专利名称：鹅精液冷冻稀释液试剂盒及使用方法
技术领域：
本发明属于动物繁殖技术领域。
背景技术：
精液冷冻保存是人工授精技术的一项重大革新。它解决了精液长期保存的问题，使精液不受时间、地域和种畜生命的限制，可充分利用良种最佳阶段的遗传性能，极大限度的发挥和提高优良种公鹅的利用率，大大提高遗传进展，加速品种的育成和改良步伐。同时，对优良种公鹅在短期进行后裔测定，保留和恢复某一品种或个体公鹅的优秀特性，以及在进行血统更新、引种、减低生产成本和品种资源保护等方面都具有重要意义和应用价值。
近50多年来，国内外学者及动物繁殖技术研究者对家畜、家禽的精液冷冻保存和人工授精技术进行了大量的研究。尤其，自1949年英国Polge等发现甘油(丙三醇)对牛精子具有抗冻保护作用后，该技术研究与应用取得了飞速的发展，尤其在乳牛上的应用效果已同鲜精无明显差异。因此国内外畜牧工作者已相继在牛、羊、马、猪、鸡、鹅、鸭、火鸡等种畜禽上开展了精液冷冻保存的研究，均取得了重大进展和显著效果。在家禽(鹅、鸡、鸭、火鸡等)主要从如下几方面进行了大量研究一、精液冷冻保护剂的筛选目前鸡精液冷冻保护剂主要有甘油、DMSO(二甲亚砜)、DMA(N，N-二甲基乙酰胺)以及EG(乙二醇)等。1951年Polge及同事在偶然的试验中发现了甘油对鸡精子的冷冻保护作用，这在鸡精液冷冻上具有划时代的意义。在此之前有关鸡精液冷冻的所有试验都未能成功，此主要是由于，一方面在稀释液中加入的甘油(鸡精液冷冻时的甘油浓度多为6-8％)可提高精子抗冻能力，Watanabe等(1980)报道甘油浓度7％的鸡冷冻精液在5℃和37℃解冻的能冻性为65.8％~81.7％；但另一方面其对精子也有一定的毒害作用(即抗受精作用)。Hammerestedt和Graham(1992)指出，鸡精液冷冻中甘油的作用是主要有①影响精子细胞浆的物理状况(如胞浆的组成成分和黏度)；②改变精子细胞膜的渗透性及稳定性；③与精子表面的膜蛋白以非共价键的形式结合。在精液的冷冻过程中，甘油通过上述三种方式影响精子的代谢和生物能的平衡。
对于EG的研究，Hubner等(1988)用乙二醇(Ethylene Glyc01)和DMA作低温保护剂冷冻鸡精液，获得55％-64％受精率。王红军等(1998)也报道，以一定比例的DMA和EG混合作为冷冻保护剂取得了较好的精液效果，其中以1∶1的比例混合，最终浓度以8％作为冷冻保护剂，解冻后畸形精子比例最少。而DMSO做冷冻保护剂，在冷冻过程中对精子形态的损害比较小，但对冷冻保护效果的报道结论不一。Sexton等(1978)比较了4％DMSo和8％甘油的冷冻保护效果，结果表明，4％DMSO的冷冻保护效果明显优于8％的甘油；而据Mitchell(1976)的研究结果，DMSO几乎没有冷冻保护作用。
DMA作为冷冻保护剂在鸡精液冷冻中应用在20世纪80年代末和90年代初就有成功的报道。Lake(1988)报道，稀释液中加入1.0M的DMA后冷冻而成的鸡精液，解冻后输精，受精率为76％；Schramm(1991)报道，以DMA做鸡精液冷冻保护剂，解冻后给53~57周龄的来航鸡输精，受精率可达90％。李世英等(1995)的研究结果表明，对于防冻保护剂的选择，甘油、DMSO都有保护作用，但以DMA防冻效果较好。可在-80℃~-100℃低温下冷冻或液氮中直接滴冻都能获得满意结果；但本发明的申请人徐日福等(1997)的试验表明，甘油、DMSO、DMA、EG对精子的存活都会产生较显著的毒害作用(P＜0.05)，其中以DMA的毒性最小，乙二醇和DMSO次之。可见，筛选出高效、无毒的、优良冷冻保护剂是种公鹅精液冷冻的重要环节之一。
