专利名称：多菌种混合培养生产微生物饲料添加剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生态制剂的生产方法，特别是采用多株菌种混合培养益生菌饲料添加剂的方法。
背景技术：
民以食为天。食品安全问题是关系到人民健康和国计民生的重大问题，特别是在我国入世以后，农产品安全问题已经成为影响我国农产品产业竞争力的关键因素。猪肉是人们摄取的主要动物性食品，安全饲料是动物性食品安全的基础。研制开发使用安全，有利猪生长的饲料添加物，是发展“无公害养猪技术”的关键，而饲用微生物制剂是目前比较公认的首选的好的方法。随着微生物应用技术的广泛开展，在活菌制剂的应用方面，人们希望一种产品能够行使多种功能，解决多方面的问题，许多产品都是由多种微生物组成。目前，这类产品的生产形式上，一般采用将单一菌种分开培养，然后将多种菌的培养物混合在一起，组成多菌种多功能产品。这种生产方式，要求每种菌使用一次发酵罐，要求生产设备投资较大，能耗较高，大大提高了生产成本。目前对于具有协同作用关系的菌株筛选和组合还是一个随机过程，缺乏有效的理论指导，而且对于已经应用的混合培养体系也不能有效地协调菌间的关系，使其达最佳生态水平，发挥最大效应。这严重地阻碍了混合菌培养的发展和应用。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种可很好地降低生产成本、生产能耗，菌种间可以互相很好地协同作用，提高动物的免疫力，提高饲料利用率，促进动物健康生长的多株菌种混合培养生产微生物饲料添加剂的方法。
本发明的目的是通过下述方式实现的所使用的菌种为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、产朊假丝酵母(Candida tail.s)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；其工艺为将酿酒酵母与产朊假丝酵母制成酵母菌混合种子液；将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌制成乳酸菌混合种子液；将上述所得到的酵母菌混合种子液、嗜酸乳杆菌混合种子液接种于酵母菌与乳酸菌混合种子培养基中，得到酵母菌与乳酸菌混合种子液；将酵母菌与乳酸菌混合种子液按0.2-0.3％的接种量接种于混合发酵培养基中分段混合发酵后得到成品；所述的混合发酵培养基为1-3％红糖、1.5％葡萄糖、0.1-0.3％蛋白胨、0.5-1.5％豆粕、0.1-0.6％萝卜汁、0.1％ K2HPO4，0.1％ MgSO4.7H2O、水1000mL，pH 6.4-6.6；所述的酵母菌与乳酸菌的分段混合发酵培养分两阶段进行，前期好氧培养培养温度28-30℃、通气量300L/min，每通1h停10min，搅拌转速40-50r/min，每3h 30min停30min，培养20-30h；后期厌氧发酵培养温度32-34℃、通气量0L/min，搅拌转速40-50r/min，每30min停30min，培养20-30h。
所述的混合发酵培养基中还加入0.0-0.3％植物油。
混合发酵培养基为以下组分时效果最佳2％红糖、1.5％葡萄糖、0.1％蛋白胨、1％豆粕、0.5％萝卜汁、0.1％ K2HPO4，0.1％ MgSO4.7H2O、0.15％植物油、水1000mL，调pH 6.4-6.6。
酵母菌混合种子液、嗜酸乳杆菌混合种子液分别按1-2％、0.5-1.5％的接种量接种于酵母菌与乳酸菌混合种子培养基中。
将酵母菌混合种子液、嗜酸乳杆菌混合种子液分别按1.5％、1％的接种量接种于酵母菌与乳酸菌混合种子培养基中；将酵母菌与乳酸菌混合种子液按0.2％的接种量接种于混合发酵培养基中进行混合发酵，效果最佳。
