专利名称：液体稳定的血清胆碱酯酶试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及血清胆碱酯酶测定试剂及其制法，用于血清胆碱酯酶的定量测定。
背景技术：
血清胆碱酯酶来源于肝脏。在急慢性肝炎、肝硬化、肝癌、低蛋白血症等情况下，活性下降，指示肝脏合成酶的功能受损。许多有机化合物抑制胆碱酯酶的活性，临床上常见于有机磷中毒，轻度情况下，可致胆碱酯酶活性下降30％；中度情况下，活性下降50％；重度情况下，活性下降可达70％。胆碱酯酶活力上升，散见于肾病综合症、甲状腺机能亢进、糖尿病等病症。血清胆碱酯酶的测定方法包括德国临床化学会推荐的方法，其原理是底物丁酰硫代胆碱被血清胆碱酯酶催化水解，生成乙酸和硫代胆碱，后者使黄色的高铁氰化钾瞬间还原，生成接近无色的亚铁氰化钾。该方法通过监测405nm处吸光度的下降速率计算出酶的活性。目前临床应用中常用的血清胆碱酯酶测定方法是5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)比色法或速率测定法，胆碱酯酶水解丁酰或丙酰硫代胆碱，生成硫代胆碱和乙酸。硫代胆碱与巯基显色剂5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)[DTNB，dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)]反应，生成黄色化合物5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNBA)。采用比色或连续监测405～415波长下吸光度的变化值计算出酶的活性。
由于丁酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱，以及5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)在常用的缓冲溶液中极不稳定，目前临床上常用的DTNB测定方法的试剂均为干粉或冻干品，以保证试剂在运输和应用过程中能够维持合格的有效底物浓度和较低的空白吸光度。但干粉或冻干品试剂，由于在使用前需进行复溶，增加了临床应用中的繁琐步骤，并且由于不同复溶水质的影响，带来了潜在的干扰因素。为了达到液体即用型试剂的要求，行业中有采用放弃反应pH要求，将反应pH降至6.0左右，以达到稳定反应底物和获得较低空白吸光度的目的。但采取这种方法，反应体系已远远偏离了胆碱酯酶最适的反应pH，不能准确测定出被测样本中酶的活力，并需要在计算时人为将试剂的因子数放大至3万以上，大大降低了测定的准确性，此外，临床应用中某些自动化分析仪无法采用如此巨大的因子数，限定了这类液体双试剂的使用。
在合理的液体双试剂(pH7.60左右)应用中，藤井隆行(日本专利平4-197199)发明了采用碘氧苯甲酸稳定丁酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱和5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的方法，但碘氧苯甲酸原料昂贵，不易获得，且几乎不溶于水，配制水溶液试剂困难，实际应用中采用该化合物很难配制出稳定的胆碱酯酶试剂。此外，许多发明者发明了一些新的水溶性稳定的胆碱酯酶底物，如美国专利6509003、4983756等，但采用这类底物缺乏广泛可接受的试剂方法和临床应用质控，底物原料没有商品化，很难开展临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，以解决胆碱酯酶试剂应用中存在的复溶或反应体系偏离胆碱酯酶最适反应pH值的问题。
本发明采取的技术方案是由试剂1和试剂2组成，其中试剂1包括用于调节反应pH值的缓冲液，该缓冲液的pH值范围是6.0～9.0，该缓冲液的浓度范围是每升10～200mM；防腐剂苯酚，浓度范围是每升0.1mM到饱和溶液；试剂2包括酸性缓冲液，该缓冲液的pH值范围是3.0～6.0，该缓冲液的浓度范围是每升2～100mM；稳定剂苯酚，浓度范围是每升0.1mM到饱和溶液；巯基显色剂5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，浓度范围是每升0.1～10mM；底物，丁酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱，浓度范围是每升2～200mM；试剂1与试剂2的比例关系是在试剂2中加入试剂1后，使该工作试剂pH值是6.0～8.0。
试剂1中用于调节反应pH值的缓冲液，可以是磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或Good′s缓冲液。
本发明一个实施方案中试剂1中用于调节反应pH值的缓冲液是磷酸盐缓冲液，该缓冲液的浓度范围是每升30～80mM。
本发明一个实施方案中试剂2包括酸性缓冲液，该缓冲溶液包括柠檬酸缓冲液、酒石酸缓冲液、马来酸缓冲液、乙酸缓冲液、甘氨酸缓冲液，该缓冲溶液的pH范围在4.0～6.0之间，该缓冲液的浓度范围是每升5～100mM。
本发明一个实施方案中试剂2的酸性缓冲液是乙酸缓冲液，该缓冲溶液的pH范围在4.0～5.0之间，该缓冲液的浓度范围是每升10～80mM。
本发明一个实施方案中试剂1中防腐剂苯酚的浓度范围是每升1～50mM。
本发明一个实施方案中试剂2中稳定剂苯酚的浓度范围是每升1～50mM。
