专利名称：一种红树林真菌次级代谢产物多糖及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种红树林真菌次级代谢产物多糖及其制备方法，以及次生代谢产物多糖在抗肿瘤活性方面的应用。
背景技术：
红树林是分布在热带和亚热带海岸潮间带的生物群落，具有丰富生物多样性和物种多样性，其中红树林区真菌是生长在红树植物组织中一类重要的生物群落。由于红树林内生真菌存在的特殊的海洋生态环境，红树林区真菌代谢产物具有其独有的特性。虽然我国红树林真菌资源丰富、种类繁多，约有1.5×106种，但目前对于红树林真菌的次级代谢产物的应用研究较少。因而研究及制备红树林真菌次级代谢产物多糖，开发红树林真菌次级代谢产物多糖的用途具有重要经济价值和现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的红树林真菌次级代谢产物多糖和制备方法，以及该次级代谢产物多糖在抗肿瘤活性方面的应用。
本发明所制备的红树林真菌次级代谢产物多糖，是利用从采自广西红树林中筛选出的红树林真菌微皮伞属(Marasmiellus)2003-GXK-04#，在玉米粉培养基中进行发酵，取菌丝体为原料，经水提、乙醇沉、Sevage法除蛋白、洗涤干燥的提取步骤而得到的提取物，为褐黄色的多糖。所述的红树林真菌微皮伞属(Marasmiellus)2003-GXK-04#已保藏中国典型培养物保藏中心保藏编号为CCTCC M 205144，保存日期2005年12月9日，该菌种简称为GXK-04#。
所述的红树林真菌次级代谢产物多糖的制备方法，采用下述的具体提取步骤(1)以含30-80％人工海水的玉米粉培养基对红树林真菌微皮伞属2003-GXK-04#CCTCC NOM205144进行发酵，生长将发酵后的菌丝体干燥后粉碎，加8-10倍去离子水80-95℃提取2-4h，过滤残渣得提取液，对残渣重复水提3-5次；(2)合并提取液，真空浓缩至四分之一，用氢氧化钠将浓缩液pH调至7-8，加入乙醇，至乙醇终浓度为70％，搅拌后4℃静置20h，4000r/mim离心得底部沉淀；(3)沉淀溶于去离子水，加入氯仿和正丁醇，三者比例为10∶4∶1，搅拌后放置20min，去除有机层和混浊层，水层加入乙醇静置、离心得沉淀，上述步骤重复4次；(4)上述产物依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，再真空干燥，即得浅黄色多糖。
所述的人工海水已有很多公开的配方，如Lymam与Fleming在1940所公开的人工海水配方。
经对制得的红树林真菌次级代谢产物多糖进行动物抗肿瘤试验，证明该多糖具有抗肿瘤活性，可作为抗肿瘤药的应用。
具体试验过程和结果如下(1)验动物雌雄性小鼠各半，体重18～20g。由广东医学实验动物中心提供。
(2)实验瘤株小鼠肉瘤S180由中山医科大学动物细胞中心提供。
(3)小鼠肿瘤模型的建立将接种后8天肿瘤生长良好的动物，颈椎脱臼处死，抽取健康的腹水型S180小鼠腹水，用生理盐水稀释腹水至细胞数1×106个/ml，0.2％台盼蓝染色并计数，活细胞数为98％可以上可用。每只小鼠腋部皮下接种0.2ml。
(4)小鼠分组及给药接种后24h分成4组，每组12只。阴性对照组给等量生理盐水；阳性对照组为20mg/kg·b·w的环磷酰胺(上海华联制药公司)；多糖组按120mg/kg·b·w的药物量溶于0.5％羧甲基纤维素钠与生理盐水混匀；多糖(100mg/kg·b·w)+环磷酰胺(20mg/kg·b·w)组。每组均设平行组，为腹腔注射，严格消毒，一日一次。连续10天。末次给药后24h称质量，眼球摘除放血处死小鼠。取0.02ml血液，用3％乙酸将血液稀释20倍，在显微镜下对白细胞计数。再取皮下瘤块称重。
(5)实验设计及饲养管理自由采食、自由饮水，自然光照，定期更换垫料。
(6)数据处理采用统计软件SPSS11.0进行统计分析，Bonferroni或TambaneT2检验。
(7)结果GXK-04#真菌多糖对小鼠移植S180肉瘤有抑制作用(见下表)。多糖组的抑瘤率为39.6％，多糖与环磷酰胺组抑瘤率为62.6％，实验各组差异均极显著(P＜0.01)。环磷酰胺组小鼠进食明显减少，毛发干枯，蓬松，且伴有一定程度的腹泻，体质消瘦，活动迟缓。与阳性空白对照组相比，多糖组与多糖+环磷酰胺组小鼠症状有所缓解，且白细胞升高率分别为80.8％和63.9％，差异显著(P＜0.01)，因此GXK-04#真菌多糖升白作用显著，对环磷酰胺有增效减毒作用。
