专利名称：三七不定根的诱导及组织培养的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种药物技术领域的方法，特别是涉及一种三七不定根的诱导及组织培养的方法。
背景技术：
三七是我国特有的、贵重的及最常用的中药材之一，具散瘀止血、消肿定痛等功效，既可以作为滋补品直接食用，如三七药膳、三七花茶，又是许多保健品和药品的重要原料，如血塞通、云南白药、复方丹参滴丸和复方三七通络片等。但是由于其生长受地理条件的限制以及“栽培的土地不能重复利用”的影响，栽培面积十分有限，导致药材供不应求，不能满足医疗保健市场的需求。为解决土地资源紧缺、不能重复利用的难题，研究非土地培植的三七培养方法成为当务之急。产业化规模的药用植物组织培养可以解决以上问题，通过组织培养方法可获得有效成分含量高、生产周期短的三七组织培养物，从而代替土地栽培的三七，既可解决土地问题，又可解决三七药材资源问题，具有非常重要的经济意义和社会意义。
不定根培养是80年代发展起来的一项新技术，不定根是分化的植物器官，是由植物的愈伤组织诱导出来的根，和药用植物的悬浮细胞相比，其有效成分含量稳定；和大田栽培的植物相比，不仅有效成分含量高而稳定、生长速度快上千倍，而且节省土地资源，因此不定根培养适合于药用植物尤其是根类药材(如三七)的组织培养，以获得组织培养物或其有效成分替代名贵稀有紧缺的三七原料。
经对现有技术文献的检索发现，目前除申请人申请的一项关于三七不定根的组织培养方面的专利申请(申请号03130265.3)，尚无其他相关三七组织培养和生产方法的文献报道。但是该已申请专利的该项技术仅涉及三七根，并未涉及来源于大田栽培三七花蕾、叶片、叶柄、茎和须根部位的愈伤组织诱导不定根，也未涉及三七再生苗直接诱导不定根的方法，而采用三七根诱导不仅受原产地的限制而且无法满足各地需要，而且生长缓慢、内生真菌污染严重；该技术未涉及不定根诱导率、主要有效成分皂苷类成分的分析，也未涉及不定根液体培养体系的建立方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有三七不定根培养技术的不足，提供一种三七不定根的诱导及组织培养的方法。使其来自于大田栽培三七茎、叶片、叶柄、须根和花蕾的愈伤组织块，以及三七再生无菌苗的叶片、茎段、带根茎段和根的外植体能够诱导三七不定根，形成一种生产规模大、生产周期短、不定根诱导取材来源广泛、产品质量可控、生产成本低廉的方法。
本发明是通过下述技术方案实现的，包括以下具体步骤 (1)三七不定根的诱导取三七的愈伤组织块，以及三七的外植体，置于含吲哚丁酸、萘乙酸、激动素的一种或一种以上植物生长物质的MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导形成不定根； (2)三七不定根与其母体组织的脱离培养具体为取上述诱导形成的不定根，转接到含相同成分的MS液体培养基中培养，连续培养后将不定根与母体组织分离培养； (3)三七不定根培养取步骤(2)获得的不定根，置含有吲哚丁酸、萘乙酸一种或一种以上植物生长物质的MS液体培养基中培养，从而建立生长迅速的体外三七不定根的诱导及组织培养的方法。
步骤(1)中所述的愈伤组织为诱导自大田栽培三七植物的茎、叶片、叶柄、须根、花蕾组织中的任一种。
所述的愈伤组织，是来源于花蕾的愈伤组织，其不定根诱导率最高，达100％，是不定根诱导的最佳材料。
步骤(1)中所述的外植体为来自于三七再生无菌苗叶片、茎段、带根茎段和根的外植体的任一种。
步骤(1)中所述的MS固体培养基，是指含0.1-10mg/L吲哚丁酸、0.1-5mg/L萘乙酸、0.1-1mg/L激动素一种或一种以上植物生长物质的MS固体培养基上。
所述的硝酸铵，是指2-20mmol/L硝酸铵。
步骤(1)中所述的无菌避光条件下，是指于20-26℃无菌避光条件下诱导20-35天。
步骤(2)中所述的转接到含相同成分的MS液体培养基中培养，是指在摇床转速80-120r/min，温度20-26℃，以21-35天/代的间隔的条件下连续培养2~5代。
步骤(3)中所述的培养基，是指置含有0.1-5mg/L吲哚丁酸、0.1-5mg/L萘乙酸一种或一种以上植物生长物质的MS液体培养基。
步骤(3)中所述的置含有吲哚丁酸、萘乙酸一种以上植物生长物质的MS液体培养基中培养，是指摇床转速80-120r/min、温度25℃、培养21-35天的条件下。