本发明一个实施方案中试剂2中底物为丁酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱，浓度范围是每升10～50mM。
本发明一个实施方案中试剂2中巯基显色剂5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，浓度范围是每升1～3mM。
本发明一个实施方案中试剂1与试剂2的比例关系是在试剂2中加入试剂1后，使该工作试剂pH值是7.4～7.8。
通过大量的实验，我们发现，在酸性溶液中加入苯酚，可以长时间高温稳定含有丁酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱和5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的试剂溶液，该试剂溶液与磷酸盐缓冲液配合，可以配制为测定胆碱酯酶活力的稳定试剂。本发明中采用的苯酚，不仅作为稳定剂，还作为试剂的防腐剂使用。实验证明，加入叠氮钠作为防腐剂，会加大试剂的空白吸光度变化率，增加速率法测定时的非特异性干扰。苯酚作为稳定剂使用时，应加入到含有丁酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱和5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的试剂溶液中，作为防腐剂使用时，可以加入到磷酸盐缓冲溶液中。本发明中苯酚的用量范围一般为每升0.10毫摩尔(mM)到饱和溶液，较好的苯酚浓度范围为每升0.50～100毫摩尔(mM)，最好的苯酚浓度范围为每升1～50mM。苯酚浓度低于每升0.10mM时，稳定底物的作用较弱，苯酚浓度过高，配制的试剂有强烈的苯酚气味，试剂容易分层。
稳定的含有丁酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱和5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的酸性试剂溶液是酸性缓冲液，pH值在3.0～6.0之间，可用的缓冲溶液包括柠檬酸缓冲液、酒石酸缓冲液、马来酸缓冲液、乙酸缓冲液、甘氨酸缓冲液等。最适的pH范围在4.0～6.0之间，当pH低于3.0，5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)很难溶解，pH高于6.0，底物稳定性下降。缓冲液浓度一般在每升2～100mM之间，较好的缓冲液浓度在每升5～100mM之间，最适缓冲液浓度在每升10～80mM之间。配制时，先调整溶液pH值至5.0左右，然后溶解5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，完全溶解后，加入丁酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱。丁酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱的浓度在每升2～200mM之间，较好的底物浓度在每升5～100mM之间，最佳的底物浓度在每升10～50mM之间。5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的可用浓度在每升0.1～10mM，较好的巯基显色剂浓度在每升0.5～5mM之间，最佳的巯基显色剂浓度在每升1～3mM之间。上述浓度范围均为含有丁酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱和5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的混合试剂溶液浓度，不是最终工作试剂中浓度。
测定血清胆碱酯酶试剂除上述底物和巯基显色剂溶液以外，还需要调节反应pH的缓冲液，常用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、Good′s缓冲液等，以磷酸盐缓冲液最好。pH范围在6.0～9.0之间，调节后的工作试剂最适反应pH应在7.40～7.80之间，此pH范围为胆碱酯酶最适催化活性的pH，试剂的空白吸光度变化率小于30个酶单位。磷酸盐缓冲液的浓度范围可以在每升10～200mM之间，较好的浓度范围在每升20～100mM之间，最适浓度范围在每升30～80mM之间。调节的工作试剂反应pH并不局限于上述范围，如可以将工作试剂的反应pH降低到6.0左右，此时，试剂的空白吸光度变化率降低，但反应速率严重下降，需要人为调节计算因子。
本发明公开的完整的血清胆碱酯酶测定试剂包括试剂1和试剂2，试剂1的作用是调节工作试剂反应pH值，试剂2是稳定的酶底物和巯基显色剂溶液，与试剂一起形成完整的测定试剂。实验证明，试剂1和试剂2分别放置37℃7天、10天、14天，底物浓度、巯基显色剂和试剂性能没有明显的跌落，试剂测定的准确度和精密度没有任何影响。
本发明优点及有益效果是，通过在试剂成分中加入非反应性稳定剂，维持乙酰硫代胆碱、或丁酰硫代胆碱、或丙酰硫代胆碱与二硫代双硝基苯甲酸的有效反应浓度和有效试剂性能，从而达到在配制、生产和随后的应用过程中，成为即用型液体，使反应测定pH值在7.40～7.80之间。
采用本方法制备的测定试剂具有方便、快捷、自动化等特点。
