专利名称：检测黑麦草腥黑穗病菌的引物、探针及方法
技术领域：
本发明涉及农业和植物检疫，尤其涉及一种黑麦草腥黑穗病菌的检测方法，以及该检测方法使用的引物与探针。
背景技术：
小麦印度腥黑穗病菌(Tilletia indica Mitra)是世界关注的危险性有害生物，也是我国对外公布的一类危险性有害生物，主要分布在印度、巴基斯坦、伊朗、伊拉克、尼泊尔、阿富汗、巴西、墨西哥、美国和南非等地。黑麦草腥黑穗病菌(Tilletia walkeri)是类似小麦印度腥黑穗病菌的新种，近年随着粮食市场的开放，进口粮食数量的不断增加，黑麦草腥黑穗病菌传入的机会和风险也增加了，特别是主要粮食出口国美国也有黑麦草腥黑穗病菌的发生，给我国口岸检疫带来病菌检测的新难题。目前常用的检测和鉴定方法是形态特征鉴定和常规PCR技术。形态特征鉴定需要丰富的经验和一定数量的病菌冬孢子。常规PCR技术需要冬孢子萌发培养繁殖得到菌丝，整个处理和鉴定的过程长达2-3周，而且冬孢子休眠和不具存活力也影响病菌的鉴定。如果直接检测孢子，从孢子中提取DNA再PCR检测，需要的孢子量比较大，在实际的检测过程中难以得到大量的孢子，而且实际的样品中可能存在几种病菌孢子。因此以上两种鉴定方法的实用性受到一定的限制。
Frederick等(2000)报道了利用TaqMan探针进行小麦印度腥黑穗病菌实时荧光PCR检测方法。章桂明等(2002)也建立了小麦印度腥黑穗病菌的实时荧光PCR检测方法(未发表)。已报道的实时荧光PCR方法的探针都是针对小麦印度腥黑穗病菌的线粒体序列，而线粒体序列的变异速率比核糖体序列变异速率更大，核糖体序列更为保守和稳定。因此，针对黑麦草腥黑穗病菌的核糖体序列设计特异性探针，建立黑麦草腥黑穗病菌的实时荧光PCR检测方法，可达到快速、准确地检测与鉴定的效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供用于检测黑麦草腥黑穗病菌的引物。
本发明要解决的技术问题之二是提供用于检测黑麦草腥黑穗病菌的探针。
本发明要解决的技术问题之三是提供一种检测黑麦草腥黑穗病菌的方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了用于检测黑麦草腥黑穗病菌的引物，它包含15个或更多个连续核苷酸的一条链或其互补链，其中一个或多个核苷酸是SEQ ID NO.1序列的32、57、258、277中任何位点的核苷酸。
较佳地，所述引物含有5’-TTCTCTTTTATCCCAACACCAAACT-3’或其互补链；5’-CTTATCGCATTTCGCTGCG-3’或其互补链。
在本发明的另一方面，提供了用于检测黑麦草腥黑穗病菌的探针，它包含15个或更多个连续核苷酸的一条链或其互补链，其中一个或多个核苷酸是SEQ ID NO.1序列的67、78、82中任何位点的核苷酸。
较佳地，所述探针含有(FAM)-CGGAAGGAACAAGGC-(MGB)或其互补链。
在本发明的另一方面，提供了一种检测黑麦草腥黑穗病菌的方法，包括如下步骤(1)提取冬孢子DNA；(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6序列的引物进行第一轮PCR扩增；(3)以步骤(2)的PCR产物为模板，用权利要求1所述的引物进行实时荧光PCR扩增；(4)分析步骤(3)的实验结果。
较佳地，步骤(3)中所述的引物为具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3序列的一对引物。
由于采用上述技术方案，本发明的检测黑麦草腥黑穗病菌的方法使检测时间大大缩短，八个小时内即可完成检测，而传统的检测方法需二至三周以上，且本发明单个冬孢子就可检测，灵敏度有效提高，而传统的检测方法需100个孢子以上，此外，本发明能同时检测两种病菌冬孢子，而传统的常规检测方法不能同时检测两种病菌冬孢子。
图1是本发明的检测黑麦草腥黑穗病菌的流程图；图2是本发明的引物和探针位置图；图3是本发明的单个冬孢子的实时荧光PCR检测实验结果图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
针对病原菌ITS(internal transcribed spacer，核糖体基因的转录间隔区)序列的特异性位点差异(G/A)，设计了检测黑麦草腥黑穗病菌的TaqMan-MGB(Minor Groove Binder)探针TWAL，建立了单个冬孢子的real time PCR检测技术，图1为检测黑麦草腥黑穗病菌的技术流程图。
检测原理见图2所示，在黑麦草腥黑穗病菌的核糖体序列中设计特异性引物和TaqMan-MGB特异性探针，它们的序列如下上游引物D-FPa5’-TTCTCTTTTATCCCAACACCAAACT-3’(SEQ IDNO.2)；下游引物T-RPb5’-CTTATCGCATTTCGCTGCG-3’(SEQ ID NO.3)；黑麦草腥黑穗病菌探针TWAL(FAM)-CGGAAGGAACAAGGC(MGB)(SEQID NO.4)。
检测黑麦草腥黑穗病菌的步骤如下1)冬孢子DNA获取准备灭菌的干净盖玻片块(2mm×2mm)，将单个冬孢子挑至一个盖玻片小块上，用另一个盖玻片小块盖住，轻轻按压盖玻片小块使孢子破裂，最后将两个盖玻片小块一起转移至盛有PCR反应液的PCR小管中进行扩增。
2)第一轮扩增利用引物Til1(5’-AAGGTTTCTGTAGGTGAACCT-3’)(SEQ ID NO.5)/Til4(5’-GATATGCTTAAGTTCAGCGG G-3’)(SEQ ID NO.6)进行PCR扩增20个循环，PCR反应总体积为30μl，包含10mmol/L Tris-HCl；50mmol/L KCl(pH8.3)；1.5mmol/L MgCl2；dATP，dGTP，dCTP，dTTP浓度为100μmol/L；引物浓度100nmol/L；0.5U Taq DNA聚合酶(宝生物工程有限公司)。加双蒸水至终体积为30μl，混匀离心，置于PCR仪进行扩增。取产物1μl进行实时荧光PCR扩增。
