专利名称：一种双酶水解制备无苦味大豆肽的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种利用两种特性不同的酶处理大豆分离蛋白，通过数学模型对水解过程进行模拟和预测，获得低分子量、无苦味的大豆肽产品的方法。
背景技术：
大豆肽是指大豆蛋白质经水解作用后，再经分离、精制等过程而获得的蛋白质水解产物，它由大豆蛋白水解后的多种肽混合物共同组成，其中还含有少量游离氨基酸、糖类和无机盐等成分。大豆肽的蛋白质含量为85％左右，其氨基酸组成几乎完全与大豆蛋白质一样，必需氨基酸的平衡良好，含量也丰富。大豆肽分子量通常在10000以下，一些功能性低聚肽分子量较小。大豆肽的水溶性很高，即使在50％的高浓度下仍具流动性；同时，大约10％浓度的大豆蛋白质水溶液一经加热就会凝固，但对于大豆肽的水溶液来说，不产生凝固现象。从pH与溶解性看，大豆蛋白质在等电点pH4.3附近会形成沉淀，而大豆肽在全pH范围内，保持溶解状态，并具有较强的吸湿性和保湿性、抑制蛋白质形成凝胶、调整蛋白质食品的硬度、改善口感和易消化吸收等特性。饮食中的小肽(2～3个氨基酸)和大肽(10～51个氨基酸)能够完整地通过肠道，由肠道直接吸收，小肽吸收速度要比相同组成的游离氨基酸快，而且蛋白质利用率高；生物活性肽在组织水平上可能引起机体的生物学效应。从一些食物蛋白的酶水解产物中分离出的多种小肽具有调节植物神经系统，活化细胞免疫功能，改善心血管功能和抗衰老等生理活性。而且大豆肽抗原性低，不会产生过敏反应。这些发现对开发肽类新型功能保健食品具有重要意义。近年来人们已经发现，大豆肽也具有许多生理功能，如降低胆固醇、抑制血压升高、非过敏性、增强免疫功能和抗自由基损伤(延缓衰老)等。
大豆蛋白质的水解反应可由酸、碱或酶催化进行，酸、碱催化工艺由于其反应剧烈，对营养成分有较大的破坏，已接近淘汰，采用酶法催化是目前生物活性肽生产的主要方法。酶水解会使大豆蛋白的性质有较大的改善，但由于水解作用使大豆蛋白分子内部的疏水氨基酸残基暴露等原因使得所得大豆肽产品有较为严重的苦味，限制了大豆肽产品的应用。为了去除大豆肽产品的苦味，人们开发了多种脱苦工艺包括吸附、掩蔽等等，单独的脱苦工艺不可避免使工艺复杂，成本增加，并且使产率下降。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种原料易得、生产工艺简单的精确高效的制备低分子量、无苦味的大豆肽的方法。
本发明是以大豆分离蛋白为原料，采用双酶水解的方法制备低分子量大豆肽，从而较好的去除了大豆肽产品的苦味，为其应用扫平了道路。本发明建立了关于水解度和水解过程中各控制因素的数学模型，根据此模型可以推定调节其中任一因素对水解反应的影响；也可以根据所需水解度推定相应的反应条件；在生产中某条件受限条件下通过调整其他调节达到所需水解效果。此模型为实现数字化精确控制提供了可能，对生产具有指导意义。
本发明所述大豆肽的制备方法涉及原料预处理、酶解、反应终止、产品纯化等步骤，并对水解过程进行数学模拟。原料预处理即将大豆分离蛋白原料经过高温处理，破坏大豆蛋白的结构，缩短酶处理时间。然后采用两种特性不同的蛋白酶进行水解，至合适的水解度后采用高温处理终止酶反应，调节pH值使剩余蛋白质沉淀最后离心分离，所得上清液经脱盐后即为大豆肽产品。将之喷雾干燥即得粉末装大豆肽产品。
本试验通过均匀设计和二次多项式逐步回归分析得出了Alcalase碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度Y关于底物浓度X1、酶与底物比X2、反应时间X3的数学模型为Y＝-0.004216810156X12-0.012570741235X22-0.008208720443X1*X2+0.00006524879464X1*X3+0.09785141731X1+0.18829124604X2-0.0005398321290X3-0.584988919。
