专利名称：检测高脂血症易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病易感性检搠用的试剂盒，尤其是一种检拥商鹿血症易-性的试剂食，通过同时检 洒血浆胆固醉豳转移蛋白基因'(cholesteryl ester transfer protein, plana, '.CEl ).的单核劳酸多东 性(SNP)位点与脂蛋白脂酶基因(lipoprotein lipase, LPL)的单核苷酸多審性位点来预测^对离鹿 血症的易感性。
背景技术：
由于脂肪代谢或运转异常使血浆中一种或几种脂质离于正常称为离簾lflue(byperlipiiJ挪ia),可表现 为高胆固醉血症(hyperchoesterolemia)、髙甘油三酯血症(hypertriglycerid一ift〉戒两者兼有(混合型 髙脂血症)。脂质不溶或微溶于水，必须与蛋白质结合以脂蛋白形式存在，才l^血被糖环中运转，因此, 高脂血症常为布脂蛋白血症(hyperlip邻rotein棚ia)的反映。由于逐渐认识到臘浆中Att度牖蛋'白降低也 是一种血脂代谢紊乱，因而称之为血脂异常(dyslipid棚ia)更为全面、准确地，jfijg代谢紊乱状态，目 前冊0将高脂蛋白血症分为五大类，主要为根据血浆脂蛋白升离的程度不同进行的表塞分类:家族性离乳糜傲粒血症(家族性离甘油三酯血症)、家族性髙胆固醉血症(家族性离e脂蛋白血症)、家族性异常e脂 蛋白血症、高前e脂蛋白血症、混和型离甘油三醮血症(混和性离脂血症)。脂蛋白的蛋白部分是一种特殊蛋白，因与脂质结合担负在血浆运转月皆类的功能，故称为載脂蛋白(apoprotein),载脂蛋白除了与脂质结合形成水搏性物质,成为转运脂类的載体以外，还有其他械功能, 尤其是参与酶活动的调节，以及参与脂蛋白与细胞腆受体的识别和结合反应.血浆中的脂蛋白呈徵粒状， 核心主要为甘油三酯和胆固醉醮，外层由磷脂.、胆固酵、载脂蛋白构成。水溶性酶可透Si表层进入内层起 作用。脂蛋白的代谢有两条途径①外源性代谢途径是指饮食摄入的胆固酵和甘油三醮在小肠中合成CM 及其代谢过程；②内源性代谢途径是指由肝合成的VLDL转变为IDL和、LDL，以及LDL被肝或其他器官 代谢的过程。其中乳糜微粒CM不能进入动脉壁内， 一般不致动脉粥样硬化，但易诱发鹰腺炎。血莱极低费度脂蛋 白VLDL水平升髙是冠心病的危险因素，低密度脂当白LDL容易进入动脉壁并Vm化修饰，是主要的致动 脉粥样硬化的因素.高密度脂蛋白HDL水平升高有利于外周组织移除胆齒醉，防止动脉粥样硬化发生，高脂血症(高脂蛋白血症)临床上可分为两类①原发性，厲逮#^脂代 ^乱疾病；，发性，常 见于控制不良的糖尿病、饮酒、甲状腺功能减退症、肾病练合征、透析、肾移植、胆堪扭塞、口康避孕药 等.血脂异常与心血管病，尤其与冠心病的发生和发展密切相关，是代谢综合癍的组成成分之一。已知部分原发性髙脂血症是由先天性基因缺陷所致，如LDL受体基因缺陷可引起家族性商胆圃醉血症，而常见继发性高脂血症病因有下列几种1、 离胆固醉血症糖尿病、肾病综合症、甲状腺功能减填、Cushing练合症2、 髙甘油三醮血症糖尿病(未控制)、肾病综合症、尿毒症(透析时)、肥自、雌撒素治疗、糖原贮 积症(I型)、饮酒、系统性红鄉疮、异常Y-球蛋白血症、痛风；3、 高异常脂蛋白血症各种原因引起的肝内外胆道梗阻、胆汁淤积性肝胆病、包括肝内胆小管性肝炎、 胆汁性肝硬化。我国人群血脂平均水平低于发达国家，但其升布帼度却很惊人。我国对不同地区9组人群，从20世 纪80年代初至90年代末的20年间进伃了 3次可比性调査，结果表明血演凝JiaW(TC) >5.2(tool/ L(200呢/dl)，男性患病率由17%连续上升至33%,女性患病率由9%连续上升至32%, S此，积极检出'、 预防和控制血脂异常成为经济发达地区心血管病预防工作的主要内容之一。SNP (single nucl的tide polymorphism)，即单核苷龄态蹄记，是一类軒单 $异弓1 的DNA 多态性，被遗传学界称为第三代遗传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序判多态性， 包括单IC基转换、瞎换，以及单碱基的插入/缺失等，它是基因组中最为广泛存在的一类多态性标记，占 大约90%。这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感性、和对环境因素、药物反应的差异.CETP(cholesteryl ester transfer protein, plasma )是血浆胆囲醉鹏转移蛋白编码基因，由该基 因鳊码的蛋白是脂代谢中重要的转运蛋白之一，它主要介导胆固酵的逆向转运过程，即在离崈度脂蛋白 (HDL)颗粒与其他脂蛋白或细胞膜之间不断地进行脂质成分交换的同时増加胆固糖从组织细鹿中流出转 运至肝脏的过程，近年来研究认为CETP基因上的多态现象与多种异常脂蛋白血症(异裙P脂蛋白血症， 家庭性离胆固醉血症和混合型商脂蛋向血症〉，肥胖、糖尿病、肾病综合征以及AS型心擴血管疾病等因素 相关。