶，它催化与CoA结合的脂肪酸脱氢，目前发现主要存在于动物、酵母和真菌细胞中；3)脂酰脂(Acyl-lipid)脱氢酶，这类酶催化甘油脂中的脂肪酸脱氢，它也是一种膜整合酶，存在于微生物、真菌和蓝细菌中。膜整合的脂肪酸脱氢酶，它基本上以NADH细胞色素b5(cyt b5)氧化还原酶和Cytb5作为电子供体催化复合脂中的脂肪酸脱氢。氨基酸序列分析发现可溶性的脂肪酸脱氢酶只分布于微生物质体中，具有两个保守的离子结合序列(iron-bonding motif)[(D/E)X2H]，它包括Δ9-硬脂酰ACP脱氢酶、Δ4-软脂酰ACP脱氢酶、Δ6-软脂酰ACP脱氢酶和Δ9-豆蔻酰ACP脱氢酶等，脂酰ACP脱氢酶需要NADPH、铁氧还蛋白铁氧还蛋白氧还酶和分子氧共同完成催化功能。脂肪酸脱氢酶催化的脱氢反应是一个好氧的过程，它利用一分子氧，并将电子传递链中获得的电子还原。脂肪酸脱氢酶一般对于脂肪酸中存在的双键的位置、数目和立体化学性质是特异的。其中Δ9-脂肪酸脱氢酶催化硬脂酸9位形成油酸，是从饱和脂肪酸形成不饱和脂肪酸的第一个催化酶，是不饱和脂肪酸合成过程中的关键调节酶，因此对Δ9-脂肪酸脱氢酶的表达调控进行了深入的研究，目前已从多种生物体中克隆到Δ9-脂肪酸脱氢酶基因的启动予序列Gallus gallus(AJ297918)、Mus musculus(AX528731)、Homo sapiens(AX528729)、Sacchatomyces kluyveri(AB071696)、Sacchatomyces cerevisiae(U42698)、Amylomyces rouxii(AY995173)。高不饱和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acids，HUFA)如花生四烯酸(204n-6)和二十二碳六烯酸(DHA)不仅具有多种生理功能包括促进脑发育，心血管功能，炎症应答反应等，而且是构成生物膜磷脂的重要组成，起到细胞内信号传导和基因表达，细胞分化，调节脂代谢的功能[5-8]。Δ6-脂肪酸脱氢酶作用于生物体合成高不饱和脂肪酸的第一步催化反应将亚油酸转化为亚麻酸，是高不饱和脂肪酸合成过程的限速酶，因此受到多个水平的调节，虽然目前已从多种生物体内克隆到Δ6-脂肪酸脱氢酶基因序列，但对其启动子序列的克隆分析尚未见报道，所以其转录水平的调节有待于深入研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子序列及其应用。本发明在于转基因微生物中使其外源基因的表达，雅致枝霉中Δ6-脂肪酸脱氢酶的表达调控和菌丝体内γ-亚麻酸的含量调节。因此，本发明对改良转基因微生物品质来生产药用γ-亚麻酸和高不饱和脂肪酸非常有用。
本发明提供从雅致枝霉中分离的Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子核苷酸序列，具体讲是雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子核苷酸序列及其应用。将该启动子下游衔接其它外源基因，并与不同的表达载体连接，转化到微生物中，表达其下游基因的方法和应用。
本发明的目的是提供含有该启动子核苷酸序列与其它外源基因连接，构建功能性表达的表达载体。
本发明的另一个目的是提供含有该启动子核苷酸序列或该启动子核苷酸序列与其它外源基因连接的表达载体转化宿主细胞或宿主孢子及其后代。
本发明的另一个目的是提供一种用含有该启动子核苷酸序列或该启动子核苷酸序列与其它外源基因连接的表达载体转化宿主细胞或宿主孢子及其后代细胞，并以此来进行转基因微生物品质改良来生产药用γ-亚麻酸和高不饱和脂肪酸等。
本发明提供的雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子序列包括(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或(2)与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或(3)与(1)或(2)的核苷酸序列具有基本序列同源性的核苷酸序列；或(4)是(1)、(2)或(3)的核苷酸序列的类似物的核苷酸序列；或(5)与(1)、(2)、(3)或(4)的核苷酸序列，在杂交条件下杂交的核苷酸序列。
本发明的第二方面，提供了含有上述核苷酸序列与质粒载体所构建的重组表达载体。如表达载体pAJND6P1315。
本发明提供一种基因工程化的宿主细胞，它是选自1)用所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞；2)用所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞。所述的宿主细胞是微生物宿主细胞的后代、蛋白质组成已经改变的微生物细胞。所述的微生物是大肠杆菌或酿酒酵母。
所述的宿主细胞是酿酒酵母细胞。
本发明提供了一种用含有该启动子核苷酸序列或该启动子核苷酸序列与其它外源基因连接的表达载体转化的宿主细胞及其后代细胞来进行转基因微生物蛋白质组成改良来生产药用γ-亚麻酸和高不饱和脂肪酸等。
本发明所述的在微生物细胞中表达Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子的方法，包括下述步骤1)将含有上述核苷酸序列的表达载体载体导入微生物细胞。
2)使所述的微生物细胞生长形成菌体细胞。
本发明可用于生产人类食品、动物饲料、化妆品或药品。
本发明所述的雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子序列的分离方法包括下述步骤1)提取雅致枝霉总DNA。
2)设计并合成如下两条引物引物15′-TAAGTCGACGAATTCTTTCAAACAACAATTT-3′Sal I引物25′-CGAAGCTTCATTCTTTACTGGTAATTAATTAGTG-3′HindIII两个引物的5′端分别加入了限制性内切酶SalI位点和限制性内切酶HindIII位点。
