真菌药敏板条及其制备方法

专利名称：真菌药敏板条及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物制剂技术领域。具体涉及一种真菌(MY)药敏板条及其制备方法。
背景技术：
近20年来，由于临床上广泛大量地使用种类繁多的抗菌药物，细菌的耐药性越来越普遍，有的细菌可同时耐2-7种药物，耐药菌株的广泛传播给临床治疗带来很大困难。加之临床诊治手段不断更新，虽然提高了诊断和治疗效果，但也带来了更多的交叉感染机会，使机体的免疫状态趋于低下。尤其引人注目的是感染类型发生了很大的变迁，而且正处于变化之中，为了适应这种新的变化，研究新情况，解决不断出现的新问题，逐渐形成了一门新学科--临床微生物学(Clinical Microbiology)。
近些年来，医院感染(Nosocomial infection)越来越成为人们十分关注的问题之一。所谓医院感染是指病人在住院期间出现的及出院不久才发病的感染，但不包括病人在入院前已开始的或入院时已处于潜伏期中的感染。医院感染的特点在于是出现在医院环境中的感染，并发生流行，故又可将其称为医院获得性感染(Hospital acquired infection)。1983年卫生部调查了21所医院11,295例病人，医院感染的发生率平均为8.4％。虽然发生医院感染的病情有轻有重，但都给病人增加了额外的痛苦、经济负担和不幸，同时也会由于延长住院时间而加重医疗和护理工作的负担，影响病床周转。严重的医院感染往往使病人所患的疾病不能达到预期的疗效，甚至产生难以治疗的后遗症或死亡。据美国的一次不完全统计资料报告，其住院病人中约有5％发生医院感染，平均延长住院4～5d，每年约有10万人死亡于医院感染，估计每年由于医院感染要多消耗20余亿美元。
从引起医院感染的微生物来看，固然有些仍是我们所熟悉的致病性很强的微生物，它们常在一些疾病之后引起合并症感染，但是近年来医院感染的病原体种类有明显变化的趋势，革兰氏阴性菌已取代了原来为主要病原的革兰氏阳性球菌，其中真菌科及假单胞菌约占医院感染的60％-65％，并且主要为多耐药性细菌。其中大部分为人体正常菌群、真菌和病毒，寄生虫方面也有一些报道。
就整个社会来说，医院是个易感宿主，因为免疫力低下的患者集中(包括婴幼儿与老年人)，诊断手段的不断更新(如内窥镜、插管、导管等的应用)，虽然提高了诊断和治疗效果，也增加了交叉感染的机会。由于广泛地应用抗生素，细菌的不断变迁，助长了医院内感染的存在和发展，今日的临床微生物学最重要的特点是向医院感染方面转变。
微生物鉴定及药敏分析系统是主要应用于临床实验室的高科技体外诊断产品，对辅助临床各科室诊断治疗具有重要意义。目前在国际上，对细菌的快速鉴定和药敏分析已经取得了很大的进展，微生物自动化检测产品逐步替代了手工检测。
目前，国际上同类产品主要有法国生物-梅里埃公司的VITEK-AMY微生物分析系统、美国Dade-MicroScan公司的MicroScan自动微生物鉴定和药敏测试系统以及英国Trek Diagnostic System Ltd.的SENSTITRE荧光法快速微生物鉴定和药敏分析系统。它们的工作原理相近，主要是根据细菌理化性质的差异，采用光电比色(药敏是比浊法)，测定细菌生长分解底物导致PH值改变而产生的不同颜色和浊度变化来判断反应情况，从而给出鉴定药敏结果。
目前，为适应临床实验室对微生物鉴定药敏设备的专业需求，市场对微生物系统产品的功能提出了更高的要求，开发操作简便、鉴定范围广、药敏MIC值准确实用、并可以快速给出实验结果的微生物产品已成为一种迫切要求。
BIOLOG公司的微生物鉴定系统虽然可以较为准确地鉴定微生物菌种，但缺少药敏(抗生素MIC)检测，而在做微生物检验产品的临床推广时，一般都要求系统同时具备鉴定菌种和检测抗生素的MIC(最小抑菌浓度)值两种功能，以指导临床用药。为满足市场需求，并在竞争中占据优势。