CETP基因的缺陷可以引起HDL中CE蓄积、TC降低VLDL、 LDL中的CE减少，TC塌加.而CETP活 性增加，脂肪摄取过多易沉积于肝，更多富含CE和LDL颗粒和VLDL残粒集聚于血浆中，过多的LDL就荣 集在动脉壁细胞内，导致CE沉积于动脉壁内，从而引发多种症状。国内外大样本研究均表明CBTP基因上 的rsl7237904号SNP位点(SEQ ID NO: 1所示序列中146位)基因型与血浆离密度脂蛋白胆困.醉水平的 升S有显著关系，rsl7237904号位点是位于第16染色体上CETP基因第1内含子的,切位点T叫IB处的 一个的G/A多态SNP位点，低频等位基因A即为国内外文献中常见的T叫IB的B2位点，可以PMfe血浆内 胆糊酵脂转运蛋白的浓度，抑制髙密度脂蛋白向低密度脂蛋白的转化，因此对于心脑血管疾病的发生有一 定的保护作用。LPL基因编码脂蛋白脂酶，该酶在心脏、肌肉和脂肪组织中进行表达。LPL以同型二聚体蛋白的形式 行使功能，其分子生物学的作用包括两部分，一部分为甘油三脂的水解,作用，另一部分则是受体介导的 脂翠白内吞作用的桥梁。LPL蛋白上的位点突变在严重的情况下可以导致I型离脂蛋白血症，而较轻ga 上则引起体内脂蛋白代谢的紊乱.LPL基因上rs320位点(SEQ ID NO: 1所示序列中118位)是位于第八 号染色体8p22上的脂蛋白脂錄LPL第八号内含子的多态，由T到G的改变使屎有的HiildIII瞎切位点消 失，国内外研究表明LPL的HindIII位点与血flgTlC平相关。大样本的中国人群的关联分折(共3000多例) 结果显示带有H—单倍型的个体具有更低的甘油三脂水平和更髙的髙密度脂蛋白胆圃瞎水平，可齙是保护 个体不受到血脂异常危害的单倍型。国内外的大量的关M析表明.CETP基因上的rsl7237恥4号SNP位点基因型为A时能够降低布脂血 症的发生；LPL基因上rs320号SNP位点基因型为T时能够降低甘油三脂水平，保护个体不受對血脂异常 的危害。这两个SNPs位点的多态性可用于评估个体对髙脂血症的易感性，目前己通过中国科学院理家生 物基因检測技术应用评估认证中心的认证。发明内容基于CETP基因上的rsl7237904号SNP位点和LPL基因上rs320号SNP位点的多态性可用于评估个体 对布脂血症的易感性的基础上，本发明提供一种检測高脂血症易感性的试剂盒，该试剂盒包括检測CETP基因SEQ ID NO: 1中第146位SNP的特异性引物对及特异性荧光探针、检 渕LPL基因S印ID NO: 2中第118位SNP的特异性引物对及特异性荧光探、Taq酶、(WiP混合液、MgCl， 溶液、荧光定豕PCR反应缓沖液、去离子水，本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对SEQ ID NO: 1中第146位SNP与SEQ ID NO: 2中第118位 SNP位点而设计，能特异性扩埔出SEQ ID NO: 1中包含第146位SNP位点的DNA片段与SEQ ID NO: 2中 包含第118位SNP位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的*优选地， 试剂盒中包含具有S印ID NO: 3和4所示序列的引物对以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物对， 特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这两对引 物。本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID亂1中第146位SNP与SEQ ID恥2中第118 位SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检測出这两个SNPs位点敏。痛S錄籌因1WI探针， 设计这类探针是本领域技术人员能够轻通完成的.优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 7和S所示序 列的T叫ioan探针。特异性荧光探针可用常规的合成技术进行合成.本领域的技术人员il够理解，本发明
的特异性荧光探针不限千这两条探针，所有可用于荧光定量PCR检抓SEQ ID NO: 1中第146位SNP与S印 ID NO: 2中第118位SNP位点的探针均在本发明范围内。
本发明试剂盒的组分和含量包括lul 10 X荧光定量PCR反应缓冲液，0. l|il 25ndl dNTP混合液，0. 5 tl 25mM HgCl,柳，0.02|il (5unitsAi1) Tag DNA聚合瞎，20MM特异性引物对(四条)各0,225iil，IOHM特异性荧光探针(两条)各0.25ji1,去离子水4.98ji1,本试剂盒供一人份检測应用，试剂盒的保存温度为-201C。