本发明通过多次研究及试验对于生产用菌种进行选择，并通过对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、产朊假丝酵母(Candida tails)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)4种生产用菌的特性与性能进行了研究、测试，试验，发明人发现上述4种菌种的有效组合对于本发明的产品具有很好地效果。且本发明所使用的菌种均为农业部允许使用的饲料级益生菌菌种。本发明利用酵母菌为兼性好氧菌、乳酸菌为微好氧菌的特点，先进行好气性培养，使酵母菌产生大量的菌体和代谢产物，同时这种培养条件又不损害乳酸菌的存活，通过前期培养之后，停止通气培养，使酵母菌能够进行酒精发酵，产生一定量的酒精和二氧化碳，为酯香物质的生成以及乳酸菌的微好氧生长提供条件，同时乳酸菌能够利用酵母菌的代谢产物进行生长，进一步降低pH值，为降低产品杂菌的污染创造条件，且降低了生产能耗。
本发明利用酵母菌的培养基成分简单，代谢产物营养丰富，而乳酸菌的培养基成分复杂，且价格较贵，酵母菌的代谢产物或死亡细胞自溶物能够提供乳酸菌生长的营养要求，研究优化得到了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、产朊假丝酵母(Candida tails)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)4种菌混合培养的培养基配方(即2％红糖、1.5％葡萄糖、0.1％蛋白胨、1％豆粕、0.5％萝卜汁、0.1％ K2HPO4，0.1％MgSO4.7H2O、0.15％植物油、水1000mL，pH 6.4-6.6。大大降低了一般乳酸菌培养基中的蛋白胨含量，省去了酵母粉(膏)成分，而采用了价格便宜、丰富的豆粕粉做氮源，采用红塘代替了部分蔗糖或者葡萄糖做碳源，降低生产原料成本1510.9元/吨左右。
本发明最大的优势在于，本发明提出了将植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、产朊假丝酵母(Candida tails)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行混合培养，创造性地提出了分段发酵技术，本发明混合发酵前期主要好氧培养酵母菌获得菌体和代谢产物，后期主要厌氧培养乳酸菌获得菌体并使酵母菌发酵产生酒香味。并同时很好地研究出了针对本发明所述的四种菌混合发酵培养基，四种菌混合发酵培养条件，这些都是没有相关文献报道的。而本发明产品可以成功制备的关健也在于上述条件的确定。
本发明产品用于猪和鸡的饲喂对动物具有促生长、提高料肉比、提高免疫力、减少环境污染和防止疾病发生等功能；能够提高公猪精子的活力，降低精子畸形率；肉产品中不存在激素和抗生素残留，避免了抗药性和药物残留，本发明的推广应用可提高我国猪肉产品的国际市场竞争力，确保猪肉产品的质量和卫生安全，是继抗生素之后的新一代产品。因而本发明是一种可有效地利用4种菌很好地混合发酵生产微生物饲料添加剂这种优良产品的生产方法，本发明可大大降低生产成本，促进该类产品的推广应用。
本发明的产品在湖南省长沙、浏阳、宁乡、蓝山、株洲等部分地市和大型猪场进行推广，出栏26万多头猪，养殖户平均增收50多元/头，直接经济效益达1500多万元。
具体实施例方式
实施例1下面举例对本发明做更详细的描述菌种产朊假丝酵母[ACC20060]、酿酒酵母[ACC20065]、植物乳杆菌[ACC10644]、嗜酸乳杆菌[ACC10637](均为中国农业微生物菌种保藏中心购买得到)。
分别将上述四种菌种进行菌种活化，将产朊假丝酵母、酿酒酵母分别接种于PDA斜面培养基上，20-30℃，培养30-40h；连续活化后，分别培养制取产朊假丝酵母、酿酒酵母液体种子；而植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌分别接种于MRS斜面培养基，30-40℃，培养30-40h；连续活化后，分别培养制取植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌液体种子。