并且现在产品的药敏板条种类较少，不能满足各种类型细菌的药敏试验，另外板条中抗生素的浓度梯度较少，大部分只可报告定性的敏感、中度敏感和耐药结果，而不能准确的报告出定量的MIC值。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种快速准确的药敏检测系统。
本发明提供了一种真菌(MY)药敏板条。
本发明的药敏检测试验基于下列原理根据每一种药物生长斜率与MIC(最小抑菌浓度)的线性关系，选择适当数目的稀释度，加入待检细菌的菌悬液，经4-15h孵育后，应用光电比浊原理，即可得到待检菌在各浓度的斜率，与阳性对照孔斜率相比，并计算出待检菌的复合斜率，经回归分析得到MIC值，并根据NCCLS标准获得相应敏感(S)、中度敏感(I)和耐药(R)的结果。
另一方面，本发明人经过大量的试验研究，对药敏板条的稳定性进行了改进。因为在本发明的药敏板条中加入了抗生素，由于抗生素本身性能极易发生氧化，在短时间就可失效，给药敏板条存贮造成了很大影响。因此本发明选用抗氧化剂加入药敏板条中来延长药敏板条的保存期。
抗氧化剂(AOA)，是一类能够抑制或阻断自由基链式反应的启动和增生(蔓延)过程，降低自由基浓度，延缓哀老进程，提高生命活力的化合物抗氧化剂和自由基是一对矛盾体。抗氧化剂的分子结构比较特殊，它的电子是单个排列的，它可以给出电子中和自由基，而自身不会形成有危害的物质，也不会发生链锁反应，通过清除自由基达到抗氧化的目的。抗氧化剂如何工作1.正常氧原子具有4对电子，机体正常代谢可使原子失去一个电子，这样就形成了自由基，自由基主要通过抢夺其它他分子上的电子而使自己配对。
2.当自由基从细胞膜上夺取一个电子后，就产生了另一个新的自由基，并开始了链反应。
3.电子夺取链反应侵蚀细胞膜，导致细胞完整性的丧失为癌症及其它疾病打开了方便之门。
4.由于其特殊的分子结构，抗氧化剂能给出一个电子给自由基而自身不会形成有害的能引发链反应的危险物质。
常见的抗氧化剂有VC、VE、硒、锗、巴比妥、甘氨酸、亚硫酸氢钠、茶多酚类、香辛料提取物。
氨基酸和二肽类氨基酸如蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等都能与金属离子螯合，所以它们良好的辅助抗氧化剂。近年来，食品科学工作者发现，丙氨酸末端为氮的9种二肽比任何一种氨基酸的抗氧化能力都强。其中尤以丙氨酸-组氨酸、丙氨酸-酪氨酸、丙氨酸-色氨酸3种二肽抗氧化能力最强，值得大力开发。
香辛料提取物早在20世纪30年代，人们就开始对香辛料的抗氧化作用进行研究。到50年代，科研人员对32种香辛料进行分析，发现其中抗氧化性能最好的是迷迭香和鼠尾草。这类产品多含有黄酮类、类萜、有机酸等多种抗氧化成分，能切断油脂的自动氧化链、螯合金属离子，并起到与有机酸的协同增效作用。迷迭香(Rosmarinus officinalisL.)为唇形花科，属常绿多年生灌木，具高抗氧化能力之香药植物。其抗氧化能力来自于内含的酚类物质(phenolics)，其中以phenolic diterpenes为主要，如鼠尾草酸(carnosicacid)、鼠尾草苦内酯(carnosol)、迷迭香酸(rosmarinic acid)等迷迭香提取物天然无毒，抗氧化功效远远高于现有的VC、VE、茶多酚等天然抗氧化剂，比人工合成的氧化剂BHT和BHA的抗氧化能力强4倍多，且其结构稳定、不易分解。因此迷迭香抗氧化剂是新一代纯天然抗氧化剂，彻底避免了合成抗氧化剂的毒副作用和高温分解的特点。
本发明人通过下列试验1、实验依据复星佰珞公司根据绝大多数临床实验室的常规需要和美国临床实验室标准化委员会出版的临床微生物实验室常规药敏试验和报告时的选药指南，对抗生素进行选药组合，生产了针对真菌的MY板条。MY药敏板条选用了8种抗生素，涵盖了临床上所有最新的及基本的抗生素，提供了12个梯度MIC值。此板条的浓度梯度表如下12 3 45 6 7 8 9 10 1112