二、冷冻保存技术工艺精液冷冻前的平衡过程和冷冻速率是影响冷冻精液受精率的关键因素。Brown等(1963)、Sexton(1978)分别采用甘油、DMSO做冷冻保护剂，发现不同的平衡时间对保护效果不同；由此可见，精液冷冻前适当的平衡时间有利于精液的保存效果。关于鸡精液冷冻速率的研究发现，慢速冷冻取得较满意的结果，Sexton(1980)试验发现，以1℃/分钟速率将鸡精液从5℃降温到-20℃(第一步)，然后放在液氮蒸汽中(第二步)，以3℃/分钟降温到-80℃时，投入液氮中，可获得较高的受精率；Lake(1978)主张精液以1℃/分的速率冷却到-35℃，用灵敏的程控冷冻器在-35℃保持5分钟后放进液氮罐里贮存，Bacon等(1986)将精液以3℃/分的速率冷却到-35℃浸入液氮，两者都获得较理想的冷冻效果。Nobom等(1991)介绍了一种简易快速的鸡精液冷冻方法将新鲜精液用冷的glutamate-raffinose HEPES 9R.H液进行1∶2稀释；稀释后即分装到0.25mL的牛冷冻细管中，每管装0.15mL，经封口后，在液氮上方1~2cm处的蒸汽中停1分钟。然后放进液氮保存。经输精效果测定，5％DMSO组冻精的受精率可达58％。
目前鸡精液的冷冻技术主要采用Bellagamba(1993)的方法用于冰(-79℃)和液氮(-196℃)，以1~10℃/分钟速率降温，以50-70℃/分钟速率解冻。精液冻结期间的关键时刻是从液态转变为固态(-5℃~-15℃)的时候。以较低速(1-18℃/分钟)通过这一过渡期，并加快-15℃以下的降速，效果较好。
三、冷冻精液解冻方法家禽冷冻精液的解冻方法主要有两种即低温(0-5℃)慢速解冻和高温(高于50℃)快速解冻，一般高温快速解冻的效果优于低温慢速解冻。关于解冻温度，李世英等(1995)报道，鸡冻精的解冻温度以50~60℃最为适宜，50℃以下解冻时间长，不利于快速通过危险温度区；60℃)./上温度太高，不易掌握。刘振发(2003)等报道粒状精液的解冻步骤是将0.4mL的速保精溶液装入玻璃小瓶，置于60℃恒温水槽中1~2分钟后取出，再将冷冻小瓶内的粒状精液迅速倒入玻璃小瓶混合，随即将解冻后的精液置于冰块间供人工授精之用。
四、冷冻保存效果与评价关于精液冷冻保存的研究，在家禽中以鸡最早，Shaffner等人于1941年鸡精子冷冻首次获得成功，此后许多研究者开展了鸡精液冷冻方面的试验，试验通过鸡精液稀释液，冷冻保护剂，冷冻速率，解冻及输精方法等的研究逐步使这项技术趋于完善。Ohara等(1990)、Schramm(1991)先后报道，用冷冻精液输精的受精率都不同程度地高于鸡自然交配的受精率(85％)。但根据许多采用鸡冷冻精液输精效果的报道(Watanabe et al，1985；Sexton，1981；Wishart，1985；Wishart，1985；Lake，1986)，冷冻精液的受精率均低于新鲜精液。尽管Tselutin等(1995)分别对鹅、鸭及火鸡进行了精液冷冻保存的试验。火鸡精液的冷冻将火鸡精液进行3倍稀释，稀释后的精液以0.6~0.8℃/分钟速率降到-2~-3℃；每份精液再添加0.16mLDMA，混匀后放在液氮蒸汽上再降到-2~-3℃，这些降了温的精液用移液管滴入液氮(每滴0.05~0.07mL)，每隔一周输精1次，输精量为0.15~0.07mL/只，受精率达80~90％。但该方法通常在实验室进行，不适宜农场中的大量推广。