本发明制备无苦味大豆肽的方法包括如下步骤a)原料预处理将底物浓度为6～10％的大豆分离蛋白在70℃～90℃预热，并辅以匀速200～400r/min搅拌，进行预处理，使大豆分离蛋白中的脂肪氧化酶钝化，预处理时间为10～15min，以达到部分变性及均质的效果；b)酶水解经预处理后的大豆分离蛋白加入反应器200～400r/min搅拌至均质并冷却到酶解反应温度60℃，用2～4M的NaOH和2～4M的HCL调节酸碱度至酶的最适pH8.0，依据所用酶的活力，准确量取蛋白量的3％～5％的Alcalase碱性蛋白酶加入水解反应器中，反应过程中滴加2～4M NaOH，使pH稳定在酶的最适pH8.0，并使温度始终保持在酶解的最适温度60℃，监测水解过程中各时段消耗的碱液量，以pH-stat法计算并监控水解度达20％-24％后调整温度至55℃，pH值至7.5，加Flavourzyme复合风味蛋白酶，用量为蛋白量的2％～5％，酶解过程中保持温度和pH的恒定，水解时间3～5h；c)反应终止当反应到预定水解度，即用2～4M的HCL调节pH至4.3，停止搅拌，移出反应器，迅速升温到80～95℃，加热5～15min，钝化蛋白酶；d)离心沉淀4000～6000rpm离心20～40min将沉淀与混合肽分离，收集上清液，即为双酶水解混合大豆肽；e)精制将离心后的上清液过H+型阳离子交换树酯进行脱盐精制；f)浓缩将脱盐后的液体大豆肽进行真空浓缩，使之体积减小到原来的1/4～1/2；g)干燥喷雾干燥，即得大豆肽产品，产品得率为58.7％～67.8％。
本发明所得大豆肽呈乳白色略带黄色粉末，粘性较大，易吸潮，较细腻，略呈苦味，且有淡淡的香味。其氨基酸的组成几乎完全与大豆蛋白质一样，也具有必需氨基酸比例平衡，含量丰富的特点。所含有的八种必需氨基酸，除蛋氨酸为限制氨基酸以外，其它氨基酸均超过或接近世界卫生组织(WHO)的推荐标准，因此具有较高的营养价值。其质量指标如下(1)感官指标口味清淡、无苦味。
色泽白色或微黄色。
组织状态干燥粉末、冲调后杯底无沉淀。
(2)理化指标粗蛋白含量82％～85％游离氨基酸含量8％水分含量6.6％灰分含量6.2％糖及其它含量4％可溶性氮指数99.8％三氯醋酸可溶性蛋白99.8％分子质量5000～20000
大豆肽产品的特性如下(1)大豆肽溶液的粘度大豆肽溶液粘度随浓度增高而变化不大。大豆蛋白质浓度在0％～10％之间变化时，粘度变化较为平缓，但是当浓度高于10％以后，粘度直线上升。而大豆肽液的流动性极好，浓度在50％时也富有流动性。
(2)大豆肽的溶解性大豆肽具有较高的溶解度，并在所有pH仍保持良好的溶解状态，溶液保持透明。在低温条件下仍能保持较高的溶解度(0℃时大豆肽的溶解度为14.44g/100g水，20℃时大豆肽的溶解度为25.91g/100g水，40℃时大豆肽的溶解度为31.09g/100g水)。
(3)大豆肽的抗凝胶特性在淀粉中添加大豆肽会阻碍淀粉凝较的形成，使淀粉糊的粘度下降，且幅度较大(在浓度为8％的淀粉糊中添加1％的大豆肽可使淀粉糊的最高粘度下降26％，最低粘度下降73％、最终粘度下降79％)。
(4)大豆肽的乳化性大豆肽具有一定的乳化性，与大豆分离蛋白相比其乳化性及乳化稳定性随浓度增加而增加。
(5)大豆肽的热稳定性大豆肽对热稳定，100℃煮沸无沉淀。
以下通过试验例进一步说明本发明。
试验例1 大豆肽抗氧化活性经测定大豆肽活性明显，为明确其中的活性组分，本试验中又用葡聚糖凝胶色谱(SephadexG-50)和超滤膜(聚醚砜膜，截流分子量3000)对大豆肽进行了分离，分离所得组分分别称为层析组分1～9；大豆肽经聚醚砜超滤膜超滤所得两组分分别称为超滤浓缩肽和超滤滤过肽。以类超氧化物歧化酶(SOD)活性和氧化抑制率为指标，各组分抗氧化活性如表1表1 大豆肽抗氧化性Table 1 Antioxidation of soy peptide