本发明诱导方法简单、效率高，其中大田栽培三七须根愈伤组织、花蕾愈伤组织、三七再生苗茎段外植体和带根茎段外植体的不定根诱导率均在90％以上；次生代谢产物含量高、主要皂苷成分均得以表达且其比例与药材相近。三七不定根诱导来源广泛，包括大田栽培三七茎、叶片、叶柄、须根和花蕾的愈伤组织块，以及三七再生无菌苗叶片、茎段、带根茎段和根的外植体，而且生长快速、无内生真菌污染；具有完善的不定根液体培养体系。
图1为三七不定根皂苷成分的高效液相色谱图。
图2为三七花蕾愈伤组织皂苷成分的高效液相色谱图。
图3为三七药材皂苷成分的高效液相色谱图。
具体实施例方式 实施例1三七不定根的体外诱导及液体培养体系的建立 取诱导自三七茎外植体的愈伤组织块，置于添加2mg/L吲哚丁酸和0.7mg/L激动素的MS(含10mmol/L硝酸铵)固体培养基上，于25℃无菌避光条件下诱导20天即有不定根的形成。取上述诱导形成的不定根，连同母体愈伤组织一起转接到含相同成分的MS液体培养基中，于26℃以28天/代为间隔(摇床转速100r/min)连续传代培养3代后将不定根与母体组织分离培养。取分离培养的不定根转入含5mg/L吲哚丁酸的MS液体培养基中，80r/min、25℃暗培养35天，即得体外快速繁殖的三七不定根。
实施效果不定根诱导率达13.3％，吲哚丁酸促进不定根的径向生长、根细长、无分支或少分支，不利于不定根的侧根发育。经高效液相色谱仪分析，所得三七不定根的主要皂苷均得以表达且其比例与药材相似，总皂苷含量高于愈伤组织2倍以上并略高于药材。
实施例2三七不定根的体外诱导及液体培养体系的建立 取诱导自三七叶片外植体的愈伤组织块，置于含0.1mg/L吲哚丁酸、5mg/L萘乙酸和0.1mg/L激动素的MS(含10mmol/L硝酸铵)固体培养基上，于20℃无菌避光条件下诱导35天后即有不定根的形成。取上述诱导形成的不定根，连同母体愈伤组织一起转接到含相同成分的MS液体培养基中，于20℃以21天/代为间隔(摇床转速120r/min)连续传代培养4代后将不定根与母体组织分离培养。取分离培养的不定根转入含5mg/L萘乙酸的MS液体培养基中，120r/min、25℃暗培养21天，即得体外快速繁殖的三七不定根。
实施效果不定根诱导率达46.7％。萘乙酸促进不定根的生长和侧根发育，但是侧根粗短，且有明显的愈伤化、半透明化现象，对于不定根的形态发育不利。经高效液相色谱仪分析，所得三七不定根的主要皂苷均得以表达且其比例与药材相似，总皂苷含量高于愈伤组织2倍以上并略高于药材。
实施例3三七不定根的体外诱导及液体培养体系的建立 取诱导自三七叶柄外植体的愈伤组织块，置于含10mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L激动素的MS(含5mmol/L硝酸铵)固体培养基上，于25℃无菌避光条件下诱导35天后即有不定根的形成。取上述诱导形成的不定根，连同母体愈伤组织一起转接到含相同成分的MS液体培养基上，于26℃以35天/代为间隔(摇床转速80r/min)连续传代培养5代后将不定根与母体组织分离培养。取分离培养的不定根转入含0.1mg/L吲哚丁酸和5mg/L萘乙酸的MS液体培养基中，120r/min、25℃暗培养21天，即得体外快速繁殖的三七不定根。
实施效果不定根诱导率达6.7％。不定根的体外液体培养获得成功，但是侧根较为粗短，且有较明显的愈伤化现象。经高效液相色谱仪分析，所得三七不定根的主要皂苷均得以表达且其比例与药材相似，总皂苷含量高于愈伤组织2倍以上但略低于药材。
实施例4三七不定根的体外诱导及液体培养体系的建立 取诱导自三七须根外植体的愈伤组织块，置于含5mg/L萘乙酸和0.1mg/L激动素的MS(含2mmol/L硝酸铵)固体培养基上，于25℃无菌避光条件下诱导25天后即有不定根的形成。取上述诱导形成的不定根，连同母体愈伤组织一起转接到含相同成分的MS液体培养基中，于25℃以28天/代为间隔(摇床转速100r/min)连续传代培养2代后将不定根与母体组织分离培养。取分离培养的不定根转入含1mg/L吲哚丁酸和3mg/L萘乙酸的MS液体培养基中，100r/min、25℃暗培养28天，即得体外快速繁殖的三七不定根。
实施效果，不定根诱导率达91.1％。建立了不定根的体外液体培养体系，不定根产生轻微的愈伤化，并侧向分生出大量细长、结构完整的不定根。经高效液相色谱仪分析，所得三七不定根的主要皂苷均得以表达且其比例与药材相似，总皂苷含量高于愈伤组织2倍以上并略高于药材。
