专利名称：病原诱导启动子p的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一段水稻DNA片段的分离克隆、功能验证及应用。所述的DNA片段包含一个水稻抗病相关基因的启动子，它能够在病原物的诱导下特异性地驱动基因表达；它也能够在植物激素和化学信号分子的诱导下特异性地驱动基因表达。将该片段与抗病基因融合后转入水稻，遗传转化植株在病原物诱导下可以特异地表达抗病基因，其抗病性增强。
背景技术：
植物在生长的过程中，会受到多种病原物如病毒、细菌、霉菌和线虫等的侵害。病原物侵入植物导致两种结果(1)病原体在寄主植物内繁殖，引起相关的病害；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。
采用转基因技术将抗性基因导入植物是目前改良农作物抗病性的主要途径之一。但是目前的遗传转化体系存在一些不足，很重要的一点便是转化载体中的启动子大多是组成型表达启动子。这不仅造成了植物体的负担，使植物在不需要发生抗病反应时表达额外的蛋白，造成了浪费；严重的还造成了植物体生理和代谢的紊乱，致其产生变异或死亡(Ehsani等，2003；Karlowski等，2003；Miyao等，2003；Durrant和Dong，2004)。
为了解决以上问题，申请人试图使用特异性启动子调控目标基因的表达。启动子是一段对基因的表达起调控作用的DNA片段。启动子在原核生物和真核生物中均存在，它是一段对基因转录的时间，空间和表达量起调控作用的DNA序列。在原核和真核生物中，启动子的结构有所不同。真核生物有三种RNA聚合酶，每一种都有其识别的不同启动子。RNA聚合酶II负责蛋白质基因和部分snRNA基因的转录，结构最为复杂。人们比较了上百个聚合酶II识别的真核启动子的序列，发现了一些共同的结构。如1)帽子位点，即转录起始位点，其碱基大多为A，两侧各有若干个嘧啶核苷酸，其中A为转录起点。2)TATA框，又称Hogness框或Goldberg-hogness框，其一致序列为TATAAAA或TATATAT，而在它的两侧由富含G和C碱基对的序列组成，一般都位于-35bp附近。TATA框决定了转录起始点的选择，它是RNA聚合酶和DNA链结合的部位。3)CAAT框，其一致序列为GGC(T)CAATCT。一般位于-75bp附近，该框的碱基一旦缺失或突变，将会造成转录效率的急剧降低，CAAT框可能控制着转录起始的频率。4)增强子(enhancer)，又称为远上游序列，一般都在-100bp以上，它对依赖和不依赖TATA框的转录均有增强转录的作用。
特异性的启动子分为二类，一是受诱导表达的特异启动子，二是组织特异性表达的启动子。诱导型的启动子对外界的某些物质，如病原物，化学物质或逆境作出反应，启动植物体内相应的基因表达。组织特异型的启动子则驱动基因在特定的组织中表达。特异性的启动子可避免基因过量表达对植物体产生伤害。因此，利用水稻来源的病原物诱导表达的启动子驱动抗性基因的表达，是改良水稻抗性的最佳选择之一。
发明内容
本发明的第一个目的是从水稻中分离克隆一个抗病相关基因启动子区的DNA片段，对其功能进行验证，利用这个启动子调控抗性基因的表达，从而改良水稻的抗病性。这个启动子被命名为POsDR3(promoter of Oryza sativa defense responsive gene 3)。
本发明的第二个目的是将所克隆的启动子在培育转基因水稻中的应用。该转基因水稻在病原物诱导下可以特异地表达抗病基因，使其抗病性增强。
本发明涉及分离和应用水稻抗病相关基因OsDR3启动子的DNA片段(POsDR3)。该片段包含对病原、多种激素和化学信号分子产生应答反应的元件。其中，所述片段如序列表SEQ IDNO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ IDNO1所示序列的亚片段。
可以采用已经克隆的POsDR3启动子作探针，从基因组文库中筛选得到本发明的启动子或同源的启动子。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组中扩增得到本发明的POsDR3启动子以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含POsDR3的序列，将这一序列与基因连接并与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物。
本发明为植物对病害的抗病育种提供了一种新的方法。这种方法包括将POsDR3与抗性基因连接后转入感病植物，通过该启动子在病原侵袭植物时驱动抗性基因的表达，提高植物对病原菌的抗性。
将克隆的启动子连接抗性基因转入植物，可以避免植物过量表达目标基因造成的不利影响，这是传统的组成型启动子在转基因的过程中无法做到的。
本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的启动子或基于该启动子的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的启动子转入其它的植株。
