专利名称：层叠杂交荧光放大磁分离检测dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测DNA的方法。
背景技术：
自1953年华特逊(Watson)和克瑞克(Crick)创立生物遗传分子脱氧核糖核酸(DNA)的双螺旋结构和建立生物遗传基因的分子机理以来，有关DNA分子的识别、测序一直为人们所关注。1990年美国制定了世界最庞大的基因研究计划“人类基因组计划”，随着人类基因草图的公布，人们正在深入开展后基因组计划研究，为此，国际上掀起了有关生物芯片和生物传感器的研究热潮。基因控制着人类生命的生老病死过程，随着对基因与癌症及其它与基因有关病症的了解，在分子水平上检测易感物种及基因突变，对于疾病的治疗及预后有着重要的意义。比如，历史上许多灾难性的瘟疫(如霍乱、天花、麻疹等)，以及当前对人类造成严重威胁与恐慌的流行性疾病(如SARS，禽流感)都是由相应的病菌或病毒所引起的，因此及时尽早诊断出病源微生物的感染，是预防这类疾病的关键。对于许多基因疾病(如众多癌症、帕金森氏综合症、阿尔茨海默氏病等)，只有在发病的前期发现，才有治愈的希望。另外，人类的许多疾病都是以环境为载体进行传播的。当环境中存在病原微生物或基因诱变剂时，就会对人类的健康产生极大的威胁。如果能及时发现环境中病原物的存在，就可以尽早进行疾病预防，防止引起人体感染。因此，为实现对疾病的早期诊断乃至超前诊断，提高人类的生存质量，加强对DNA检测方法的研究和应用开发，实现DNA的低浓度检测具有重要的科学意义和应用价值。
在各种不同的基因检测技术中，制约其发展和应用的一个非常重要的因素是检测灵敏度。比如，对于滤过性病毒感染，需要检测的DNA量在10-15摩尔/升或10-18摩尔/升水平。为达到这样低的检测限，必须通过扩增样本量或寻求放大检测信号的方法。目前，新型纳米材料在生物分析中的应用成为一个快速发展的领域。过去10年来，纳米材料在生物大分子超灵敏识别分析和生物信息获取方面的基础与应用研究在国际上一直受到高度重视。研究的热点主要集中在荧光材料标记物、纳米金、纳米银、氧化硅纳米颗粒等纳米材料的制备与应用上，各种各样的纳米结构决定了它们在生物检测中的应用特性。
在纳米荧光标记材料的研究中，分子信标的研究是最新研究进展之一。所谓分子信标(molecular beacon)，是一种具有发夹结构的新型荧光核酸探针。自由状态时的分子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被猝灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，荧光恢复。近年来人们对这种具有诸多优良特性的寡核苷酸探针进行了大量的试验，对其结构特性以及在各方面的应用展开了广泛而深入的研究，做出了许多改进，使其在序列检测、病原体侦测、药物疗效监测、区分基因野生型和突变型、DNA-蛋白相互作用研究、定量聚合酶链扩增(PCR)、以及体外转录反应中的RNA实时检测等众多领域中得到应用。例如，可用分子信标对活细胞中mRNA进行监测，并应用于DNA/RNA超小生物传感器及蛋白质实时检测。随着生物纳米技术的发展，最近杜贝垂(Dubertret)等尝试用1.4nm的纳米金作为猝灭基团。与常规猝灭基团DABCYL相比，纳米金可以在可见到近红外的波长范围内，有效的猝灭各种荧光染料。而且金颗粒在较低的离子强度条件下吸收效果较好。纳米金的引入，不仅可以降低分子信标制备成本，而且研究结果表明，这种技术对单碱基错配序列更为敏感，特别适合于在众多相似序列中高灵敏地检测出靶序列。例如，可在竞争性杂交阵列中高灵敏地检测出单碱基突变。目前的问题是需要进一步改善纳米金与DNA之间结合的稳定性，以免消除分子信标过程中纳米金掉下而影响猝灭效果。
在纳米金的研究方面，近年取得了长足的进展。金纳米粒子在水中形成的分散系俗称胶体金，胶体金颗粒大小根据制备条件不同可以是几纳米至100纳米以上。近年来，这方面的研究进展很快，1997年泽贝(Zehbe)报道了用纳米金作为信号报告分子的原位杂交技术，对组织中病毒核酸的检测灵敏度提高到了一个拷贝；最近几年，美国西北大学化学系和纳米技术研究所默金(Mirkin)教授等人利用纳米金在DNA片段作为组装分子的引导下可形成超分子结构的特点，建立了用巯基化寡核苷酸探针标记纳米金并检测特定多核苷酸序列的新方法。2000年，他们在基因芯片分析中运用纳米金颗粒标记与银染显色，有效地放大了杂交信号，并预期应用该技术有可能免除PCR基因靶序列扩增过程，避免PCR过程可能引起的假阴性和假阳性。他们显著提高了灵敏度和信噪比，比现有最灵敏的共聚焦诱导荧光检测方法灵敏100倍，而在灵敏温度范围内，正配/单碱基错配信号强度差别非常明显(信号强度比大于10)，实现了单碱基错配的识别。2002年。他们又在原来工作的基础上引入了微电极检测技术，使得正配/单碱基错配的信号强度比大大提高，达到了105∶1，而检测灵敏度提高到了500摩尔/升。