ABCD

注阴影之间是药物敏感和耐药间的范围。(参考NCCLS2002标准)1、克霉唑ClotrimazoleCLO2、酮康唑KetoconazoleKET3、两性霉素B Amphotericin B AMB4、伊曲康唑 ItraconazoleITR5、氟康唑Fluconazole FLZ6、5-氟孢嘧啶Flucytosine FLSPOS＝positive controlNEG＝negtive control根据NCCLS标准我们选取标准菌株ATCC 90028白色念珠菌、ATCC 22019近平滑念珠菌对MY板条进行测试，各抗生素的MIC值必须符合以下标准，若测试结果抗生素的MIC值超出范围，则判断该抗生素失效。

2、实验方法分别采用了巴比妥、甘氨酸、和迷迭香做为抗氧化剂配置成水溶液和不加抗氧化剂的水溶液加入抗生素中置成药敏板条，-10℃进行贮存。选取标准菌株29213加入药敏板条进行测试，初次测试4种板条的抗生素MIC值全部在规定范围内。第一个月每周进行一次检测，从每二个月起每两周进行一次检测，六个月后每隔一个月进行一次检测，至到所有抗生素均失效。每次测试每种板条共测试十次。
3、板条操作方法(1)、取ATCC90028、ATCC 22019用理盐水配置0.5麦氏菌悬液，将菌悬液与IY肉汤培养液按1∶200倍进行稀释(即每12ml肉汤加入60ul菌悬液)。
(2)、将配置好的菌液用移液器加入药敏板条中，每孔加100ul。
(3)、将板条放置25℃培养箱培养24小时。
(4)、读取板条结果，若孔中出现混浊为生长，若不混浊为不生长，每种抗生素第一个不生长孔的浓度值即为正确的MIC值。
3、实验结果本次实验共进行了一年，实验结果如下表所示

4、结果分析试验结果表明(1)、使用巴比妥、甘氨酸抗氧化剂，板条在一个月后某些抗生素就出现了失效，表明此两种抗生素不仅延长药敏的保存期，反而会影响抗生素的性能，缩短了板条的贮存时间。故此两种抗氧化剂不能选用。
(2)、使用迷迭香抗氧化剂抗生素在十个月以后才有某些抗生素出现失效，明显比不加抗氧化剂的板条保存时间长。故使用迷迭香做为抗氧化剂加入药敏板条来延长药敏板条的保存期是可行的。
本发明的另一目的是提供了真菌药敏板条的制备方法，该方法包括下列步骤(1)配置抗生素稀释液蒸馏水中加入(迷失香抗氧化剂)浓度为蒸馏水的十万分之一到百万分之一配置成水溶液作为抗生素的稀释液待用；(2)分装将配置好的稀释液分装为每试管15ml待用；(3)配置原液根据稀释要求配置各种抗生素的初始原液；(4)分装液料根据各种板条浓度稀释要求，将步骤(3)的抗生素原液加入到相应的分装好的步骤(2)试管中。
(5)加样分装板条使用分装系统在96孔的相应位置对指定的药敏板条加样，每孔加50ul；(6)板条干燥上述板条真空干燥16-18小时；(7)包装上述抗生素的浓度稀释要求原液药品经配制后的初始溶液(一次)稀释液原液稀释10倍所得溶液，即100ul原液与900ul溶剂混合而成(二次)再稀释液稀释液再稀释10倍所得溶液，即100ul稀释液与900ul溶剂混合而成(三次)极稀释液再稀释液稀释10倍所得溶液，即100ul再稀释液与900ul溶剂混合而成MY板条各抗生素的初始溶液浓度如下表所示


抗生素溶液在96孔的位置如下






板条在进行细菌操作加入100ul的细菌菌悬液后，板条中抗生素最终浓度如下(单位为ug/ml)
MY板条药敏浓度梯度表 注阴影之间是药物敏感和耐药间的范围。(参考NCCLS2002标准)1、克霉唑ClotrimazoleCLO2、酮康唑KetoconazoleKET3、两性霉素B Amphotericin B AMB4、伊曲康唑 ItraconazoleITR5、氟康唑Fluconazole FLZ6、5-氟孢嘧啶Flucytosine FLSPOS＝positive controlNEG＝negtive control本发明产品与已有的微生物检验产品相比，更具临床用药指导意义，可以减少耐药菌株的滋生，并降低院内各种感染。其配套的微生物鉴定药敏分析系统可根据不同的统计条件，在一段时期内，对医院各病区、该人群区域及周边地区作出流行病学上的分析，并对特殊耐药菌株的变异及疾病的防治起到监控的作用，有较大的临床应用价值。
具体实施例方式实例现以真菌MY板条为例，批量生产250块产品的生产工艺流程如下
1、配置迷迭香水溶液称取0.03克迷迭香(迷迭香最终浓度为十万分之一)充分溶解到1500ml去离子水中。
或称取0.3克迷迭香(迷迭香最终浓度为万分之一)充分溶解到1500ml去离子水中。
或称取0.003克迷迭香(迷迭香最终浓度为百万分之一)充分溶解到1500ml去离子水中。
2、将配置好的溶液高压灭菌，然后均匀分装到消毒好的96根试管中，每管分装15ml。
3、配置各抗生素初始液。
按照下表的浓度配置各抗生素的初始液