对鸭精液冷冻方法将装有已稀释的鸭精液(比例为0.25mL精液1mL稀释液)的青霉素瓶放在冰箱里(2~4℃)30~40分钟，加入5％的DMA，放进-75℃~-80℃程序冷冻器(cryostat)里4分钟，最后投进液氮。解冻是在65℃的水中进行；7天中输精两次，输精量为0.15-0.20mL/只，受精率达69％-90％。韩雪峰等(2003)的研究结果发现，10％DMSO做鸭精液的冷冻保护剂冻后活力最高(达0.7以上)，经小群输精、孵化测定，受精率达65％；平衡时间10min、解冻温度40℃时，鸭精子冻后活力最好(平均为0.69和0.71)。
鹅精液冷冻将精液1∶3稀释，稀释液的温度为18-20℃，取稀释后的精液2-4mL在2-4℃的冰箱内放置40分钟，再添加4％DMA。进行颗粒冷冻，在氟塑料盘中预冷到-180℃，再投入液氮里保存。制成的颗粒冻精放在60-70℃水中的青霉素药瓶里解冻。每5天输精1次(输精量为0.2mL/只)，受精率达81％-90％。Mitchell(1997)等和Ansah以及Bacldand(1983)估测了鸡冷冻精子液的遗传力，证明了精子抗冻能力的遗传性；Lake(1981)认为可根据精子抗冻能力选择公鸡。韩雪峰等(2003)也发现，公鸭的精子抗冻性存在极显著差异(P＜0.01)，因此应对公鸭精子抗冻性状进行选择，以培育精子耐冻性强的品系提高冷冻精液的受精率。我国也先后开展了相关的研究，但至今，尚没有冷冻精液在家禽生产中应用的报道。可见，目前国内外在(公)鹅精液冷冻保护试剂盒的研制和应用上仍是空白。
综合以上的国内外研究资料不难发现，有许多精液冷冻效果不稳定，甚至较差，此主要是在现有的精液冷冻技术方法上仍存在如下4个方面的不足或缺陷(1)精液冷冻基础稀释液的配方组成是最重要的环节之一，但在有关报道中很少详细介绍稀释液的组成成分，仅仅提到一些主要组分而已，而无详尽的配方资料可以参考。在基础稀释液的配方及配伍上缺乏筛选。
(2)在冷冻保护剂的选择和使用浓度上没有预先进行毒力性实验，带有一定的盲目性。
(3)在基础稀释液和冷冻保护剂的配伍和配比方面缺乏实验依据。
(4)有些冷冻程序或技术工艺不合理，操作方法过于复杂、不方便使用。如冷冻平衡时间、平衡温度以及冷冻必须进行特异性测试；再如所要求的低温(5℃)离心及渗析等，在生产上应用，可行性就受到影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种保存精子活力高、保存时间长、使用简便地鹅精液冷冻稀释液试剂盒及使用方法。
本发明的技术方案是试剂盒共包括如下四种组分组分I谷氨酸钠0.4-0.6、磷酸二氢钾1.4-2.2、磷酸氢二钾0.2-0.5、半胱胺酸0.006-0.01、果糖0.9-1.2、肌醇0.04-0.08、棉子糖0.5-0.8、青霉素钠8-12、硫酸链霉素0.07-0.15、氯化钙0.01-0.02、三羧甲基氨基甲烷0.1-0.3。
组分II双蒸水100。
组分III硫酸鱼精蛋白0.04-0.06g。
组分IV二甲基乙酰胺(DMA)4.5-5.5、乙二醇4.5-5.5ml。
以上各成分为重量单位，青霉素钠为万单位。
本发明的使用方法是I、第一步稀释精液采集后，置于30℃的水温中，用同温的不含冷冻保护剂的稀释液进行第一步1∶1稀释后，用棉花包好，放在5℃的冰箱中平衡2小时。