关于氧化硅纳米颗粒，人们已可制得一定尺寸范围的实心或壳层纳米颗粒。对于壳层纳米粒子，可将荧光标签分子组装在壳层内，形成稳定的核-壳纳米颗粒。这种核-壳纳米结构，由于荧光标签分子被包裹或组装在二氧化硅壳内，不容易发生光漂白，因而保存寿命延长。对于实心型的二氧化硅纳米颗粒，荧光基团是被铆接在颗粒表面。无论是实心纳米颗粒还是核-壳结构纳米颗粒，一个颗粒上所载有的荧光标签分子数目都可以很大，当二氧化硅纳米颗粒通过其表而修饰的功能基团而与生物大分子结合时，相对与传统方法来说，信号无疑可以大大放大，这种放大效果与单个纳米颗粒上组装的荧光标签分子数目多少有关。
在磁性纳米颗粒方面，人们不仅将其应用于生物样品的富集分离，而且在磁标记检测、磁性纳米颗粒热疗和药物包埋靶向治疗方面取得了可喜的研究成果。美国罗米雷克斯(Luminex)和依罗米那(Illumina)公司已将这种技术商业化，但分析系统价格昂贵。
上述情况表明，有关纳米颗粒在生物大分子识别分析中的基础与应用研究在国际上已经取得了较大进展，国内在这方面也取得了不少成绩。中南大学研究小组在磁性纳米颗粒包埋药物治疗肝癌领域处于国际先进水平，东南大学在纳米磁性颗粒的恶性肿瘤热疗方面取得了新的进展；湖南大学在二氧化硅纳米颗粒及分子信新标的研究中也作出了具有自己特色的工作；第三军医大学将石英晶体传感器表面组装以纳米金，成功地应用于肝炎等重大疾病的免疫分析；东南大学还通过将分子信标固定在水凝胶膜里，由于提供了类似于液相的反应环境，显著降低了固定化分子信标的背景信号。
上述纳米科学技术的发展无疑推动了生物大分子超灵敏识别技术的发展，但整体来说还处于发展的初期，很多问题尚没有解决，例如固载化分子信标的高噪声背景，就涉及到界面/表面化学的诸多问题纳米颗粒的稳定性、分子间的相互作用、界面对分子运动的影响、固定化标签分子的空间效应和组装密度及联结分子/基团长度对生物大分子识别的影响等，都急需人们去进行深入的探讨。
综上所述，在核酸大分子识别研究领域，人们往往借助PCR技术大量复制分析片段后再进行分析。但由于需要一个扩增过程，条件优化较为烦琐，受试剂质量和环境的影响非常敏感，有时会出现假阳性或假阴性结果，因此整体发展趋势是既借助PCR技术，也在积极探索免PCR的高灵敏分析方法，其中纳米颗粒的放大作用是研究人员的首选。
发明内容本发明的目的在于克服了上述技术问题的不足，提供了一种操作简单、超灵敏的DNA检测方法。本发明实现了快速现场采样并快速而高灵敏地获取样本的生物学信息。
为了解决上述存在的技术问题，本发明采用下列技术方案一种层叠杂交荧光放大磁分离检测DNA的方法，其特征在于包括下列步骤在SiO2纳米颗粒上同时标记a，b两种序列不同的DNA；在磁性纳米颗粒表面标记e序列的DNA；第一次三明治杂交靶DNA的一端与SiO2纳米颗粒上b序列的DNA杂交，靶DNA的另一端与磁性纳米颗粒上e序列的DNA杂交；另一种SiO2纳米颗粒上同时标记c，d两种序列不同的DNA；另一种SiO2纳米颗粒上c序列的DNA与荧光DNA杂交；第二次三明治杂交第一次三明治杂交后的SiO2纳米颗粒上a序列的DNA与连接DNA的一端杂交，连接DNA的另一端与荧光杂交后的纳米颗粒上d序列的DNA杂交；第二次三明治杂交后产物经磁分离清洗后，去除多余的荧光分子和非特异性吸附；再将第二次三明治杂交后产物DNA变性，解链后的荧光DNA即可进行荧光检测。
本发明与现有技术相比具有如下的优点本发明采用目前最成熟的荧光检测技术，将靶DNA的杂交信号直接转移为放大的荧光信号，DNA变性后可立即进行荧光检测，省却了在DNA变性后重新进行“三明治”杂交然后再金标银染的漫长过程；而且本发明应用了纳米颗粒的层叠放大技术，使荧光信号进一步成指数级放大，确保了DNA的超低检测限分析；本发明实现了超灵敏的DNA检测，实现了快速现场采样并快速而高灵敏地获取样本的生物学信息。
图1是层叠杂交荧光放大磁分离检测DNA的方法示意图；图2是层叠杂交荧光放大磁分离检测DNA方法的流程示意图。