3)实时荧光PCR检测实时荧光PCR扩增体系25μl(大连宝生物工程有限公司TaKaRareal-time PCR core kit)5×real time PCR Buffer(Mg2+free)5μl，Mg2+solution(250mmol/L)0.5μl，dNTP mixture(各10mmol/L)0.75μl，TaKaRa Ex-Taq HS(5U/μl)0.25μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μl，TaqMan-MGB探针(5μmol/L)0.6μl，DNA(10～20ng/μl)模板0.5μl，超纯水补至25μl，实时荧光PCR扩增在ABI PRISM 7700定量PCR扩增仪上进行。两步法扩增反应程序50℃ 2min，预变性95℃10min；然后95℃ 15s，65℃ 1min循环40次。反应用水作空白对照，用黑麦草腥黑穗病菌的菌丝DNA为阳性对照，用腥黑粉菌以外的真菌DNA作为阴性对照。
4)检测实验结果如图3所示，定量PCR仪检测到以黑麦草腥黑穗病菌的菌丝DNA为模板的阳性对照FAM荧光信号增长，阴性对照和空白对照都没有荧光信号增长，而样品的检测结果是FAM荧光信号增长，表明检测到的真菌是黑麦草腥黑穗病菌。在图3中，有2条上升的曲线，其中，左边数字标号为2的一条曲线代表黑麦草腥黑穗病菌的单个冬孢子的检测结果，右边一条数字标号为4的曲线代表作为阳性对照的黑麦草腥黑穗病菌的菌丝DNA的检测结果，数字1曲线是小麦印度腥黑穗病菌的单个冬孢子的检测结果，数字3曲线代表作为阳性对照的小麦印度腥黑穗病菌的菌丝DNA的检测结果，数字5曲线是没有模板DNA的阴性对照，由图3表明此次实时荧光PCR检测到的真菌是黑麦草腥黑穗病菌。
序列表<110>上海出入境检验检疫局<120>检测黑麦草腥黑穗病菌的引物、探针及方法<130>NP-10482<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>300<212>DNA<213>Tilletia walkeri<400>1atcattagtg aattacggag ctcttcttcg gaagagtctc cttctctttt atcccaacac 60caaactacgg aaggaacaag gccttgcgct gagtacctgt ccggatggaa cagagttgct 120agtacttcgg tattggcagc gctgctccaa cccttttaaa cacttaagaa ttaaagaatg 180ttaaaactat tgtcttcgga cataaactaa tatacaactt ttgacaacgg atctcttggt 240tctcccatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt 300<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2
ttctctttta tcccaacacc aaact 25<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3cttatcgcat ttcgctgcg19<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<400>4cggaaggaac aaggc15<210>5<211>21<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5aaggtttctg taggtgaacc t 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6gatatgctta agttcagcgg g 2权利要求
1.用于检测黑麦草腥黑穗病菌的引物，其特征在于，它包含15个或更多个连续核苷酸的一条链或其互补链，其中一个或多个核苷酸是SEQ IDNO.1序列的32、57、258、277中任何位点的核苷酸。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，它含有5’-TTCTCTTTTATCCCAACACCAAACT-3’或其互补链。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，它含有5’-CTTATCGCATTTCGCTGCG-3’或其互补链。
4.用于检测黑麦草腥黑穗病菌的探针，其特征在于，它包含15个或更多个连续核苷酸的一条链或其互补链，其中一个或多个核苷酸是SEQ IDNO.1序列的67、78、82中任何位点的核苷酸。
5.如权利要求4所述的探针，其特征在于，它含有(FAM)-CGGAAGGAACAAGGC-(MGB)或其互补链。
6.一种检测黑麦草腥黑穗病菌的方法，其特征在于，它包括如下步骤(1)提取冬孢子DNA；(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6序列的引物进行第一轮PCR扩增；(3)以步骤(2)的PCR产物为模板，用权利要求1所述的引物进行实时荧光PCR扩增；(4)分析步骤(3)的实验结果。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的引物为具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3序列的一对引物。
全文摘要
本发明公开了用于检测黑麦草腥黑穗病菌Tilletia walkeri的特异引物和探针，以及运用该引物和探针进行黑麦草腥黑穗病菌检测的方法。本发明的检测黑麦草腥黑穗病菌的方法使检测时间大大缩短，灵敏度大大提高，单个冬孢子就可检测，且本发明能同时检测两种病菌冬孢子，进一步提高了检测效率。
文档编号C12N15/11GK101054600SQ20061002568
公开日2007年10月17日 申请日期2006年4月13日 优先权日2006年4月13日
发明者易建平, 周国梁, 印丽萍 申请人:上海出入境检验检疫局