II、第二步稀释第一步稀释后，再用相同温度的含冷冻保护剂的稀释液进行第二步稀释，并继续保存15~30min后进行滴冻。滴冻时所用吸管及其它玻璃器皿，都要在5℃下充分平衡后方可进行操作。
III、滴冻在盛有液氮的广口液氮罐中，使铜纱网距液氮面高度保持1～2cm。待铜纱网充分冷却后，开始滴冻。每毫升稀释后的精液约滴十粒。滴冻后加盖3分钟，于液氮保存。采用干解冻法进行解冻。精液颗粒解冻时，在40℃的恒温下解冻。
本发明的有益效果是(1)对基础营养稀释粉的配方进行了改进，同时添加了很少被人们使用的三羧甲基氨基甲烷和硫酸鱼精蛋白等成分，并进行了准确量化。
(2)冷冻保护剂同时选用了低毒性的双冷冻剂，按9-11％的浓度进行配合。
(3)首次对鹅精液冷冻稀释液各组成成分按试剂盒的包装形式进行配制。使用方便，操作简单。
(4)本试剂盒的使用配套有优化的“二步法”精液冷冻工艺程序和精液冷冻颗粒解冻方法，提高了试剂盒的使用效果。
具体实施例方式
工艺条件主要器材冰箱、液氮罐，OLYPUS恒温台付倒立相差显微镜、恒温水浴锅、温度计、采精杯、输精管和保温杯、血球计数板，计数器等。
药品与试液甘油，乙二醇，二甲基亚B((DMSO)，N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、青、链霉素等；A液(含谷氨酸钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，果糖，Tris等)；B液(含谷氨酸钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，葡萄糖，肌醇，棉子糖等)，以上各种试剂成分均从商业上获得。
1、鹅精液冷冻基础营养稀释粉配方的筛选以吉林白鹅父母代为试验材料，随机取260日龄的吉林白鹅、皖西白鹅父母代种公鸡各90只，从中各选10只健康、精液品质好的公鹅供采精用。采用不同配方的基础营养稀释液，对不同品种鹅的精液进行稀释，以甘油为冷冻保护剂，将精液按已优化的冷冻步骤进行冷冻保存试验，通过试验效果，筛选最佳稀释液配方。每个配方重复试验3次。
(1)不同配方成分的基础营养稀释粉的配置其中包括两个系列、不同配置、配比的基础营养稀释粉，共有12个不同的配方(每个系列各6个配方)，分别以100ml双蒸水稀释成基础稀释液。这12个配方分别由A和B两个系列构成，其配方的主要成分为A系列(含谷氨酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、果糖、Tris等)；B系列(含谷氨酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、葡萄糖、肌醇、棉子糖等)。
(2)精液采集采用背部按摩法采集公鹅精液。采集过程中要求精液无粪便、血液和饲料等污染。采集后用棉花包好，置于保温杯中，迅速带回实验室，待处理。
(3)精液冷冻步骤精液采集后，置于30℃的水温中，用同温的不含冷冻保护剂的稀释液进行第一步1∶1稀释后，用棉花包好，放在5℃的水箱中平衡2小时左右，再用相同温度的含冷冻保护剂的稀释液进行第二步稀释。在冷冻箱中加入液氮，使铜纱网距液氮面高度保持1～2cm。待铜纱网充分冷却后，开始滴冻。每毫升精液约滴十粒。滴冻后加盖3分钟，于液氮保存。数分钟后用干解冻法进行解冻。30℃下观察精子活力。冷冻时所用吸管及其他玻璃器皿，都要在5℃下充分平衡后方可进行操作。