4、配置各孔抗生素溶液按照下表的的抗生素浓度稀释表按表中显示的体积加入板条的96根分装待用的15ML试管中。
备注1、以上单位全部是ul2、黑体字表示用原液稀释10倍即100ul原液+900ul蒸馏水稀释液。
3、斜体字表示用稀释液再稀释10倍即100ul稀释液液+900ul蒸馏水4、下划线代表是将斜体再稀释10倍，即100ul再稀释液+900ul蒸馏水5、加样分装板条将配置好的96根试管装在加样机上，使用加样机对指定的药敏板条加样，每孔加50ul。(在这之前要先运行分装系统；整个程序大约需要3个小时)。
6、板条干燥将加样好的板条放入干燥间的真空泵中进行真空抽干，16-18小时后板条可干燥完毕。
7、板条包装将干燥好的板条从干燥间经传递窗送到包装间进行包装。
8、板条存贮包装完毕的板条放入-20℃冰箱进行冷冻保存。
权利要求
1.一种真菌药敏板条，其特征在于该真菌药敏板条由下列方法制得的(1)配置抗生素的稀释液蒸馏水中加入迷迭香抗氧化剂，加入的浓度为蒸馏水的十万分之一到百万分之一，配置成水溶液，作为抗生素的稀释液待用；(2)分装将配置好的稀释液分装为每试管15ml待用；(3)配置原液根据稀释要求配置各种抗生素的原液；(4)分装液料根据板条浓度稀释要求，将步骤(3)的抗生素原液加入到相应的分装好的步骤(2)试管中；(5)加样分装板条使用分装系统在96孔的相应位置对指定的药敏板条加样，每孔加50ul；(6)板条干燥上述板条真空干燥16-18小时；(7)包装。
2.一种如权利要求1所述的真菌药敏板条的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)配置抗生素的稀释液蒸馏水中加入迷迭香抗氧化剂，加入的浓度为蒸馏水的十万分之一到百万分之一，配置成水溶液，作为抗生素的稀释液待用；(2)分装将配置好的稀释液分装为每试管15ml待用；(3)配置原液根据稀释要求配置各种抗生素的原液；(4)分装液料根据板条浓度稀释要求，将步骤(2)的抗生素原液加入到相应的分装好的步骤(2)试管中；(5)加样分装板条使用分装系统在96孔的相应位置对指定的药敏板条加样，每孔加50ul；(6)板条干燥上述板条真空干燥16-18小时；(7)包装。
3.根据权利要求2所述的真菌药敏板条的制备方法，其特征在于其中所述步骤(4)分装液料为原液药品经配制后的初始溶液(一次)稀释液原液稀释10倍所得溶液，即100ul原液与900ul溶剂混合而成(二次)再稀释液稀释液再稀释10倍所得溶液，即100ul稀释液与900ul溶剂混合而成(三次)极稀释液再稀释液稀释10倍所得溶液，即100ul再稀释液与900ul溶剂混合而成MY板条各抗生素的初始溶液浓度如下表所示
步骤(5)加样分装板条中的各抗生素稀释时原液用量和在96孔的分装位置如下
4.根据权利要2所述的一种真菌药敏板条的制备方法，其特征在于通过该方法制得的真菌药敏板条在进行细菌操作加入100ul的细菌菌悬液后，板条中抗生素最终浓度如下单位为ug/mlMY板条药敏浓度梯度表 注阴影之间是药物敏感和耐药间的范围。
全文摘要
本发明公开了一种真菌药敏板条。本发明的药敏板条的抗生素是根据临床的需要及规范标准进行选药组合，并选用抗氧化剂延长药敏板条的保存期，使板条的存贮更方便。本发明的产品具临床用药的指导意义，有较大的临床应用价值。
文档编号C12Q1/18GK101058825SQ200610025919
公开日2007年10月24日 申请日期2006年4月21日 优先权日2006年4月21日
发明者王顺林, 邹艳芳, 朱骏娜 申请人:上海复星佰珞生物技术有限公司