将酿酒酵母与产朊假丝酵母混合接种于YPD种子培养基中，在26-30℃下，160-180r/min，培养20-30h，得到酵母菌混合种子，然后再接种到酵母菌混合种子培养基中于26-30℃，160-180r/min，培养20-30h，得酵母菌混合种子液。其中酵母菌混合种子培养基的制备为蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，酵母膏5.0g，蒸馏水1000mL，调pH值为6.8～7.0，灭菌处理，待用。发明人还发现酵母菌混合种子液中酿酒酵母与产朊假丝酵母的菌数比为1∶1-3时，可以优化本发明的产品。
将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌混合接种于MRS种子培养基中，在30-34℃下，培养20-30h，得到乳酸菌混合种子，然后再接种到乳酸菌混合种子培养基中在30-34℃下，培养20-30h，得乳酸菌混合种子液。其中乳酸菌混合种子培养基制备为蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温801mL、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、水1000mL、调pH值6.2-6.4，灭菌处理，待用。发明人还发现乳酸菌混合种子液中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌的菌数比为1∶12时可以优化本发明的产品。
将上述所得到的酵母菌混合种子液、嗜酸乳杆菌混合种子液分别按1-2％、0.5-1.5％的接种量接种于酵母菌与乳酸菌混合种子培养基中，在30-34℃下，160-180r/min，培养30-40h，得到酵母菌与乳酸菌混合种子液。所述的酵母菌与乳酸菌混合种子培养基制备为2％红糖、1.5％葡萄糖、0.5％蛋白胨、0.5％萝卜汁、0.1％ K2HPO4，0.1％ MgSO4.7H2O、0.15％植物油、水1000mL，调pH值6.4-6.6；灭菌处理，待用。
将酵母菌与乳酸菌混合种子液按0.2-0.3％的接种量接种于混合发酵培养基中进行混合发酵，混合发酵培养基通过以下组分的制备1-3％红糖、1.5％葡萄糖、0.1-0.3％蛋白胨、0.5-1.5％豆粕、0.1-0.6％萝卜汁、0.1％ K2HPO4，0.1％MgSO4.7H2O、0.0-0.3％植物油、水1000mL，pH6.4-6.6；灭菌处理，待用。
酵母菌与乳酸菌的分段混合发酵培养条件为前期好氧培养培养温度28-30℃、通气量300L/min，每通1h停10min，搅拌转速40-50r/min，每3h 30min停30min，培养20-30h；后期厌氧发酵培养温度32-34℃、通气量0L/min，搅拌转速40-50r/min，每30min停30min，培养20-30h。
最后经产品质量检测，灌装、包装，验收。
将本发明所制得的产品，在饲料中按日粮的0.3％添加产品直接饲喂，其效果明显，简单易行，值得推广。但添加0.3％的饲用微生物制剂发酵饲料后饲喂，也可能能够起到较好的饲喂效果，节省成本。
通过使用本发明的产品，证明本发明所得到的复合微生物制剂使猪肤色红润，生长势好，猪的体质增强；日增重提高15.4％；饲料利用率提高11.7％；粪便中的大肠菌群数量降低，氨气等有害气体减少；蛋白质和脂肪的粪表观消化率差异显著；粪便中总磷含量降低。
本发明生产的产品主要技术指标有效活菌数≥2.5×108CFU/mL其中乳酸菌≥2.0×108CFU/mL
酵母菌≥0.5×108CFU/mL大肠菌群数≤3个/100mL。
沙门氏菌不得检出。
pH值3.0-5.0。
保质期不得低于6个月(≥6个月)。
实施例2将酵母菌混合种子液、嗜酸乳杆菌混合种子液分别按1.5％、1％的接种量接种于酵母菌与乳酸菌混合种子培养基中；将酵母菌与乳酸菌混合种子液按0.2％的接种量接种于混合发酵培养基中进行混合发酵。
混合发酵培养基通过以下组分的制备可以达到最佳2％红糖、1.5％葡萄糖、0.1％蛋白胨、1％豆粕、0.5％萝卜汁、0.1％ K2HPO4，0.1％ MgSO4.7H2O、0.15％植物油、水1000mL，调pH6.4-6.6；灭菌处理，待用。其它步骤同实施例1。