具体实施方式
卜'面结合具体实施例，进一步阐述本发明，下列实施例中未注明具体条件的实驗56rte,通常推照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例l.检新试剂盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法^ll口腔上皮细胞的基因组DNA, 步驟2:荧光定量PCR反应使用可检測离脂血症易感性的荧光定豕PCR检拥试剂盒，其中，含有下列對物对，光探针，有义引物1: 5' - AACAGCCAGGTATAGGGAT -3' (SEQ ID NO: 3) THii值为56"C反义引物1: 5' - TATACACCAACCTCCTAATC -3， (SHJ ID NO: 4) Tm值为561C有义引物2: 5' - AGGGTGAGATTCCAAGATAA -3' (SEQ ID NO: 5) Tm值为561C反义引物2: 5' - CAAGCAAATGACTAAAGAGAA -3' (SEQ ID NO: 6) Tn值为561C荧光探针1: 5' - GGnCGAGTTAGGGTTCAGATC -3' (SEQ ID NO: 7) Tm值为661C荧光探针2: 5' - CGCTATAGGATTTAAAGCTTTTATA -3' (SEQ ID NO: 8) Tm值为64"C有义引物1，反义引物1和荧光探针1特异地针对检測CETP基因上的rsl7237904号SNP位点(SEQ ID NO: 1所示序列中146位〉多态性；有义引物2，反义引物2和荧光探针2特异地针对检測LPL基因上的 rs320号SNP位点(SEQ ID NO: 2所示序列中118位)多态性。荧光定量PCR反应体系为总体积lO(il，包含浓度为20ng/|xl的DNA模板2jil、 ljil 10 X荧光定量PCR 反应缓冲液、0. lpl 25mH dOTP混合液，0.5pl 2^M MgCl:溶液、0.02pl (5units/(tl) T叫D恥荣合瞎、 20| M的有义引物1和2各0. 225nl、20jiM的反义引物1和2各0.225nl、l(HiM的荧光探针1和2各O.25jil， 去离子水4.98|11。在ABI9700型PCR扩塌仪上进行反应，反应条件为50*C 、 2分钟，95TC 、 10分钟，进行60个循环的 951C、 30秒，601C、 l分钟。反应结束后在旭I7恥0型荧光定量PCR仪上读取样品荧光瘇。步骤3: SNP基因型分析将荧光定豕PCR仪上显示的最终样显荧光量和正常对照相对比，荧光探针1最终的炎光信号明显高于 正黹对瓶，说明被检劂DNA的CETP基芮上的rsl7237904号SNP位点基接型携带有G型》为AISA症易感 型；荧光探针2最终的荧光信号明显髙于正常对照，说明被检测DNA的LPL基因上rs3加号SNP位点基因 型拥带有T型，为高脂血症易感型， 实施例2.指导人们主动预防高脂血症的服务目前在上海主健生物工程有限公司已经开展了这项服务。 步骤l: DNA提取对被检测者进行服务前咨询，由被检測者签著知情同意书，填写生活饮食习惯问INI査表，依照取样 盒中的指示使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细魔的DKA步據2:基因分型检渊使用本发明提供的试剂盒,对被检拥者DNA的CETP基因上的rsl7237904号SNP位点和LPL基因上Ts320 号SNP位点同时进行荧光定量iO检測，确定这两个SNPs位点的基因型，步骤3:指导人们主动预防商脂血症通过对被检測者SNPs基因型的分析，出具基因分型检測报告和被检測者个体化健IE指导报吿.基因 检翔报吿详细说明了被检測者髙脂血症易感程度的髙低以及患病的概率大小。个体化^ 指导报吿以被& 測者的基因分型检測结果为基础，结合其生活饮食习惯问巻调査结果，评估被检糖者Am血症逸传易感的 相对风险。同时制定出针对于被检測者的个性化健康行动方案，方案包括在饮食习惯、生活方式上的改进 建议等，并为被检測者普及预防高脂血症的健康知识。
序列表<110〉上海主健生物工程有限公司<120〉检測高脂血症易感性的试剂盒<160〉 8<210〉 1 <211> 300 <212> DNA〈213>人属，,人种(Homosapiens, human)<柳〉1gg扭gatgggct卿c鹏gctgtcatcac cccctcctgacctcgccttc幼ggtc幼gt60tctuggtgag幼ggtcctagctgcattgc aaacagccaggtatagggatttgtgtttgt120ct辟gacccag助tcactggggttcgagtt agggttcagatctgagccaggttagggggt180tgagtc鄉gggtaaagatt鄉aggttgg