3)以雅致枝霉总DNA为模板，进行PCR反应反应组分加入量缓冲液(10×)(含20mmol/L MgCl2) 5μldNTP(2.5mmol/L) 2μl引物1(1μmol/L) 2μl引物2(1μmol/L) 2μlTaq(5u/μl) 0.5μlH2O36.5μl模板DNA(0.1μg/μl) 2μl总体积 50μl扩增条件94℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃10min。
4)回收PCR片段，亚克隆到测序载体；再转化到大肠杆菌感受态细胞，在含氨苄青霉素，终浓度为50-100μg/ml的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒，经SalI和HindIII双酶切和PCR扩增鉴定阳性克隆。
5)对阳性克隆质粒进行测序，确证启动子片段。
本发明中所述的核苷酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入、倒位的核苷酸序列，即原始分离序列的人工突变体，它还具有它的启动子功能。还可以是所述的核苷酸序列与其它的启动子序列的融合序列。
本发明中所述的其它外源基因是指任何一段核苷酸序列，并具有编码某种蛋白质或其它活性物质功能的，包括RNA或DNA序列，该序列与Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子正常情况不相结合。此核苷酸序列包括不同于启动子的微生物种类得到的异源核苷酸序列，以及从相同于启动子的微生物种类得到的同源核苷酸序列，但这些序列与野生型(非转基因)微生物的启动子无关。
本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在微生物中进行表达的任何一种载体，例如pYES2.0、pPIC3.5K、pAJN161等。
本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入微生物细胞或微生物孢子的任何转化方法，如细胞电脉冲转化法等。
本发明中所述的宿主细胞或及其后代细胞是指所有微生物细胞或微生物孢子或由这些细胞或孢子繁殖的微生物体。
术语“核苷酸序列”指含有天然存在的碱基，糖和糖之间(支链)的键的核苷酸或核苷单体的序列。该序列也包括含有发挥相似功能的非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可也指基因组或合成的DNA，它们可以是单链或双链，代表有义。
术语“Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子”是指在启动子控制下表达的基因在有或没有基本表达的微生物细胞中优先表达。
术语“具有基本序列同源性的序列”是指与(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或(2)与(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列之中的序列相比有轻微的或无关紧要的序列变化的那些核苷酸序列，这些序列以基本相同的方式发挥作用并且能够驱动其下游基因的表达。这些变化可能是由于局部的突变或结构上的修饰。
术语“杂交的序列”是指可以在严格杂交条件下与所述的核苷酸序列(1)、(2)、(3)或(4)之中的序列杂交的核苷酸序列。“严格杂交条件”是指本领域技术人员已知的，或者可以在《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯编著，科学出版社，第二版，1993)中的通用方案中找到。
本发明克隆的雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因启动子是首次克隆到的雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因启动子，而且是这一启动子的Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子活性的功能验证。本发明在于转基因微生物中使其外源基因的表达，避免了外源基因在其它部位持续表达所带来的不利影响。因此，本发明对转基因微生物来生产药用蛋白非常有用。这一启动子的研究和开发，对今后转基因雅致枝霉、乃至所有转基因微生物具有重大应用前景。
图1Δ6-脂肪酸脱氢酶基因启动子D6P1315的电泳图启动子D6P1315的电泳图。
图2雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因启动子D6P1315序列。
图3微生物表达载体的构建流程图。
图4转基因大肠杆菌总蛋白电泳图。
图5转基因酿酒酵母生长图。
具体实施例方式
实施例1.雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因启动子序列(D6P1315)的分离雅致枝霉孢子接种于PDA液体培养基中，28℃振荡培养20h，抽滤取300mg幼嫩的菌丝用液氮研磨，用SDS-CTAB改进法提取总DNA，取5μl DNA样品，琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。
