专利名称：茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法
技术领域：
本发明属于植物的培养方法，具体涉及一种茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法。
背景技术：
茶用菊花传统的繁殖方法主要是利用扦插、分株等繁殖方法，但这些繁殖方法一方面需要大量的母株，另方面还需花费大量人力、物力、财力、时间等，且繁殖速度慢，对于大规模的茶用菊花生产而言，传统的繁殖方法已远远不能满足生产上的需要。同时由于长期采用分株、扦插等无性繁殖方法，使得植株感染病毒严重(蔡祝南等，1992；宋瑞林等，1997)。目前侵袭菊花的病毒不下10余种，如菊花矮缩类病毒CSC，菊花番茄不孕病毒TAV，烟草花叶病毒TMV，黄瓜花叶病毒CMV，马铃薯病毒PVX，马铃薯Y病毒等。而且病情随种植时间的延长而逐渐恶化，植株生长势弱，产量降低，品质变差，甚至有的优良品种因此而丢失。长期以来，关于菊花病毒病的防治尚无有效的方法。随着现代生物技术的发展，人们发现植物的顶端分生组织不受病毒感染，因而采用茎尖培养可望得到无病毒的材料，在马铃薯茎尖培养、甘薯茎尖培养、草莓茎尖培养中获得无病毒苗已经获得成功(高遗虹和李梅，1994；尚佑芬等，1996)。脱毒苗(无病毒苗)的优点有扶壮品种，恢复种性，提高产量和品质；生长健壮，根系发达；提高产量。抗性增强，管理粗放，降低生产成本。不用或减少化学农药防治，减少了农药污染和农药残留，可以获得绿色中草药无公害植株，具有良好的经济和社会效益。有关菊花的茎尖脱毒培养过去多集中在观赏和切花菊品种方面(蔡祝南等，1992；裘文达等，1983；徐丽娟等，1997；王康才等，2000；蒋细旺等，2003)。上述方法不适用于茶用菊花的食用要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法，以解决上述问题。
本发明的技术方案为茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法，步骤是(1)茶用菊花茎尖外植体的获得将带顶芽的茶用菊花茎段消毒后，剥掉顶芽外面的幼叶，露出茎尖，切取茎尖；(2)茶用菊花茎尖外植体的培养和丛生芽的形成将茎尖在诱导培养基中养4～6周后形成丛生芽；(3)茶用菊花丛生芽的病毒检测当丛生芽的长度为2.5～3.5cm，对由茎尖产生的每一个单株进行病毒检测；(4)茶用菊花丛生芽的增殖将经过病毒检测确认不带有病毒后的单株转接到生根培养基上进行培养，当植株长至6～8cm时，将植株切成带1～2个节的茎段进行增殖(增殖条件为日光灯光源，每天连续光照12h，光照强度为2000～3000lx，培养温度(25±1)℃。)；(5)茶用菊花增殖苗的生根和移栽将增殖后的幼苗在生根培养基上进行生根后，炼苗，取出试管苗，再用清水洗净试管苗的根系后，移栽入由消毒泥炭与珍珠岩混合的基质中培养即得到茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗。
本发明茶用菊花无激素脱毒组织培养苗的方法体系稳定，操作较易，增殖率和组培苗去病毒率高；获得的幼苗生根容易，健壮抗逆，抗病虫能力强，成本比常规低50％左右，且开花整齐，鲜花质量高，栽培管理较容易。
具体实施例方式
1、茶用菊花茎尖外植体的获得取带顶芽的茶用菊花茎段，长约2cm，于流水中冲洗4～6h，然后在超净工作台上将材料浸入70％酒精30s，用无菌水冲洗3次，再用0.2％升汞消毒3min，无菌水冲洗5～6次，升汞消毒重复2次。将消毒好的材料放入无菌的培养皿内，在解剖镜下小心剥掉顶芽外面的幼叶，直至在解剖镜下能看清表面光滑呈圆锥形的茎尖为止，切取茎尖，长度为0.3～0.5。
2、茶用菊花茎尖外植体的培养和丛生芽的形成将茎尖在诱导培养基中培养，茎尖诱导培养基为MS+蔗糖3％+琼脂0.75％，pH 6.0即在1000ml培养基MS中加入30克的蔗糖和7.5克的琼脂。日光灯光源，每天连续光照12h，光照强度为2000～3000lx，培养温度(25±1)℃。培养4～6周后形成丛芽，茎尖诱导分化率达80％以上。
3、茶用菊花丛生芽的病毒检测当丛生芽的长度为2.5～3.5cm，具2～3片叶时，可将其切成单株，对由茎尖产生的每一个单株进行病毒检测，确认不带有病毒后，才可进行大规模的快速繁殖，生产脱毒种苗。
4、茶用菊花丛生芽的增殖将经过病毒检测确认不带有病毒后的单株转接到生根培养基上进行增殖，生根培养基是1/2MS+蔗糖3％+琼脂0.75％，pH 6.0即在500ml培养基MS中加入30克的蔗糖和7.5克的琼脂。培养条件同前。一般1周后伴随下部根形成的同时，上部植株健壮生长，茎粗、叶大、色绿。当植株长至6～8cm时，将植株切成带1～2个节的茎段进行增殖(茎段上的叶片去掉或仅1/3～1/4)。25～30天后，芽增殖系数达4～7倍。
5、茶用菊花增殖苗的生根和移栽当进行增殖获得一定数量的幼苗后，可将增殖苗切成带1～2个节的茎段，在上述生根培养基上进行生根。2周后生根率达100％，且生根数量多，根系粗壮。3周后当苗长至5左右，具有4～5片叶，5～6条根时，即可将试管苗进行适当炼苗，即将培养瓶拿出培养室，去掉封口膜，置于常温下炼苗3d。再从培养瓶中取出试管苗，再用清水洗净粘附在根系上的琼脂，即可移栽入由消毒泥炭与珍珠岩混合(1∶1)的基质，消毒泥炭与珍珠岩的重量比例可为但不限于1∶1。基质先用水淋透，然后用塑料薄膜覆盖保湿1周后，打开薄膜，每天用喷雾器喷雾3～5次保证基质潮湿和较高空气湿度。2周左右移栽成活，移栽成活率为95％以上。