在本发明的实施例部分，申请人阐述了分离、验证和应用POsDR3启动子的过程以及该启动子的特点及应用。
序列表SEQ ID No1.本发明分离克隆的POsDR3启动子序列。
图1.水稻品种明恢63中覆盖POsDR3启动子区段的Shotgun亚克隆的重叠图。箭头的位置及长度表示测序的方向和长度，序号代表Shotgun亚克隆编号，拼接得到一长2946bp的序列。
图2.OsDR3基因启动子(POsDR3)的基本结构。+1是预测的转录起始位点；ATG是翻译起始位点；预测的TATA框是RNA聚合酶和DNA链结合部位；预测的CAAT框控制转录起始的频率。
图3.遗传转化载体pCAMBIA1381的结构。
图4.分离的POsDR3启动子位于OsDR3基因(图2)的-691至+37bp处。用POsDR3调控报告基因GUS(β-葡萄糖醛酸酶基因)的表达。
图5.遗传转化植株在接种白叶枯病菌菌株JL691和对照处理(接水)后不同时间点GUS基因的表达量。每个时间点为来源于3株转化植株(7G7-1、7G7-2和7G7-4)数据的平均数。0小时为接种或接水后立即取材的样品。GUS基因的表达量通过测定每分钟每毫克蛋白中由GUS催化产生的4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone，Mu)的量表示。
图6.在12IPMKb质粒载体中POsDR3启动子调控抗白叶枯病基因Xa26的表达。
图7.报告基因GUS在水稻愈伤组织中表达模式说明POsDR3启动子对植物激素和化学信号分子的诱导产生应答。GUS基因的表达量通过测定每分钟每毫克蛋白中由GUS催化产生的4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone，Mu)的量表示。
具体实施例方式
本发明的前期研究工作结果显示来源于水稻品种明恢63的cDNA克隆EI12I1是OsDR3基因的cDNA片段，OsDR3是一个抗病相关基因。不同白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea(Hebert)Barr)可特异性的诱导OsDR3基因的表达(Wen等，2003；专利申请号200410009452.2，水稻抗病相关基因OsDR3，发明人王石平、邱德运、熊敏；申请日2004.8.19)，提示OsDR3基因的启动子是一种受不同病原菌诱导特异表达的启动子。
以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期研究工作结果的基础上分离克隆POsDR3启动子以及验证其功能和应用的方法和结果。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例一分离克隆POsDR3启动子1.从抗病水稻品种明恢63中分离克隆包含POsDR3启动子的克隆本发明以上述cDNA克隆EI12I1做探针，从明恢63BAC文库(Peng等1998)中筛选到一个阳性BAC克隆7G7。用限制性内切酶HindIII消化BAC克隆7G7，将酶切片段与HindIII处理的pUC19载体(购自美国Amersham Biosciences公司)连接，电转化(Sambrook和Russell，2001)大肠杆菌DH10B(购自美国Invitrogen公司)，制备亚克隆。亚克隆经用cDNA克隆EI12I1的序列设计的PCR引物EI12I1F(5’-CAGTAGCTCCAAGGGGTGTC-3’)和EI12I1R(5’-TTAAAGTTGGGGTTCCCATTC-3’)扩增检测，获得一个包含目标启动子片段的阳性亚克隆7G7H14；该亚克隆的外源插入片段长约3.6kb。
2.测序分析亚克隆7G7H14本发明采用Shotgun的方法进行测序(Sambrook和Russell，2001)。其主要步骤如下将亚克隆7G7H14用超声波打断，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离大约1kb的DNA片段，纯化后用T4-DNA聚合酶补平末端；将这些片段与限制性内切酶SmaI处理的pUC18载体(购自美国Amersham Biosciences公司)连接，电转化大肠杆菌DH10B(购自美国Invitrogen公司)，挑克隆检测插入片段大小。选择插入片段在1kb左右的克隆进行测序。
采用M13-R和M13-F通用引物(购自中国上海生工生物工程公司)、美国AppliedBiosystems公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)、分别从每个亚克隆的两端测序。共计对17个亚克隆进行了测序(图1)。使用Sequencher 4.1软件(美国Gene Codes Corporation)拼接序列。用该软件自动去除末端测序较差的序列和pUC18载体序列。在重叠序列长度大于40bp、重叠序列的一致性大于95％的条件下进行序列拼接，得到一段长2946bp的序列。目标基因区段的每一个碱基都参照重叠在该位点的多个Shotgun片段的序列来确定。