设计并合成如下两条引物，并且为以后的克隆和构建的需要，两个引物的5′端分别加入了限制性内切酶SalI位点和限制性内切酶HindIII位点引物15′-TAAGTCGACGAATTCTTTCAAACAACAATTT-3′SalI引物25′-CGAAGCTTCATTCTTTACTGGTAATTAATTAGTG-3′HindIII以雅致枝霉总DNA为模板，进行PCR反应，其反应体系如下反应组分加入量缓冲液(10×)(含20mmol/L MgCl2) 5μldNTP(2.5mmol/L) 2μl引物1(1μmol/L) 2μl引物2(1μmol/L) 2μlTaqase(5u/μl) 0.5μlH2O36.5μl模板DNA(0.1μg/μl) 2μl总体积 50μl扩增条件94℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃10min；电泳检测结果表明(如图1所示)，图1Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子1300电泳图。扩增得到大小约700bp的DNA片断。用UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)回收，把回收片段亚克隆到测序载体pGEM-T(Promega公司产品)中；连接产物转化到用CaCl2法处理的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素(终浓度为50～100μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素(终浓度为50～100μg/ml)的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook，et al.，1989，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold SpringHarbor Laboratory，New York，p19-21]提取质粒，经限制型内切酶HindII和SalI双酶切和PCR扩增鉴定阳性克隆，测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)，确i正pGETD6P含有D6P1315启动子片段，如图2所示。图2Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子。
实施例2微生物表达载体pAJND6P1315的构建构建流程如图3所示，图3微生物表达载体的构建流程图。
用碱裂解法提取以上pGETD6P质粒，经HindIII和SalI酶切后，释放出D6P1315启动子片断，与经过同样酶切的微生物表达载体pAJN161的大片段相连，然后将连接产物用CaCl2法转化到大肠杆菌DH5α，提取重组质粒pAJND6P1315，并进行PCR及酶切鉴定，确证pAJND6P1315含有D6P1315启动子片断。
实施例3pAJND6P1315在大肠杆菌中表达卡那霉素抗性基因重组质粒pAJND6P1315用CaCl2法转化到大肠杆菌DH5α，挑取单菌落接种于含有10μg/ml的LB培养基中37℃、200rpm振荡过夜培养，取1ml于1.5ml离心管中10000rpm离心1min，搜集菌体，并加入50μl裂解液，混匀于沸水浴种裂解10min，冷却取20μl进行SDS电泳。结果如图4所示。图4转基因大肠杆菌总蛋白电泳图，图4中1-4道为具有pAJND6P1315质粒的大肠杆菌DH5α总蛋白SDS电泳图，其中在小于31.0KD约为29.5KD处存在一条明显的电泳带，即为雅致枝霉的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因启动子表达下游卡那霉素抗性基因，转录生成的蛋白质电泳带。5道为大肠杆菌DH5α总蛋白SDS电泳图，6道为蛋白质分子量标记图。
实施例4pAJND6P1315电击介导的酿酒酵母转化及新霉素抗性表达将酿酒酵母菌株INVScl从甘油管中划线接种于YEPD平板上，30℃培养48h进行活化；挑取单菌落于5ml YEPD液体培养基中，30℃、250rpm振荡过夜培养；检测菌液的OD600值，取适量菌液稀释于50ml YEPD液体培养基中，使OD600＝0.4，继续培养2-4h；2500rpm离心沉淀细胞，去上清，加50ml提前冰浴的无菌水离心洗涤两次，冰浴的1mol/L山梨醇离心洗涤两次；2ml 1mol/L山梨醇重悬细胞重悬细胞，并以100μl/管分装，至于冰上尽快使用。在100μl感受态酵母细胞中加入10μg重组表达质粒p AJND6P1315轻柔混匀；设置MicroPulser到“ScaI”挡，参数为Voltage 2.0kV，Number of pulsesl；将质粒和酵母细胞混合液转入提前冰浴的0.2cm电击杯中，使液体尽量流到管底，至于电转化仪上进行电击；取下电击杯；立即加入1ml冰浴的1mol/L山梨醇并涂布于SC-Ura(无尿嘧啶)选择性固体培养基(含2％的葡萄糖)上，置30℃培养48h或直至转化子出现。将转化子分别接种于不含G418(新霉素)的YEPD培养基和含有400mg/L G418(新霉素)的YEPD培养基中，30℃培养48h，观察结果如图5所示。图5转基因酿酒酵母生长图，图5中A-1、，B-1为具有pAJN空质粒的INVSc1酿酒酵母，A-2、B-2为具有pAJND6P1315质粒的INVSc1酿酒酵母。图A培养基中未添加G418，图B培养基中加入G418(新霉素)。B图中B-1为INVSc1酿酒酵母不能生长，而带有pAJND6P1315质粒INVSc1酿酒酵母B-2可以生长，说明雅致枝霉的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因启动子序列启动表达下游G418新霉素抗性基因，转录生成的蛋白质使转基因INVSc1酿酒酵母能够在含有G418(新霉素)的培养基中生长。