利用茶用菊花无激素组织培养方法获得脱毒苗，对湿热环境适应能力强，其茎干挺立，花色纯正，质量提高1～2个等级，价值增加20％～40％，该研究国内外尚未见报道。跟国内外同类产品相比，我们的产品针对性强，利用脱毒茶用菊花组织培养苗为栽培材料，与传统的茶用菊花生产中采用分株、扦插等无性繁殖方法相比，获得的脱毒苗，既不含激素，还具有抗病性强、生长势旺、提纯复壮、高产等优点，有利于大规模种植获得绿色无公害保健茶用菊花。因此，在新型无公害茶用菊花的生产中，该方法及由该方法获得的脱毒苗提高了茶用菊花生产的科技含量，具有较强的竞争力，对实现茶用菊花的规范化种植，为茶用菊花的现代化生产得到高产量、优品质的新型无公害保健茶用菊花产品起到关键性的作用，具有较好的市场应用前景。
权利要求
1.一种茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法，其特征步骤是(1)茶用菊花茎尖外植体的获得将带顶芽的茶用菊花茎段消毒后，剥掉顶芽外面的幼叶，露出茎尖，切取茎尖；(2)茶用菊花茎尖外植体的培养和丛生芽的形成将茎尖在诱导培养基中养4～6周后形成丛生芽；(3)茶用菊花丛生芽的病毒检测当丛生芽的长度为2.5～3.5cm，对由茎尖产生的每一个单株进行病毒检测；(4)茶用菊花丛生芽的增殖将经过病毒检测确认不带有病毒后的单株转接到生根培养基上进行培养，当植株长至6～8cm时，将植株切成带1～2个节的茎段进行增殖；(5)茶用菊花增殖苗的生根和移栽将增殖后的幼苗在生根培养基上进行生根后，炼苗，取出试管苗，再用清水洗净试管苗的根系后，移栽入由消毒泥炭与珍珠岩混合的基质中培养即得到茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗。
2.如权利要求1所述茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法，其特征是步骤(1)中消毒是将茶用菊花茎段浸泡70％酒精20-50秒后，用无菌水冲洗，再用0.2％升汞消毒，无菌水冲洗，所述升汞消毒冲洗至少一次。
3.如权利要求1所述茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法，其特征是步骤(2)所述诱导培养基为MS+蔗糖3％+琼脂0.75％，pH 6.0。
4.如权利要求1所述茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法，其特征是步骤(2)所述培养为光照，每天连续光照10-14h，光照强度为2000～3000lx，培养温度24-26℃，培养时间4～6周。
5.如权利要求1所述茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法，其特征是步骤(4)所述生根培养基为1/2 MS+蔗糖3％+琼脂0.75％，pH 6.0，即在1000ml培养基MS中加入30克的蔗糖和7.5克的琼脂。
6.如权利要求1所述茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法，其特征是步骤(4)所述培养为光照，每天连续光照10-14h，光照强度为2000～3000lx，培养温度24-26℃，培养时间4～6周。
7.如权利要求1所述茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法，其特征是步骤(5)所述生根培养基为1/2MS+蔗糖3％+琼脂0.75％，pH 6.0，即在500ml培养基MS中加入30克的蔗糖和7.5克的琼脂。
8.如权利要求1所述茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法，其特征是步骤(5)所述生根培养后，当苗长至3-8厘米，具有4～5片叶，5～6条根后，再进行炼苗。
9.如权利要求1所述茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法，其特征是步骤(5)所述炼苗将培养瓶拿出培养室，去掉封口膜，置于常温下培养苗2-5天。
全文摘要
本发明公开了一种茶用菊花无激素组织培养获得脱毒苗的方法。它包括(1)茶用菊花茎尖外植体的获得；(2)茶用菊花茎尖外植体的培养和丛生芽的形成；(3)茶用菊花丛生芽的病毒检测；(4)茶用菊花丛生芽的增殖；(5)茶用菊花增殖苗的生根和移栽。本发明茶用菊花无激素脱毒组织培养苗的方法体系稳定，操作较易，增殖率和组培苗去病毒率高；获得的幼苗生根容易，健壮抗逆，抗病虫能力强，成本比常规低50％左右，且开花整齐，鲜花质量高，栽培管理较容易。
文档编号C12N5/04GK1843094SQ20061001898
公开日2006年10月11日 申请日期2006年4月30日 优先权日2006年4月30日
发明者蒋细旺, 魏传斌, 王忠民 申请人:江汉大学