权利要求
1.多菌种混合培养生产微生物饲料添加剂的方法，所使用的菌种为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母；其工艺为将酿酒酵母与产朊假丝酵母制成酵母菌混合种子液；将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌制成乳酸菌混合种子液；将上述所得到的酵母菌混合种子液、嗜酸乳杆菌混合种子液接种于酵母菌与乳酸菌混合种子培养基中，得到酵母菌与乳酸菌混合种子液；将酵母菌与乳酸菌混合种子液按0.2-0.3％的接种量接种于混合发酵培养基中分段混合发酵后得到成品；所述的混合发酵培养基为1-3％红糖、1.5％葡萄糖、0.1-0.3％蛋白胨、0.5-1.5％豆粕、0.1-0.6％萝卜汁、0.1％K2HPO4，0.1％MgSO4.7H2O、水1000mL，pH 6.4-6.6；所述的酵母菌与乳酸菌分段混合发酵培养则分两阶段进行，前期好氧培养培养温度28-30℃、通气量300L/min，每通1h停10min，搅拌转速40-50r/min，每3h 30min停30min，培养20-30h；后期厌氧发酵培养温度32-34℃、通气量0L/min，搅拌转速40-50r/min，每30min停30min，培养20-30h。
2.根据权利要求1所述的多菌种混合培养生产微生物饲料添加剂的方法，混合发酵培养基中加入0.0-0.3％植物油。
3.根据权利要求1所述的多菌种混合培养生产微生物饲料添加剂的方法，将酵母菌与乳酸菌混合种子液按0.2％的接种量接种于混合发酵培养基中进行混合发酵。
4.根据权利要求2所述的多菌种混合培养生产微生物饲料添加剂的方法，所述的混合发酵培养基为2％红糖、1.5％葡萄糖、0.1％蛋白胨、1％豆粕、0.5％萝卜汁、0.1％K2HPO4，0.1％MgSO4.7H2O、0.15％植物油、水1000mL，调pH 6.4-6.6。
5.根据权利要求1所述的多菌种混合培养生产微生物饲料添加剂的方法，酵母菌混合种子液、嗜酸乳杆菌混合种子液分别按1-2％、0.5-1.5％的接种量接种于酵母菌与乳酸菌混合种子培养基中。
6.根据权利要求5所述的多菌种混合培养生产微生物饲料添加剂的方法，将酵母菌混合种子液、嗜酸乳杆菌混合种子液分别按1.5％、1％的接种量接种于酵母菌与乳酸菌混合种子培养基中。
7.根据权利要求1所述的多菌种混合培养生产微生物饲料添加剂的方法，酵母菌混合种子液中酿酒酵母与产朊假丝酵母的菌数比为1∶1-3。
8.根据权利要求1所述的多菌种混合培养生产微生物饲料添加剂的方法，乳酸菌混合种子液中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌的菌数比为1∶1-2。
全文摘要
多菌种混合培养生产微生物饲料添加剂的方法，菌种为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母；将酿酒酵母与产朊假丝酵母制成酵母菌混合种子液；将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌制成乳酸菌混合种子液；将上述所得到的酵母菌混合种子液、嗜酸乳杆菌混合种子液接种于酵母菌与乳酸菌混合种子培养基中，得到酵母菌与乳酸菌混合种子液；将酵母菌与乳酸菌混合种子液按0.2－0.3％的接种量接种于混合发酵培养基中分段混合发酵后得到成品；酵母菌与乳酸菌混合发酵培养分两阶段进行，前期好氧培养，后期厌氧发酵。本发明是一种可很好地降低生产成本、生产能耗，菌种间可以互相很好地协同作用，提高动物的免疫力，提高饲料利用率，促进动物健康生长的多株菌种混合培养生产微生物饲料添加剂的方法。
文档编号C12N1/16GK1806659SQ200610031230
公开日2006年7月26日 申请日期2006年2月15日 优先权日2006年2月15日
发明者谭周进, 陈玉荣, 刘晓树 申请人:李建文