(4)活力检查以全部精子呈直线运动，定为1.0，50％的精子直线运动其活力定为0.5，10％的精子呈直线运动其活力为0.1，依次类推。
2、精液冷冻保护剂的筛选与浓度确定本实验以吉林白鹅父母代为材料，以甘油、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)为主要冷冻保护剂进行冷冻保护剂毒性检验。从中筛选出毒性最小、冷冻保护剂冷冻效果最好的保护剂及其最佳浓度。
(1)冷冻保护剂毒性实验取300日龄吉林白鹅父母代种公鹅80只，从中选10只健康、精液品质好的公鹅供采精用。经实验筛选出的冷冻效果较好的两种稀释液(A、B液)中，分别加入一定浓度的甘油、乙二醇、DMA和DMSO，配成8种冷冻保护液(A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8)。采集的精液分为8组，在相同温度下分别用8种冷冻保护液进行1∶2稀释。以不加冷冻保护剂的鲜精液作为对照。稀释后检查精子活力，然后在20℃下保存，每隔两小时观察一次活力，直到精干全部死亡为止。记录各次活力。计算精于生存指数。8种冷冻保护液分别为A1(A+乙二醇)、A2(A+甘油)、A3(A+DMA)、A4(A+DMSO)、A5(B+乙二醇)、A6(B+甘油)、A7(B+DMA)、A8(B+DMSO)。
(2)几种不同的冷冻保护剂冷冻效果的比较以A、B液为基础液，依次分别在其中加入相同浓度的甘油、乙二醇、DMA、DMSO组成8种冷冻保护液，将精液按冷冻步骤进行冷冻，解冻后观察精子活力。重复5次，比较各冷冻保护剂效果的优劣。
(3)A、B基础液中冷冻保护剂最佳浓度的确定A液中分别加入2％、4％、6％、8％、9％、10％、11％和12％的DMA配成冷冻保护液；以A液作为基础液，添加不同比例的混合冷冻保护剂C1(含甘油+乙二醇，1∶1)，C2(含乙二醇+DMA，1∶1)，C3(含DMA)；以B液作稀释液时，仅以DMA和乙二醇作冷冻保扩剂，分为四组，其中D0含10％的DMA，D1含乙二醇和DMA，配比1∶1，浓度10％，D2含8％的乙二醇和DMA进行配合，D3含10％的乙二醇和DMA，混合比为2∶2。分别配制成冷冻保护液，对精液进行冷冻，解冻后观察精子活力，比较不同浓度的冷冻保护剂对精液冷冻的保护效果，确定A、B液中最佳的冷冻保护剂浓度。重复3次。
3、精液冷冻保护稀释液配方的优化取300日龄吉林白鹅父母代种公鹅80只，从中选10只健康、精液品质好的公鹅供采精用。本实验力求在简单、可行的条件下，进行硫酸鱼精蛋白和谷氨酰胺对鸡精液冷冻效果作用的试验研究，旨在为改进现有的稀释液配方，提高冻精的精子活力，为获得较高的、稳定的受精率和孵化率提供参考数据。
(1)硫酸鱼精蛋白对精液冷冻的作用分别在上述试验中已筛选出的A0、B0两种最佳冷冻保护液中分别加入0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10克的硫酸鱼精蛋白进行冷冻(E1、E2、……、E7和F1、F2、……、F7共14个组)，以A0及B0作对照，进行冷冻，解冻后观察精子活力，重复3次。
(2)谷氨酰胺对精液冷冻的作用分别在上述A0、B0两种最佳冷冻保护液中分别加入一定剂量的谷氨酰胺进行冷冻(G1、G2、G3、G4、G5和H1、H2、H3、H4、H5共10个组)，以A0及B0作对照，进行冷冻，解冻后观察精子活力，重复3次。