红树林GXK-04#真菌多糖对小鼠移植性肉瘤S180的抑制作用(平均值±SD)
注大写字母表示各组之间差异显著P＜0.01。
具体实施例方式
红树林真菌次级代谢产物多糖制备方法如下步骤一、以含50％人工海水的玉米粉培养基对GXK-04#真菌进行发酵，发酵培养基为玉米粉2％，蛋白胨0.15％，葡萄糖2.5％，人工海水50％，pH6.7，摇瓶发酵，装量100ml/500ml三角瓶，接种量5％，温度25-30℃，培养时间6-7天，摇床转速为140rpm。取发酵后的菌丝体为原料，用小型粉碎机粉碎干燥过的菌丝体，加8-10倍去离子水90℃提取3h，过滤残渣得提取液，对残渣重复水提3次，；步骤二、合并提取液，真空浓缩至四分之一。用氢氧化钠将浓缩液pH调至7.5，加入乙醇，至乙醇终浓度为70％，搅拌后4℃静置20h，4000r/mim离心得底部沉淀；步骤三、沉淀溶于去离子水，加入氯仿和正丁醇(三者比例为20∶8∶2)搅拌后放置20min，去除有机层和混浊层，水层加入乙醇静置、离心得沉淀，上述步骤重复4次。步骤四、依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥后得浅黄色多糖。
所述的人工海水采用Lymam与Fleming在1940年所公开的下述人工海水配方NaCl 23.476g，MgCl24.981g，Na2SO43.917g，CaCl21.102g，KCl 0.664g，NaHCO30.192g，KBr 0.096g，H3BO30.026g，SrCl20.024g，NaF 0.003g，按上述配方加水至总重量为1000g即为人工海水。
权利要求
1.一种红树林真菌次级代谢产物多糖，其特征在于该多糖是以玉米粉培养基对红树林真菌微皮伞属2003-GXK-04#CCTCC NOM205144进行发酵，取菌丝体为原料，经水提、乙醇沉、Sevage法除蛋白、洗涤干燥的提取步骤而得到的提取物，为褐黄色的多糖。
2.权利要求1所述的红树林真菌次级代谢产物多糖的制备方法，其特征在于采用下述提取步骤(1)以含30-80％人工海水的玉米粉培养基对红树林真菌微皮伞属2003-GXK-04#CCTCC NOM205144进行发酵，将发酵后的菌丝体干燥后粉碎，加8-10倍去离子水，在80-95℃提取2-4h，过滤残渣得提取液，对残渣重复水提3-5次；(2)合并提取液，真空浓缩至四分之一，用氢氧化钠将浓缩液pH调至7-8，加入乙醇，至乙醇终浓度为70％，搅拌后4℃静置20h，4000r/mim离心得底部沉淀；(3)沉淀溶于去离子水，加入氯仿和正丁醇，三者比例为10∶4∶1，搅拌后放置20min，去除有机层和混浊层，水层加入乙醇静置、离心得沉淀，上述步骤重复4次；(4)上述产物依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，再真空干燥，即得浅黄色多糖。
3.根据权利要求2所述的红树林真菌次级代谢产物多糖的制备方法，其特征在于人工海水的配方为NaCl 23.476g，MgCl24.981g，Na2SO43.917g，CaCl21.102g，KCl 0.664g，NaHCO30.192g，KBr 0.096g，H3BO30.026g，SrCl20.024g，NaF 0.003g，按上述配方加水至总重量为1000克即为所述的人工海水。
4.根据权利要求1所述的红树林真菌次级代谢产物多糖的用途，其特征在于作为抗肿瘤药的应用。
全文摘要
一种红树林真菌次级代谢产物多糖及其制备方法和用途，该多糖是以玉米粉培养基对红树林真菌微皮伞属2003－GXK－04#CCTCC NOM205144进行发酵，取菌丝体为原料，经水提、乙醇沉、Sevage法除蛋白、洗涤干燥的提取步骤而得到的提取物，为褐黄色的多糖。经对制得的红树林真菌次级代谢产物多糖进行动物抗肿瘤试验，证明该多糖具有抗肿瘤活性，可作为抗肿瘤药的应用。
文档编号C12R1/645GK1840678SQ200610033360
公开日2006年10月4日 申请日期2006年1月27日 优先权日2006年1月27日
发明者王友绍, 孙翠慈, 杨志浩 申请人:中国科学院南海海洋研究所