由此可知，本发明所述的雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子确实具有在大肠杆菌和酿酒酵母中启动子活性。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>南开大学<120>雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子序列及其应用<130>20060216<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1315<212>DNA<213>雅致枝霉(Thamnidium elegans)<400>1gaattctttc aaacaacaat tttgcacgga aaaggatatt tgaggcaaga aggtttgtac 60atataaaagg gagtacagac aaggtctaat cgtatactct tttacatagc gaaaagatta120aagctaaaga cgacgtgttc aacagacatc atgtcaaaca aatatttaca aataagatag180caatgagtaa aaacgtgcct tgccacgtag gcaccttttc catggtgtaa attaaagaag240tccacaaaat cttaccttga ctaaataatt actttaattg tagagctata tcttttgtga300tcaattagct gacgacatat tgcctttcaa aaagaatgga gaagaaaatg aggaaaatga360ggaaatgaga agaaaatagc gatgagatca cattagaaga tatagttctt ttgatgaaaa420ggtaatgaaa agattggaat gaatgatata ttaaaccctt ttacgtagac aaaagagtat480tgaaccgata aracttcact acagtcactt atttataaac atttctcaag agaatactgg540gatgatttaa tcacttcggc attagctgat aatgtattat ccgaagaaag aagtgtttaa600
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1.一种从雅致枝霉中分离到的Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子序列，其特征在于它包括(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或(2)与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或(3)与(1)或(2)的核苷酸序列具有基本序列同源性的核苷酸序列；或(4)是(1)、(2)或(3)的核苷酸序列的类似物的核苷酸序列；或(5)与(1)、(2)、(3)或(4)的核苷酸序列，在杂交条件下杂交的核苷酸序列。
2.一种从雅致枝霉中分离到的Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子序列，其特征在于它是具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.一种重组表达载体，其特征在于它是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒载体所构建的重组表达载体。
4.按照权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于它是pAJND6P1315。
5.一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于它是选自1)用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞；2)用权利要求3所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞。
6.按照权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是微生物宿主细胞的后代或蛋白质组成已经改变的微生物细胞。
7.按照权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是酿酒酵母。
8.一种在微生物细胞中表达权利要求书1所述的Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子的方法，其特征在于它的步骤包括1)将权利要求书3所述的重组载体导入微生物细胞；2)使所述的微生物细胞生长形成菌体细胞。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于所述的微生物是大肠杆菌或酿酒酵母。
10.权利要求书1所述的雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶启动子序列的分离方法，其特征在于它包括下述步骤1)提取雅致枝霉总DNA；2)设计并合成如下两条引物引物15′-TAAGTCGACGAATTCTTTCAAACAACAATTT-3′Sal I引物25′-CGAAGCTTCATTCTTTACTGGTAATTAATTAGTG-3′HindIII两个引物的5端分别加入了限制性内切酶Sal I位点和限制性内切酶HindIII位点；3)以雅致枝霉总DNA为模板，进行PCR反应反应组分 加入量缓冲液(10×)(含20mmol/L MgCl2)5μldNTP(2.5mmol/L)2μl引物1(1μmol/L)2μl引物2(1μmol/L)2μlTaq(5u/μl)0.5μlH2O 36.5μl模板DNA(0.1μg/μl)2μl总体积 50μl扩增条件94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 2min，共30个循环；72℃ 10min；4)回收PCR片段，亚克隆到测序载体；再转化到大肠杆菌感受态细胞，在含氨苄青霉素，终浓度为50-100μg/ml的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒；经HindII和Sal I双酶切和PCR扩增鉴定阳性克隆；5)对阳性克隆进行测序，确证启动子片断。
全文摘要
本发明涉及一种从雅致枝霉中分离到的Δ
文档编号C12N15/63GK1810975SQ20061001319
公开日2006年8月2日 申请日期2006年2月21日 优先权日2006年2月21日
发明者李明春, 王德培, 魏东盛, 邢来君, 张颖慧, 孙伟 申请人:南开大学