4、精液冷冻条件的优化在上述有关试验的基础上，从确定精液冷冻最佳时间和解冻温度入手，摸索最佳冷冻方法，优化冷冻程序，旨在改进鸡精液保存技术，以获得较高、较稳定的受精率。
(1)精液稀释后最佳作用时间的确定精液采集后用不含冷冻保护剂的A液进行第1步稀释(1∶1)，用棉花包好后，放在5℃的冰箱中平衡2h后，进行第2步稀释，稀释后5、10、15、30、60、120min后(分别为M1、M2、MA3、M4、M5、M6组)进行滴冻，观察解冻后精子活力，确定2次稀释至冷冻之间的最佳时间，即冷冻保护剂与精子作用的最佳时间，重复4次。
(2)不同解冻温度对精子活力的影响冷冻后的同一组的精液颗粒分别在5、10、20、30、37、40、50、60、65、70℃温度下(定为N1、N2、……、N10)进行解冻，观察解冻后各组精液的活力，确定最佳解冻温度，重复4次。
5、精液冷冻效果的检验、比较从上述试验中筛选出最佳精液冷冻稀释液配方、冷冻保护剂及浓度，以优化后的精液冷冻保存程序进行公鹅精液冷冻，制成冻精颗粒。进行冻精颗粒解冻后，人工授精，对种蛋的受精率进行比较评价，以检验精液的最终冷冻效果。
取300日龄吉林白鹅父母代种公鹅80只，从中选10只健康、精液品质好的公鹅供采精，进行精液冷冻。取分别已冷冻保存了10天、30天、3个月、6个月、10个月、2年的冷冻精液进行解冻后，人工授精。取300日龄、健康无病、产蛋率高的吉林白鹅父母代种母鹅600只，供输精试验。母鹅每隔4天输精一次，从第二次输精后的第7天开始收集种蛋，进行孵化。所收集的种蛋在18℃恒温条件下保存，在7天以内入孵。孵化方式采用常用的人工孵化程序进行，于孵化第7天检验种蛋的受精情况，统计种蛋的受精率。
本发明的效果1、精液冷冻试验效果评价研究结果证实，以A液为基础稀释液的6个配方中，其中一个配方(见表1)的冻精颗粒解冻后的精子活力最高，为0.45-0.53。冷冻保护剂毒性及冷冻保护效果实验表明，以9-11％的乙二醇和DMA(1∶1)进行配合的A液冷冻液所获得的精子活力最高，为0.43-0.57。经A液配方冷冻液增加0.04-0.06克的硫酸鱼精蛋白后，精子活力提高了3-6％；最后经改进精液冷冻条件后，解冻后的精子活力达0.47-0.68，受精率达76.7％-86.9％，接近于鲜精液人工授精效果，远高于本交条件下的种蛋受精率。
2、试剂盒组成成分的确定综合上述“精液冷冻试验效果评价”，最终确定，以稀释液配方为精液冷冻的基础营养稀释粉配方，再添加9-11％的乙二醇和DMA(1∶1)冷冻保护剂及0.04-0.06克(每100ml基础稀释液中)的硫酸鱼精蛋白进行配合，组成本发明的试剂盒。
3、试剂盒使用说明用法瓶盖启开后，首先将组分瓶II中的双蒸水100ml全部倒入组分瓶I中，同时加入组分瓶III的硫酸鱼精蛋白，再将组分瓶I重新加盖，充分摇匀，直至瓶中的基础营养稀释粉完全溶解。再将稀释液平均分装于两瓶中，其中一瓶加入组分瓶IV中的冷冻保护剂，振荡，以充分溶解、混合均匀，备用。
用量冷冻稀释液∶鲜精液＝1∶1~2使用时注意①发现试剂瓶有破裂时勿用；②溶解后，冷冻稀释液在冰箱保存不宜超过24小时。
保质期常温下2个月。
4、“二步法”精液冷冻程序的建立①第一步稀释精液采集后，置于30℃的水温中，用同温的不含冷冻保护剂的稀释液进行第一步1∶1稀释后，用棉花包好，放在5℃的冰箱中平衡2小时。