实施例5三七不定根的体外诱导及液体培养体系的建立 取诱导自三七花蕾外植体的愈伤组织块，置于含3mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L激动素的MS(含10mmol/L硝酸铵)固体培养基上，于25℃无菌避光条件下诱导25天后即有不定根的形成。取上述诱导形成的不定根，连同母体愈伤组织一起转接到含相同成分的MS液体培养基中，于25℃以28天/代为间隔(摇床转速110r/min)连续传代培养3代后将不定根与母体组织分离培养。取分离培养的不定根转入含3mg/L吲哚丁酸和3mg/L萘乙酸的MS液体培养基中，110r/min、25℃暗培养28天，即得体外快速繁殖的三七不定根。
实施效果不定根诱导率达100％。建立了不定根的体外液体培养体系，不定根粗壮、轻微愈伤化，并侧向分生出大量粗壮不定根。经高效液相色谱仪分析，所得三七不定根的主要皂苷均得以表达且其比例与药材相似，总皂苷含量高于愈伤组织2倍以上并略高于药材。三七花蕾外植体的愈伤组织块是体外三七不定根诱导和组织培养的优选材料，本条件为最佳诱导和培养条件。
实施例6三七不定根的体外诱导及液体培养体系的建立 取来自于三七再生无菌苗的叶片外植体，置于含2mg/L吲哚丁酸和1mg/L萘乙酸的MS(含20mmol/L硝酸铵)固体培养基上，于23℃无菌避光条件下诱导30天后即有不定根的形成。取上述诱导形成的不定根，连同母体组织一起转接到含相同成分的MS液体培养基中，于23℃以35天/代为间隔(摇床转速80r/min)连续传代培养3代后将不定根与母体组织分离培养。取分离培养的不定根转入含5mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L萘乙酸的MS液体培养基中，80r/min、25℃暗培养35天，即得体外快速繁殖的三七不定根。
实施效果不定根诱导率达70.6％。建立了不定根的体外液体培养体系，不定根粗短，侧向分生出粗短的不定根，无愈伤化现象。经高效液相色谱仪分析，所得三七不定根的主要皂苷均得以表达且其比例与药材相似，总皂苷含量高于愈伤组织2倍以上并略高于药材。
实施例7三七不定根的体外诱导及液体培养体系的建立 取来自于三七再生无菌苗的茎段外植体，置于含3mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L激动素的MS(含20mmol/L硝酸铵)固体培养基上，于25℃无菌避光条件下诱导21天后即有不定根的形成。取上述诱导形成的不定根，连同母体组织一起转接到含相同成分的MS液体培养基中，于25℃以21天/代为间隔(摇床转速110r/min)连续传代培养2代后将不定根与母体组织分离培养。取分离培养的不定根转入含3mg/L吲哚丁酸的MS液体培养基中，110r/min、25℃暗培养28天，即得体外快速繁殖的三七不定根。
实施效果不定根诱导率达91.3％。建立了不定根的体外液体培养体系，不定根发生轻微愈伤化，侧向分生出大量细长的不定根。经高效液相色谱仪分析，所得三七不定根的主要皂苷均得以表达且其比例与药材相似，总皂苷含量高于愈伤组织2倍以上并高于药材。
实施例8三七不定根的体外诱导及液体培养体系的建立 取来自于三七再生无菌苗的根外植体，置于含3mg/L吲哚丁酸、0.1mg/L萘乙酸、0.1mg/L激动素的MS(含20mmol/L硝酸铵)固体培养基上，于25℃无菌避光条件下诱导21天后即有不定根的形成。取上述诱导形成的不定根，连同母体组织一起转接到含相同成分的MS液体培养基中，于26℃以35天/代为间隔(摇床转速80r/min)连续传代培养4代后将不定根与母体组织分离培养。取分离培养的不定根转入含0.1mg/L吲哚丁酸的MS液体培养基中，80r/min、25℃暗培养35天，即得体外快速繁殖的三七不定根。
实施效果不定根诱导率达44.4％。建立了不定根的体外液体培养体系，不定根发生径向生长，并侧向分生出少量细长的不定根。经高效液相色谱仪分析，所得三七不定根的主要皂苷均得以表达且其比例与药材相似，总皂苷含量高于愈伤组织2倍以上并高于药材。
实施例9三七不定根的体外诱导及液体培养体系的建立 取来自于三七再生无菌苗的带根茎段外植体，置于含3mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L激动素的MS(含10mmol/L硝酸铵)固体培养基上，于25℃无菌避光条件下诱导21天后即有不定根的形成。取上述诱导形成的不定根，连同母体组织一起转接到含相同成分的MS液体培养基中，于25℃以21天/代为间隔(摇床转速120r/min)连续传代培养3代后将不定根与母体组织分离培养。取分离培养的不定根转入含3mg/L萘乙酸的MS液体培养基中，120r/min、25℃暗培养28天，即得体外快速繁殖的三七不定根。