3.POsDR3启动子的分离和结构分析采用基因预测软件GenScan(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)对亚克隆7G7H14的序列(2946bp)进行基因结构预测分析。分析结果表明该亚克隆包含一个完整的基因，即OsDR3基因，在其上游600多个碱基处有另一个不完整的基因，因此推测OsDR3基因的启动子可能小于700bp。
根据预测的OsDR3基因启动子位置，本发明采用限制性内切酶MscI和AccIII消化亚克隆7G7H14，获得一个由728碱基组成的、包含OsDR3基因启动子的DNA片段。该DNA片段位于OsDR3基因的-691至+37处，被命名为POsDR3(promoter of Oryza sativa defenseresponsive gene3)(图2)。
采用一系列启动子分析软件，如Softberry网站(http://www.softberry.com)的TSSP软件、PROSCAN软件(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan)、PLACE(A Database of PlantCis-acting Regulatory DNA Elements)中的Signal Scan分析工具(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)、TESS软件(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/gene-search.html)、Match1.0软件(http://www.gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/match/bin/match.cgi)、以及AliBata2.1软件(http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibata2/index.html)等分析OsDR3基因启动子的结构。发现在OsDR3启动子的-30bp处是TATA框，-179bp是与转录频率有关的CAAT框(图2)。
实施例二POsDR3启动子的功能验证1.遗传转化载体的构建所用载体是pCAMBIA1381。pCAMBIA1381载体是国际上常用的植物农杆菌介导的遗传转化载体pCAMBIA1301(Sun等，2004)的系列载体。该载体携带无启动子的报告基因GUS(β-葡萄糖醛酸酶基因)(图3)。pCAMBIA1381载体由澳大利亚CAMBIA实验室(Center forthe Application of Molecular Biology to International Agriculture)惠赠。
遗传转化载体的构建采用常规重组质粒构建方法(Sambrook和Russell，2001)。主要步骤是将从亚克隆7G7H14上获得POsDR3启动子用T4 DNA Polymerase抹平酶切片段末端；同时，用平端的限制性内切酶SmaI酶切遗传转化载体pCAMBIA1381；酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，纯化酶切产物；然后用去磷酸化酶Alk对纯化的酶切产物进行去磷酸化处理；用包含POsDR3启动子的酶切片段和去磷酸化的pCAMBIA1381载体做连接反应，使其驱动报告基因GUS的表达(图4)。通过酶切筛选阳性克隆，并通过BspHI和EcoRI酶切筛选外源片段正向插入的阳性克隆。获得的重组质粒被命名为D53I。将D53I质粒电转化(Sambrook和Russell，2001)进入农杆菌菌株EHA105(Sun等，2004)。
2.POsDR3启动子的功能验证采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，1994)将EHA105菌株携带的D53I导入感病水稻品种牡丹江8(Oryza sativa ssp.japonica)。本发明共获得独立遗传转化水稻植株32株。采用剪叶法(Kauffman等，1973)，对所有转化植株在成株期阶段接种白叶枯病菌菌株JL691(Sun等，2004)进行初步检测，发现与不接种的转化植株相比，白叶枯病菌侵染后报告基因GUS的表达量迅速上升。本发明进一步选择单拷贝的、T0代独立转化植株7G7-1、7G7-2和7G7-4定量分析报告基因的表达量。在分蘖早期将这3株转化植株分蔸，各个一分为二。在分蘖晚期将其中一份用于接种白叶枯病菌JL691，另一份用于接水作为对照。GUS基因的表达量通过测定每分钟每毫克蛋白中由GUS催化产生的4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone，Mu)的量表示。Mu的测定按照Jefferson和Bevan(1987)报道的方法。其主要步骤是取约100mg水稻叶片，加入500μl提取液在研碎中研磨，离心后收集上清液，在1ml预热的提取液中加入20μg的总蛋白，在37℃下反应10分钟后取100μl加入到900μl反应中止液中，然后在激发波长365nm和发射波长458nm下用分光光度计测定样品含量。样品中蛋白质含量的测定采用Bradford(1976)报道的方法。