②第二步稀释第一步稀释后，再用相同温度的含冷冻保护剂的稀释液进行第二步稀释，并继续保存15~30min后进行滴冻。滴冻时所用吸管及其它玻璃器皿，都要在5℃下充分平衡后方可进行操作。
③滴冻在盛有液氮的广口液氮罐中，使铜纱网距液氮面高度保持1～2cm。待铜纱网充分冷却后，开始滴冻。每毫升稀释后的精液约滴十粒。滴冻后加盖3分钟，于液氮保存。
5、精液冷冻颗粒解冻方法采用干解冻法进行解冻精液颗粒解冻时，解冻温度以30～40℃之间为宜。冻精经40℃的水浴解冻后，在20min内将解冻精液用完，方可获得较高的受精率。
实施例
实施例1在技术推广基地，操作者用本试剂盒，试剂盒中，基础营养稀释粉组成成分为谷氨酸钠0.55g，磷酸二氢钾2.0g，磷酸氢二钾0.36g，半胱胺酸0.07g，果糖0.11g，肌醇0.05g，棉子糖0.6g，Tris0.2g，青霉素钠10万单位，硫酸链霉素0.09g，氯化钙0.01g；硫酸鱼精蛋白，0.042g；DMA5.0g和乙二醇4.5ml。按试剂盒使用说明配制冷冻稀释液。
采用背部按摩法采集公鹅精液。采集过程中要求精液无粪便、血液和饲料等污染。采集后用棉花包好，置于保温杯中，迅速带回实验室，待处理。并严格按照上述所建立的“二步法”精液冷冻程序，即①第一步稀释精液采集后，置于30℃的水温中，用同温的不含冷冻保护剂的稀释液进行第一步1∶1稀释后，用棉花包好，放在5℃的冰箱中平衡2小时。②第二步稀释第一步稀释后，再用相同温度的含冷冻保护剂的稀释液进行第二步稀释，并继续保存15~30min后进行滴冻。滴冻时所用吸管及其它玻璃器皿，都要在5℃下充分平衡后方可进行操作。③滴冻在盛有液氮的广口液氮罐中，使铜纱网距液氮面高度保持1～2cm。待铜纱网充分冷却后，开始滴冻。每毫升稀释后的精液约滴十粒。滴冻后加盖3分钟，于液氮保存。采用干解冻法进行解冻。精液颗粒解冻时，在40℃的恒温下解冻。输精前，首先进行精子活力检查，并按前述的精子活力记分方法进行记录。
选用300日龄、健康无病、产蛋率高的吉林白鹅父母代种母鹅1500只，进行输精。在20min内把解冻精液用完。母鹅每隔4天输精一次，从第二次输精后的第7天开始收集种蛋，进行孵化。所收集的种蛋在18℃恒温条件下保存，在7天以内入孵。孵化方式采用常用的人工孵化程序进行，于孵化第7天检验种蛋的受精情况，统计种蛋的受精率。检查结果如表1所示表1 鹅精液冷冻保护试剂盒使用效果观察
根据表2的精子活力和种蛋受精率结果显示，在所检测的6批保存时间不同的冷冻精液中，随着冻精颗粒冷冻保存时间的不同，保存6天至1年，其精子活力差异不显著，但保存1年与2、3年时间的精子活力有一定差异，随时间的延长，精子活力呈降低趋势。但精子活力均在0.40以上(0.40-0.68)，达到并超过了用于人工授精的标准(0.3)。在对种蛋受精的影响上，冻精颗粒保存时间对种蛋受精率有一定影响，但在使用后仍获得了较高受精率，76.8％-86.3％。均接近于鲜精的人工授精效果。
实施例2在技术推广相关单位，操作者按试剂盒使用说明配备了冷冻稀释液。采用背部按摩法采集公鹅精液。并严格按照上述所建立的“二步法”精液冷冻程序，进行鹅的精液冷冻后。操作者按照实施例子1中的方法和操作步骤进行冷冻精液颗粒解冻，精子活力检查、记录；并进行冻精解冻后的人工授精、种蛋采集、保存人工孵化、记录等。所输精的父母代种母鹅1200只，390日龄、健康无病、产蛋率高。进行输精后，结果如表2所示表2 鹅精液冷冻保护试剂盒使用效果观察