具体实施方式下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述层叠放大DNA检测的原理图见图1、2。SiO2纳米颗粒上同时标记a，b两种序列不同的DNA，其中序列a与连接DNA的一端完全正配，序列b与靶序列DNA的一端完全正配。序列a的标记量远远大于序列b。磁性纳米颗粒表面标记另一种DNA序列e，其序列与靶DNA的另一端完全正配。两种修饰有DNA的纳米颗粒与靶DNA进行第一次杂交，纳米颗粒表面的序列b，e与靶序列形成”三明治”杂交结构，此时的SiO2纳米颗粒表面保留有大量的DNA单链a。另一种SiO2纳米颗粒上同时标记c，d两种序列不同的DNA，其中序列c与荧光DNA的完全正配，序列d与连接DNA的另一端完全正配，序列c的标记量远远大于序列d。序列c与荧光DNA杂交后，此SiO2纳米颗粒表面留下DNA单链d。
将荧光杂交后的SiO2纳米颗粒与前面第一次杂交后形成的”三明治”杂交结构混合，加入连接DNA进行第二次杂交，形成第二层次的“序列a-连接DNA-序列d”三明治杂交结构。就整个杂交体系来说，呈层叠放大结构。磁分离清洗后，去除多余的荧光分子和非特异性吸附，将”三明治”结构进行杂交变性，解链后的荧光DNA进行荧光检测。由于序列a的量远远大于序列b，序列c的量远远大于序列d，所以经过两次放大后，最终检测的荧光信号成指数级放大。此方法灵敏度得到更大的提高，可发展成为一种免PCR的DNA超灵敏检测方法(PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链反应，是一种对特定DNA片段在体外进行快速扩增的方法。该方法一改传统的分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便。短时间内能使几个拷贝的模版序列，甚至一个DNA分子扩增107～108倍，大大提高DNA的得率)。
我们可以直接从市场上得到纳米颗粒，或者应用溶胶-凝胶法制备纳米颗粒材料。一般来讲，纳米颗粒因其具有很大的比表面，因此表面能很高，容易聚集。我们对新合成得到的纳米粒子进行表面修饰改性来调节粒子间的相互作用(相互排斥/相互吸引)，并通过调节纳米粒子存在体系的介质性质来改变体系的电性质和介质与纳米粒子间的相互作用，达到稳定纳米粒子和可以长期保存的目的。
由于纳米粒子表面需要进行功能化才能进行与生物大分子之间的特异性结合，以及粒子之间的层叠(Layer-by-layer)放大，因此，纳米粒子的表面功能化具有重要意义。本发明中SiO2纳米颗粒可以在表面氨基硅烷化后接枝氨基，通过手臂分子戊二醛的连接作用，将末端带氨基的DNA分子固定在颗粒表面；也可以在SiO2纳米颗粒表面巯基硅烷化后接枝巯基，然后通过-SH/-S-S-交换反应将末端带二硫键的DNA固定在颗粒表面。磁性纳米颗粒可以通过表面氨基硅烷化后，在EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)存在下与DNA的5’磷酸基形成氨基磷酸键；也可以在磁性纳米颗粒表面固定亲和素后与生物素标记的DNA结合。
SiO2纳米颗粒表面固定两种序列不同的DNA分子，并要求一种DNA分子的固定量远远大于另一种DNA分子的固定量。
疾病样本DNA经过筛选，获取需要的靶DNA。
权利要求
1.一种层叠杂交荧光放大磁分离检测DNA的方法，其特征在于包括下列步骤(A)、在SiO2纳米颗粒上同时标记a，b两种序列不同的DNA；(B)、在磁性纳米颗粒表面标记e序列的DNA；(C)、第一次三明治杂交靶DNA的一端与SiO2纳米颗粒上b序列的DNA杂交，靶DNA的另一端与磁性纳米颗粒上e序列的DNA杂交；(D)、另一种SiO2纳米颗粒上同时标记c，d两种序列不同的DNA；(E)、另一种SiO2纳米颗粒上c序列的DNA与荧光DNA杂交；(F)、第二次三明治杂交第一次三明治杂交后的SiO2纳米颗粒上a序列的DNA与连接DNA的一端杂交，连接DNA的另一端与荧光杂交后的纳米颗粒上d序列的DNA杂交；(G)、第二次三明治杂交后产物经磁分离清洗后，去除多余的荧光分子和非特异性吸附；再将第二次三明治杂交后产物DNA变性，解链后的荧光DNA即可进行荧光检测。
全文摘要
本发明公开了一种层叠杂交荧光放大磁分离检测DNA的方法。它的技术要点在于包括下列步骤在SiO
文档编号C12Q1/68GK101082583SQ20061003569
公开日2007年12月5日 申请日期2006年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者聂立波, 贺全国, 陈洪, 何农跃 申请人:中山耐乐生物科技有限公司