本发明同时公开了一种创新的胆碱酯酶配制试剂，该试剂为液体即用型双试剂，无须进行使用前复溶，避免了复溶水质干扰的潜在因素。
本发明同时公开了一种胆碱酯酶液体即用型双试剂，该试剂的测定因子为理论因子或接近理论因子，由于该测定因子数小于10000，大大提高了测定的准确性，并可广泛应用于临床自动化分析仪。
具体实施例以下浓度为每升毫摩尔。
实施例1工作试剂为pH为7.70，试剂2底物浓度为15mM。
试剂1试剂组分浓度磷酸盐缓冲液pH8.1 31.25mM苯酚2mM试剂2试剂组分浓度乙酸缓冲液pH4.7520mM苯酚3mM5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 1.31mM丁酰硫代胆碱15mM试剂1和试剂2分别放置37℃14天，底物浓度、巯基显色剂和试剂性能没有明显的跌落，试剂测定的准确度和精密度没有任何影响。用于试剂测定计算的因子数在7000～8000之间。
实施例2工作试剂为pH为7.60，试剂2底物为丙酰硫代胆碱，浓度为25mM。
试剂1试剂组分 浓度磷酸盐缓冲液pH8.0 31.25mM苯酚 2mM试剂2试剂组分 浓度乙酸缓冲液pH4.520mM苯酚 5mM5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 1.31mM丙酰硫代胆碱 25mM试剂1和试剂2分别放置37℃ 14天，底物浓度、巯基显色剂和试剂性能没有明显的跌落，试剂测定的准确度和精密度没有任何影响。用于试剂测定计算的因子数为7000～8000。
实施例3试剂1为Tris缓冲液，工作试剂pH7.60～7.80，试剂2与实施例1相同试剂组分 浓度Tris缓冲液pH7.80 35mM苯酚 2mM试剂1和试剂2分别放置37℃ 14天，底物浓度、巯基显色剂和试剂性能没有明显的跌落，试剂测定的准确度和精密度没有任何影响。用于试剂测定计算的因子数为7000～8000。
实施例4试剂1为Good′s缓冲液中的2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]-乙烷磺酸缓冲液，即HEPES缓冲液，工作试剂pH6.8～8.0试剂1试剂组分 浓度2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]-乙烷磺酸缓冲液pH9.0200mM苯酚 50mM试剂2试剂组分 浓度乙酸缓冲液pH3.0100mM苯酚 50mM5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 3.5mM丁酰硫代胆碱 5mM试剂1和试剂2分别放置37℃ 14天，底物浓度、巯基显色剂和试剂性能没有明显的跌落，试剂测定的准确度和精密度没有任何影响。用于试剂测定计算的因子数为7000～8000。
实施例5工作试剂pH为6.0，试剂2底物浓度为25mM。
试剂1试剂组分 浓度磷酸盐缓冲液pH6.0 31.25mM苯酚 0.1mM试剂2试剂组分 浓度乙酸缓冲液pH4.75 20mM苯酚 0.1mM5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 1.31mM丁酰硫代胆碱 25mM试剂1和试剂2分别放置37℃14天，底物浓度、巯基显色剂和试剂性能没有明显的跌落，试剂测定的准确度和精密度没有任何影响。由于反应pH较低，反应速率下降，用于试剂测定计算的因子数为17000～18000。
实施例6试剂2为柠檬酸缓冲液，工作试剂pH为6.0。
试剂1试剂组分 浓度磷酸盐缓冲液pH7.0 100mM苯酚 2mM试剂组分 最适浓度柠檬酸缓冲液pH5.0 45mM苯酚 5mM5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 0.5mM丁酰硫代胆碱 150mM试剂1和试剂2分别放置37℃14天，底物浓度、巯基显色剂和试剂性能没有明显的跌落，试剂测定的准确度和精密度没有任何影响。由于反应pH较低，反应速率下降，用于试剂测定计算的因子数为17000～18000。
实施例7试剂2为酒石酸缓冲液，工作试剂pH为6.0。
试剂1试剂组分 浓度磷酸盐缓冲液pH6.0 120mM苯酚 1mM试剂组分 浓度酒石酸缓冲液pH6.0 60mM苯酚 5mM5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 10mM丁酰硫代胆碱 2mM试剂1和试剂2分别放置37℃ 14天，底物浓度、巯基显色剂和试剂性能没有明显的跌落，试剂测定的准确度和精密度没有任何影响。由于反应pH较低，反应速率下降，用于试剂测定计算的因子数为17000～18000。
实施例8试剂2为马来酸缓冲液，工作试剂pH为6.0～8.0。
试剂1试剂组分 浓度磷酸盐缓冲液pH7.5 30mM苯酚 饱和试剂组分 浓度马来酸缓冲液pH5.1 18mM苯酚 5mM5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 8mM丁酰硫代胆碱 3mM试剂1和试剂2分别放置37℃ 14天，底物浓度、巯基显色剂和试剂性能没有明显的跌落，试剂测定的准确度和精密度没有任何影响。由于反应pH较低，反应速率下降，用于试剂测定计算的因子数为17000～18000。
实施例9底物为丙酰硫代胆碱，工作试剂pH为6.0～8.0。