其中层析组分4的抗氧化能力最强；层析组分6次之；层析组分8和层析组分9活性较高；值得注意的是大豆肽3抗氧化能力也较强，未经分离而能有如此之高的活性，极具应用价值；其他各组分也有活性检出。
试验例2 大豆肽降血脂活性大豆肽具有明显的降血脂活性，从表2的数据可见，其中高剂量给药对大鼠血清甘油三酯具有明显的降低作用。与对照组相比差异显著(P＜0.05＝)，因而具有统计学意义。
表2 大豆肽对大鼠血清的影响Tabel 2.effect of soy peptide on Wister mice，serum
同一列无相同小写字母者差异显著(P＜0.05＝试验例3 大豆肽抗疲劳活性为考察大豆肽是否具有使动物迅速恢复疲劳提高耐力的作用，我们进行了小鼠游泳试验，其中大豆肽1作用效果明显，从表3中的数据可以看出，给大豆肽组小鼠坚持游泳的时间长，高剂量组长于低剂量组。而给水组时间最短，统计学处理表明高剂量组结果显著(P＜0.05)，表明大豆肽具有使动物恢复疲劳及提高耐力的作用。
表3 大豆肽对小鼠游泳的影响Tabel 3 Effect of soy peptide on the mice of swimming time
同一列无相同小写字母者差异显著(P＜0.05＝)试验例4 大豆肽降血压活性为考察大豆肽是否具有降低高血压患者血压的作用，我们进行了血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性试验，本课题中大豆肽2具有较强的ACE抑制活性，为明确其中的活性组分，本课题中又用葡聚糖凝胶色谱对大豆肽2进行了分离，所得5种组分分别称为层析组分1-5；以ACE抑制百分率表示，各组分抑制活性见表4
表4 大豆肽降血压活性Table 4 antihypertension of soy peptide
层析组分4、层析组分5降血压活性较强，而层析组分1、层析组分2、层析组分3活性较小，并有活性随分子量减小而加强的趋势。由此我们考虑大豆肽3是在大豆肽2的基础上进一步水解而得，分子量更小，其活性可能更强，但经检测，其抑制百分率仅有12.5％，尚不足大豆肽2的一半。分析因ACE属于外切酶，其抑制剂的C端的结构对抑制活性影响较大，而大豆肽3生产中因加入外切酶，破坏了抑制剂的C端的结构，导致活性的下降。
试验例5 大豆肽发酵性大豆肽具有促进发酵的作用，具有明显的促进酵母生长作用，且高于蛋白胨。并能促进有益代谢物的分泌。大豆多肽能促进乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌、霉菌及其他菌类的增殖作用。
大豆肽组相对于空白组增加8.9倍，等同于蛋白质组，高于蛋白胨2.5倍。
表5 大豆肽5对酵母发酵的影响Tabel.5 Effect of soy peptide on the feament of yeast
由于大豆多肽具有促进微生物生长发育和代谢作用，可以将其用于生产酸奶、干酪、醋、面包、酱油、火腿等食品中。提高生产效率，改善品质的稳定性、营养性及风味；还可以用于酶制剂的生产中。