实施效果不定根诱导率达94.1％。建立了不定根的体外液体培养体系，不定根粗壮、轻微愈伤化，并侧向分生出大量不定根。经高效液相色谱仪分析，所得三七不定根的主要皂苷均得以表达且其比例与药材相似，总皂苷含量高于愈伤组织2倍以上并略高于药材。
权利要求
1.一种三七不定根的诱导及组织培养的方法，其特征在于，包括以下具体步骤
(1)三七不定根的诱导取三七的愈伤组织块，以及三七的外植体，置于含吲哚丁酸、萘乙酸、激动素一种或一种以上的植物生长物质的MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导形成不定根；
(2)三七不定根与其母体组织的脱离培养具体为取上述诱导形成的不定根，转接到含相同成分的液体培养基中培养，连续培养后将不定根与母体组织分离培养；
(3)三七不定根培养取步骤(2)获得的不定根，置含有吲哚丁酸、萘乙酸一种或一种以上的植物生长物质的MS培养基中培养，从而建立生长迅速的体外三七不定根的诱导及组织培养的方法。
2.根据权利要求1所述的三七不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(1)中所述的愈伤组织为诱导自大田栽培三七植物的茎、叶片、叶柄、须根、花蕾组织中的任一种。
3.根据权利要求2所述的三七不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，所述的愈伤组织，是指源于花蕾的愈伤组织。
4.根据权利要求1所述的三七不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(1)中所述的外植体为来自于三七再生无菌苗叶片、茎段、带根茎段和根的任一种。
5.根据权利要求1所述的三七不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(1)中所述的固体培养基，是指含0.1-10mg/L吲哚丁酸、0.1-5mg/L萘乙酸、0.1-1mg/L激动素一种或一种以上植物生长物质的MS固体培养基。
6.根据权利要求5所述的三七不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，所述的硝酸铵，是指含2-20mmol/L硝酸铵。
7.根据权利要求1所述的三七不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(1)中所述的无菌避光条件下，是指于20-26℃无菌避光条件下诱导20-35天。
8.根据权利要求1所述的三七不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(2)中所述的转接到含相同成分的液体培养基中培养，是指在摇床转速80-120r/min，温度20-26℃，以21-35天/代为间隔的条件下连续培养2-5代。
9.根据权利要求1所述的三七不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(3)中所述的培养基，是指含有0.1-5mg/L吲哚丁酸、0.1-5mg/L萘乙酸一种或一种以上植物生长物质的MS液体培养基。
10.根据权利要求1所述的三七不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(3)中所述的置含有吲哚丁酸、萘乙酸一种或一种以上植物生长物质的MS液体培养基中培养，是指摇床转速80-120r/min、温度25℃、培养21-35天的条件下。
全文摘要
本发明是一种药物技术领域的三七不定根的诱导及组织培养的方法。包括(1)三七不定根的诱导取三七的愈伤组织块和外植体，置于含吲哚丁酸、萘乙酸、激动素一种或一种以上植物生长物质的MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导形成不定根；(2)三七不定根与其母体组织的脱离培养具体为取上述诱导形成的不定根，转接到含相同成分的MS液体培养基中培养，连续培养后将不定根与母体组织分离培养；(3)三七不定根培养取步骤(2)获得的不定根，置含有吲哚丁酸、萘乙酸一种或一种以上的MS液体培养基中培养。本发明方法简单、效率高、次生代谢产物含量高、生产成本低廉。
文档编号C12N5/04GK1947498SQ200610030608
公开日2007年4月18日 申请日期2006年8月31日 优先权日2006年8月31日
发明者贾伟, 高先富, 邱明丰, 赵爱华, 梁梦奇, 谢国祥 申请人:上海交通大学