分析结果表明本发明的启动子在白叶枯病菌诱导15分钟即可诱导报告基因的表达，在2小时报告基因的表达量达到高峰，大约是对照材料的19倍(图5)。说明POsDR3是病原特异诱导的启动子。
实施例三POsDR3启动子的应用为了检验POsDR3启动子在水稻抗病中的应用价值，本发明将前述pCAMBIA1381载体中的报告基因GUS用水稻抗白叶枯病基因Xa26(Sun等，2004；专利号ZL02139212.9，水稻抗白叶枯病基因Xa26(t)；发明人王石平、孙新立、曹应龙、杨之芬、张启发；授权公告日2005.5.18)替代，采用实施例二所述的方法将POsDR3启动子与携带Xa26基因的pCAMBIA1381载体连接。获得的重组质粒被命名为12IPMKb(图6)。将12IPMKb质粒电转化(Sambrook和Russell，2001)进入农杆菌菌株EHA105(Sun等，2004)。
采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，1994)将EHA105菌株携带的12IPMKb质粒导入感病水稻品种中花11(Oryza sativa ssp.japonica)，获得19株独立转化植株。转化植株被命名为12IPMKb-1、2等。用Xa26基因的特异引物RKb-3race2(5’-TGGTCAAATACCGGAAGGAG-3’)和RKb-2R(5’-CAGTCCACCACATGGACAAG-3’)、采用PCR方法检测转化植株，发现3株(12IPMKb-7、12IPMKb-16、12IPMKb-19)为阴性植株，其它16株是阳性植株(表1)。在孕穗期采用剪叶法(Kauffman等，1973)对所有转化植株接种国际上常用的白叶枯病菌菌株PXO61(Sun等，2004)，发现12株阳性转化植株的抗白叶枯病菌侵害能力显著(P＜0.01)增强(表1)；与遗传转化的受体水稻品种中花11相比，这些转化植株的病斑面积减小了57.8-81.5％。这些结果说明用POsDR3启动子调控抗性基因表达能有效地改良水稻的抗病性。
表1.T0代遗传转化植株对白叶枯病菌株PXO61的反应
1+代表阳性转化植株；-代表阴性转化植株。
实施例四POsDR3启动子对植物激素和化学信号分子产生应答反应1.报告基因GUS瞬时表达分析采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，1994)瞬时表达GUS。其主要步骤如下取3-5块水稻品种牡丹江8的愈伤组织，经过3天预培养后(N6培养基)，将愈伤组织在携带POsDR3GUS构建物(质粒D53I，图4)的农杆菌EHA105菌株悬浮液中浸泡30分钟到1小时，在N6培养基上共培养16小时以上，然后用无菌水洗涤愈伤组织。将100μmol/l的乙烯、脱落酸、水杨酸、茉莉酸、或赤霉素分别加入含有愈伤组织的1.5ml离心管中，刚刚淹没愈伤组织，对其进行诱导，并分别在15分钟、30分钟及1小时取样。经过处理的愈伤组织按Jefferson和Bevan(1987)的方法进行GUS活性的定量分析。
2.多种激素和化学信号分子诱导POsDR3启动子的功能通过检测报告基因GUS的瞬时表达，证实POsDR3启动子不仅受多种抗病途径的信号分子(水杨酸、茉莉酸、乙烯)的诱导，也受其它激素(脱落酸、赤霉素)的诱导(图7)。携带POsDR3GUS的组织在乙烯和茉莉酸诱导后15分钟到1小时均保持较恒定的、高水平的GUS活性，其活性是接水对照的大约14倍。POsDR3GUS在脱落酸诱导15分钟后即呈高水平表达，诱导30分钟时其表达到达顶峰(大约是对照表达量的14倍)，而诱导1小时后表达量降低。POsDR3GUS在水杨酸诱导15分钟至1小时均呈上升表达，在1小时的最高峰时的表达量是接水对照的17倍。POsDR3GUS在赤霉素诱导15分钟时表达量达到顶点(是对照的15.4倍)，但随诱导时间增长其表达量逐渐下降。这些结果说明POsDR3启动子不仅可通过调控抗性基因用于水稻的抗病性改良，还可以通过调控其它基因的表达，用于改良水稻对脱落酸和赤霉素反应产生的各种生理活动。
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权利要求
1.一种对病原菌、多种激素和化学信号分子产生应答反应的启动子POsDR3，它是SEQ IDNO1中所示的DNA序列。
2.权利要求1所述的启动子，它是水稻抗病相关基因OsDR3的启动子。
3.权利要求1或2所述的DNA序列在增加水稻对病害抗性中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及包含水稻病原诱导启动子P
文档编号C12N15/82GK101063133SQ200610018888
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月26日 优先权日2006年4月26日
发明者王石平, 蔡萌, 曹应龙 申请人:华中农业大学