具体实施例方式实施例1准确称取底物浓度为8.38％的大豆分离蛋白，将大豆分离蛋白在75℃预热，并辅以匀速400r/min搅拌，进行预处理15min后加入反应器400r/min搅拌至均质并冷却到酶解反应温度60℃，用4M的NaOH和4M的HCL调节酸碱度至酶的最适pH8.0，依据所用酶的活力，准确量取蛋白量的4.5％的Alcalase碱性蛋白酶加入水解反应器中，反应过程中滴加4M NaOH和4M的HCL，使pH稳定在酶的最适pH8.0，并使温度始终保持在酶解的最适温度60℃，监测水解过程中各时段消耗的碱液量，以pH-stat法计算并监控水解度达20％后调整温度至55℃，pH值至7.5，加Flavourzyme复合风味蛋白酶，用量为蛋白量的4％，酶解过程中保持温度和pH的恒定，水解时间4h，水解结束后调pH至4.3沉淀酶和剩余蛋白质，90℃加热15min使酶彻底钝化，4000rpm离心40min将沉淀与混合肽分离，收集上清液，即为双酶水解混合大豆肽，将之脱盐浓缩至体积减小到原来的1/2后喷雾干燥，即得大豆肽产品，产率为64.6％。
实施例2准确称取底物浓度为6％的大豆分离蛋白，将大豆分离蛋白在90℃预热，并辅以匀速200r/min搅拌，进行预处理10min后加入反应器200r/min搅拌至均质并冷却到酶解反应温度60℃，用2M的NaOH和2M的HCL调节酸碱度至酶的最适pH8.0，依据所用酶的活力，准确量取蛋白量的3％的Alcalase碱性蛋白酶加入水解反应器中，反应过程中滴加2M的NaOH，使pH稳定在酶的最适pH8.0，并使温度始终保持在酶解的最适温度60℃，监测水解过程中各时段消耗的碱液量，以pH-stat法计算并监控水解度达24％后调整温度至55℃，pH值至7.5，加Flavourzyme复合风味蛋白酶，用量为蛋白量的5％，酶解过程中保持温度和pH的恒定，水解时间3h，水解结束后调pH至4.3沉淀酶和剩余蛋白质，80℃加热10min使酶彻底钝化，5000rpm离心40min将沉淀与混合肽分离，收集上清液，即为双酶水解混合大豆肽，将之脱盐浓缩至体积减小到原来的1/4后喷雾干燥，即得大豆肽产品，产率为67.8％。
实施例3准确称取底物浓度为8％的大豆分离蛋白，将大豆分离蛋白在85℃预热，并辅以匀速300r/min搅拌，进行预处理10min后加入反应器300r/min搅拌至均质并冷却到酶解反应温度60℃，用4M的NaOH和4M的HCL调节酸碱度至酶的最适pH8.0，依据所用酶的活力，准确量取蛋白量的4％的Alcalase碱性蛋白酶加入水解反应器中，反应过程中滴加4M的NaOH和4M的HCL，使pH稳定在酶的最适pH8.0，并使温度始终保持在酶解的最适温度60℃，监测水解过程中各时段消耗的碱液量，以pH-stat法计算并监控水解度达22％后调整温度至55℃，pH值至7.5，加Flavourzyme复合风味蛋白酶，用量为蛋白量的2.5％，酶解过程中保持温度和pH的恒定，水解时间5h，水解结束后调pH至4.3沉淀酶和剩余蛋白质，95℃加热15min使酶彻底钝化，4000rpm离心30min将沉淀与混合肽分离，收集上清液，即为双酶水解混合大豆肽，将之脱盐浓缩至体积减小到原来的1/2后喷雾干燥，即得大豆肽产品，产率为62.7％。
实施例4准确称取底物浓度为10％的大豆分离蛋白，将大豆分离蛋白在80℃预热，并辅以匀速200r/min搅拌，进行预处理15min后加入反应器400r/min搅拌至均质并冷却到酶解反应温度60℃，用4M的NaOH和4M的HCL调节酸碱度至酶的最适pH8.0，依据所用酶的活力，准确量取蛋白量的5％的Alcalase碱性蛋白酶加入水解反应器中，反应过程中滴加4M的NaOH，使pH稳定在酶的最适pH8.0，并使温度始终保持在酶解的最适温度60℃，监测水解过程中各时段消耗的碱液量，以pH-stat法计算并监控水解度达20％后调整温度至55℃，pH值至7.5，加Flavourzyme复合风味蛋白酶，用量为蛋白量的2％，酶解过程中保持温度和pH的恒定，水解时间5h，水解结束后调pH至4.3沉淀酶和剩余蛋白质，95℃加热5min使酶彻底钝化，6000rpm离心20min将沉淀与混合肽分离，收集上清液，即为双酶水解混合大豆肽，将之脱盐浓缩至体积减小到原来的1/2后喷雾干燥，即得大豆肽产品，产率为58.7％。