tgtatatttggtgttgggggtcactctatg240gcca卿tcag鹏ttgccat卿ctc鄉tgacggaggctccatcactgactgttgtgt300<210> 2〈211〉卿<212〉 DNA<213>人属，人种(Homosapiens, human)<柳> 2tc助accaacctcttcaagagtgagat tcctaatctccctgtctccgcagcccacccatgtgtacccataaaatgaatta cacgatcgctataggatttaaagcttt120t8t肌t幼atgtgctgg辟ttttgcaaact atagtgtgctgttattgttaatttaaad180actctaagUaggattgacattatttct ctttagtcatttgcttgtatcaccaaagaa240gcaaac幼acaaacaa幼aaaaaaagaaaa agatcttgggtggaaatgttataaagaa300<210> 3 <211〉 19 <212〉 DNA <2i3>人工序列<220><223〉引物 <400〉 aacagcc鄉tatagggat 19<210> 4 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列<2加><223>引物 <400> 4tatacacc幼cctcct幼tc 20<210〉 5 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列<220〉<223>引物 <柳> 5a鹏tgagat tccaagataa 20〈210〉 6 <211> 21 <212〉 DNA <213〉人工序列<220><223>引物 <柳〉6c助gcaaatg actaaagaga a 21<210> 7 <211> 22 <212> DNA <213〉人工序列<220><223>探针
<400> 7ggttcgagtt agggttcaga tc<210> 8 〈211〉 25 <212> DNA <213>人工序列<220><223>探针 <400> 8cgctatagga ttt幼agctt ttata
权利要求
1.一种检测高脂血症易感性的试剂盒，包括同时检测CETP基因SEQ ID NO1中第146位SNP位点与LPL基因SEQ ID NO2中第118位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对SEQIDNO: l中第l新 位SNP与SEQ ID NO: 2中第118位SNP位点而设计，能特异性扩墦出包含SEQ ID NO: 1中第146位SNP 位点的DNA片段与包含SEQ ID NO: 2中第118位SNP位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利耍求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO: 1中第 146位SNP与SEQ ID NO: 2中第118位SNP位点而设计，能通过荧光定董PCR技术特异性检测出这两个 SNPs位点冠心病易感基因型的探针。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选瞎具有SHJ IDNO, 3和4所 示序列的引物对以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQ ID NO: 7和8 所示序列的Taqman探针。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括lul IOX荧光定豕PCR反 应缓冲液，0. l|il 25mM dNTP混合液，0.5^1 25mM MgCh溶液，0.02(il (5units/|il〉 T叫DNA荣合瞎， 20nM特异性引物对(四条)各0.225ji1, 10nM特异性荧光探针(两条)各0.25jil，去离子水4.98nl。本 试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20"。
全文摘要
本发明公开了一种检测高脂血症易感性的试剂盒。该试剂盒包括同时检测CETP基因SEQ ID NO1中第146位SNP位点和LPL基因SEQ ID NO2中第118位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测分析个体的CETP基因与LPL基因上SNPs位点基因携带型来预测个体对高脂血症的易感性。
文档编号C12Q1/68GK101130809SQ200610030380
公开日2008年2月27日 申请日期2006年8月25日 优先权日2006年8月25日
发明者冯哲民, 屹 楼, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司