从表2中可见，冻精颗粒解冻后的精子活力范围，为0.44-0.70，种蛋受精率为84.7-86.2％，两项技术指标均接近于鲜精的人工授精效果。此外，这两项技术参数与表1中相吻合，表明，该试剂盒性能稳定，重现率较高。
实施例3在技术推广相关单位，操作者按试剂盒使用说明配制了冷冻稀释液。采用背部按摩法采集公鹅精液。并严格按照上述所建立的“二步法”精液冷冻程序，进行鹅的精液冷冻后。操作者按照实施例子1中的方法和操作步骤进行冷冻精液颗粒解冻，精子活力检查、记录；并进行冻精解冻后的人工授精、种蛋采集、保存人工孵化、记录和统计等。所输精的父母代种母鹅1500只，330日龄、健康无病、产蛋率高。进行输精后，结果如表3所示
表3 鹅精液冷冻保护试剂盒使用效果观察
从表3中可见，冻精颗粒解冻后的精子活力范围，为0.43-0.69，种蛋受精率为83.9-85.1％，两项技术指标均与表1、2中相一致，接近于鲜精的人工授精效果。此表明，该试剂盒性能稳定，重现率较高，应用效果较理想。
权利要求
1.一种鹅精液冷冻稀释液试剂盒，其组分是组分I谷氨酸钠0.4-0.6、磷酸二氢钾1.4-2.2、磷酸氢二钾0.2-0.5、半胱胺酸0.006-0.01、果糖0.9-1.2、肌醇0.04-0.08、棉子糖0.5-0.8、青霉素钠8-12、硫酸链霉素0.07-0.15、氯化钙0.01-0.02、三羧甲基氨基甲烷0.1-0.3；组分II双蒸水100；组分III硫酸鱼精蛋白0.04-0.06g；组分IV二甲基乙酰胺(DMA)4.5-5.5、乙二醇4.5-5.5ml；以上各成分为重量单位，青霉素钠为万单位。
2.一种鹅精液冷冻稀释液试剂盒的使用方法，其使用方法是I、第一步稀释精液采集后，置于30℃的水温中，用同温的不含冷冻保护剂的稀释液进行第一步1∶1稀释后，用棉花包好，放在5℃的冰箱中平衡2小时。II、第二步稀释第一步稀释后，再用相同温度的含冷冻保护剂的稀释液进行第二步稀释，并继续保存15~30min后进行滴冻；滴冻时所用吸管及其它玻璃器皿，都要在5℃下充分平衡后方可进行操作；III、滴冻在盛有液氮的广口液氮罐中，使铜纱网距液氮面高度保持1～2cm；待铜纱网充分冷却后，开始滴冻；每毫升稀释后的精液约滴十粒；滴冻后加盖3分钟，于液氮保存；采用干解冻法进行解冻；精液颗粒解冻时，在40℃的恒温下解冻。
全文摘要
一种鹅精液冷冻稀释液试剂盒及使用方法，属于动物繁殖技术领域，其试剂盒组分组分I谷氨酸钠0.4－0.6、磷酸二氢钾1.4－2.2、磷酸氢二钾0.2－0.5、半胱胺酸0.006－0.01、果糖0.9－1.2、肌醇0.04－0.08、棉子糖0.5－0.8、青霉素钠8－12、硫酸链霉素0.07－0.15、氯化钙0.01－0.02、三羧甲基氨基甲烷0.1－0.3。组分II双蒸水100。组分III硫酸鱼精蛋白0.04－0.06g。组分IV二甲基乙酰胺(DMA)4.5－5.5、乙二醇4.5－5.5ml。有益效果是使用了三羧甲基氨基甲烷和硫酸鱼精蛋白等成分，并进行了准确量化。首次对鹅精液冷冻稀释液各组成成分按试剂盒的包装形式进行配制。使用方便，操作简单。提高了试剂盒的使用效果。
文档编号C12N5/06GK101037665SQ200610016649
公开日2007年9月19日 申请日期2006年3月13日 优先权日2006年3月13日
发明者徐日福, 吴伟, 高光, 崔柏勋, 孙永峰 申请人:徐日福, 吴伟