试剂1试剂组分 浓度磷酸盐缓冲液pH8.5 40mM苯酚 1mM试剂2试剂组分 浓度甘氨酸缓冲液pH4.0 20mM苯酚 饱和5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 0.1mM丙酰硫代胆碱 200mM
试剂1和试剂2分别放置37℃14天，底物浓度、巯基显色剂和试剂性能没有明显的跌落，试剂测定的准确度和精密度没有任何影响。由于反应pH较低，反应速率下降，用于试剂测定计算的因子数为17000～18000。
上述实施例1～实施例9配制完成后，其应用方法与相关领域中试剂的应用方法相同，在此不再赘述。
上述实施例1～实施例9试剂的配方和配制方法仅用于说明本发明的原理及其应用，本发明绝不局限于上述举例的应用范围；在本发明相关领域中的技术人员可以根据本发明的原理和方法配制出与之类似的各种测定试剂，但并不脱离出本发明的原理和应用范围。
权利要求
1.一种液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在于由试剂1和试剂2组成，其中试剂1包括用于调节反应pH值的缓冲液，该缓冲液的pH值范围是6.0～9.0，该缓冲液的浓度范围是每升10～200mM；防腐剂苯酚，浓度范围是每升0.1mM到饱和溶液；试剂2包括酸性缓冲液，该缓冲液的pH值范围是3.0～6.0，该缓冲液的浓度范围是每升2～100mM；稳定剂苯酚，浓度范围是每升0.1mM到饱和溶液；巯基显色剂5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，浓度范围是每升0.1～10mM；底物，丁酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱，浓度范围是每升2～200mM；试剂1与试剂2的比例关系是在试剂2中加入试剂1后，使该工作试剂pH值是6.0～8.0。
2.根据权利要求1所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在于试剂1中用于调节反应pH值的缓冲液，可以是磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或Good′s缓冲液。
3.根据权利要求2所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在于试剂1中用于调节反应pH值的缓冲液是磷酸盐缓冲液，该缓冲液的浓度范围是每升30～80mM。
4.根据权利要求1所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在于试剂2包括酸性缓冲液，该缓冲溶液包括柠檬酸缓冲液、酒石酸缓冲液、马来酸缓冲液、乙酸缓冲液、甘氨酸缓冲液，该缓冲溶液的pH范围在4.0～6.0之间，该缓冲液的浓度范围是每升5～100mM。
5.根据权利要求4所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在于试剂2的酸性缓冲液是乙酸缓冲液，该缓冲溶液的pH范围在4.0～5.0之间，该缓冲液的浓度范围是每升10～80mM。
6.根据权利要求1所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在于试剂1中防腐剂苯酚的浓度范围是每升1～50mM。
7.根据权利要求1所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在于试剂2中稳定剂苯酚的浓度范围是每升1～50mM。
8.根据权利要求1所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在于试剂2中底物为丁酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱，浓度范围是每升10～50mM。
9.根据权利要求1所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在于试剂2中巯基显色剂5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，浓度范围是每升1～3mM。
10.根据权利要求1所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在于试剂1与试剂2的比例关系是在试剂2中加入试剂1后，使该工作试剂pH值是7.4～7.8。
全文摘要
本发明涉及一种液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，用于体外定量测定人血清或其他体液中胆碱酯酶的活力。由试剂1和试剂2组成，通过在试剂中加入非反应性稳定剂，维持丁酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱与二硫代双硝基苯甲酸的有效反应浓度和有效试剂性能，从而达到在配制、生产和随后的应用过程中，本发明所采用的制备技术及根据此技术配制的测定试剂均为即用型液体，反应测定pH值最佳在7.40～7.80之间，采用本方法制备的测定试剂具有方便、快捷、自动化等特点。大大提高了测定的准确性，并可广泛应用于临床自动化分析仪。
文档编号C12Q1/46GK1811393SQ20061001656
公开日2006年8月2日 申请日期2006年1月25日 优先权日2006年1月25日
发明者王学忠, 顾小丰 申请人:长春迪瑞实业有限公司