实施例5准确称取底物浓度为7％的大豆分离蛋白，将大豆分离蛋白在70℃预热，并辅以匀速300r/min搅拌，进行预处理10min后加入反应器300r/min搅拌至均质并冷却到酶解反应温度60℃，用3M的NaOH和3M的HCL调节酸碱度至酶的最适pH8.0，依据所用酶的活力，准确量取蛋白量的3.5％的Alcalase碱性蛋白酶加入水解反应器中，反应过程中滴加3M的NaOH和3M的HCL，使pH稳定在酶的最适pH8.0，并使温度始终保持在酶解的最适温度60℃，监测水解过程中各时段消耗的碱液量，以pH-stat法计算并监控水解度达20％后调整温度至55℃，pH值至7.5，加Flavourzyme复合风味蛋白酶，用量为蛋白量的3％，酶解过程中保持温度和pH的恒定，水解时间4h，水解结束后调pH至4.3沉淀酶和剩余蛋白质，90℃加热15min使酶彻底钝化，4000rpm离心30min将沉淀与混合肽分离，收集上清液，即为双酶水解混合大豆肽，将之脱盐浓缩至体积减小到原来的1/4后喷雾干燥，即得大豆肽产品，产率为60.2％。
权利要求
1.一种双酶水解制备无苦味大豆肽的方法，包括下列步骤a)原料预处理将底物浓度为6～10％的大豆分离蛋白在70℃～90℃预热，并辅以匀速200～400r/min搅拌，进行预处理，使大豆分离蛋白中的脂肪氧化酶钝化，预处理时间为10～15min，以达到部分变性及均质的效果；b)酶水解经预处理后的大豆分离蛋白加入反应器200～400r/min搅拌至均质并冷却到酶解反应温度60℃，用2～4M的NaOH和2～4M的HCL调节酸碱度至酶的最适pH8.0，依据所用酶的活力，准确量取蛋白量的3％～5％的Alcalase碱性蛋白酶加入水解反应器中，反应过程中滴加2～4M NaOH，使pH稳定在酶的最适pH 8.0，并使温度始终保持在酶解的最适温度60℃，监测水解过程中各时段消耗的碱液量，以pH-stat法计算并监控水解度达20％-24％后调整温度至55℃，pH值至7.5，加Flavourzyme复合风味蛋白酶，用量为蛋白量的2％～5％，酶解过程中保持温度和pH的恒定，水解时间3～5h；c)反应终止当反应到预定水解度，即用2～4M的HCL调节pH至4.3，停止搅拌，移出反应器，迅速升温到80～95℃，加热5～15min，钝化蛋白酶；d)离心沉淀4000～6000rpm离心20～40min将沉淀与混合肽分离，收集上清液，即为双酶水解混合大豆肽；e)精制将离心后的上清液过H+型阳离子交换树酯进行脱盐精制；f)浓缩将脱盐后的液体大豆肽进行真空浓缩，使之体积减小到原来的1/4～1/2；g)干燥喷雾干燥，即得大豆肽产品，产品得率为58.7％～67.8％。
全文摘要
一种双酶水解制备无苦味大豆肽的方法，涉及原料预处理、酶解、反应终止、产品纯化，并对水解过程进行数学模拟，原料预处理即将大豆分离蛋白原料经过高温处理，破坏大豆蛋白的结构，缩短酶处理时间。然后采用两种特性不同的蛋白酶进行水解，至合适的水解度后采用高温处理终止酶反应，调节pH值使剩余蛋白质沉淀最后离心分离，所得上清液经脱盐后即为大豆肽产品。本发明所得大豆肽呈乳白色略带黄色粉末，粘性较大，易吸潮，较细腻，且有淡淡的香味。其氨基酸的组成几乎完全与大豆蛋白质一样，氨基酸比例平衡，含量丰富。所含有的八种氨基酸除蛋氨酸为限制氨基酸以外，其它氨基酸均超过或接近世界卫生组织的推荐标准，因此具有较高的营养价值。
文档编号C12P21/02GK1932027SQ200610017190
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月20日 优先权日2006年9月20日
发明者陈 光, 孙旸, 李艳丽, 丛建民 申请人:吉林农业大学