专利名称：从红茶菌中分离纯化酿酒酵母菌的方法
技术领域：
本发明涉及从普通混杂的红茶菌液中纯化获得酿酒酵母菌菌株的方法。。
背景技术：
红茶菌又名“海宝”、“红茶菇”，是一种传统保健饮料，广泛流传于我国、日本、东南亚和南欧诸国。一般家庭中用经验方式培养红茶菌，从他人处获得红茶菌液，将此菌液接进配好的糖茶水中，根据温度的区别培养约7～15天，得到新的红茶菌。这种传统的培养方式存在以下缺点①容易污染杂菌，②菌种不易保藏，③产品品质不稳定，④不易大规模培养，⑤不易商业化开发。为解决这些问题，本报告拟用现代生物技术开发利用红茶菌这一传统饮料，提高生产红茶菌的技术水平，稳定产品的质量，推动传统饮料的商业化生产和销售。
现在已经知道红茶菌最主要的菌群是由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌三类微生物构成，各地的红茶菌产品中这些菌群的菌种多少存在区别，例如酵母菌中有接合酵母、球拟酵母、不显酵母、汉逊德氏酵母、热带假丝酵母、路德类酵母和酿酒酵母之分，醋酸菌中有巴氏醋酸菌、木醋酸菌、醋化醋酸菌、弱氧化醋酸菌等。由于地域性的差异导致红茶菌中菌群组成的差异，最终导致产品风味的差异，因此出现从不同地区引种的培养物风味出现较大差异。
在红茶菌中酵母菌的作用是将蔗糖、葡萄糖降解产生乙醇，醋酸菌氧化乙醇产生乙酸。酵母菌和醋酸菌还可以合成酯类、内酯等产物，赋予红茶菌特征性风味。根据研究，对红茶菌产品的胶状外形和风味具有最主要贡献的微生物是醋酸菌和酵母菌。乳酸菌只是由于也耐一定的酸度，才能在糖茶液中生存，产生对人体有益的微量的乳酸和其他化合物。实际上可以认为红茶菌是酵母菌和醋酸菌的松散的共生体。在家庭培养的红茶菌的表面通常形成很厚的胶状的灰白色膜状物，红茶菌菌膜是由醋酸菌将葡萄糖聚合成纤维素而成，在膜中存在醋酸菌和少量的酵母菌，在膜的下方存在较多的酵母菌、乳酸菌和其他微生物，酸性膜的存在阻止了其他微生物的污染。在静止培养条件下醋酸菌合成大量的胶膜导致糖类的不必要的浪费。茶叶中的儿茶素和单宁对很多微生物具有抑制作用，而红茶菌中的醋酸菌和酵母菌可以忍耐较高浓度的儿茶素和单宁，并且可以降解部分儿茶素和单宁，将其作为营养利用，降低了红茶菌液的苦涩味，残存的儿茶素也可作为营养保健成份。正是由于上述的各种原因导致形成红茶菌的特征性的风味。
一般家庭培养的红茶菌中还存在耐酸的霉菌和其他细菌，这些微生物对红茶菌产品没有什么贡献，但却是产品质量不稳定、导致污染的根本原因。
发明内容
本发明旨在提供一种分离纯化红茶菌中重要菌种—酿酒酵母菌的工艺方法。
具体的操作方法如下从红茶菌中分离纯化酿酒酵母菌的方法，包括下述步骤(1)、从红茶菌中分离纯化酿酒酵母菌A、取家庭或市售的红茶菌菌液，在无菌条件下，用取样器从菌膜下吸取0.1mL的菌液，采用0.85％生理盐水进行10倍、100倍、1000倍的梯度稀释，得三份稀释液；B、在超净工作台上，取融化后降温至约50℃的葡萄糖酵母膏(GYC)固体培养基倒平板，在平板中注入约20mL的培养基，在培养基中加入0.1～100mg/L浓度的抑制细菌的抗生素，待培养基凝固后，取上述三份稀释液0.05mL～0.2mL分别加入三个平板上，用三角刮铲将菌液均匀涂布于平板表面；C、将上述制备好的平板置于25℃～35℃的培养箱中培养3～7天；D、用接种环挑取经纯化的过各种典型的酵母菌菌株的菌落至另一新配置的葡萄糖酵母膏(GYC)固体培养基平板划线，将平板置于25℃～35℃的培养箱中培养3～7天；E、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化；得到20株以上纯的酵母菌菌株；(2)、按照《微生物分类学》的方法对分离获得的多个纯的酵母菌菌株进行菌种鉴定，经鉴定获得管囊酵母菌、酿酒酵母菌、德氏酵母菌、毕赤氏酵母菌共4种酵母菌；(3)、用斜面菌种接种静止培养红茶菌的方法以筛选酿酒酵母菌菌株将鉴定为管囊酵母菌、酿酒酵母菌、德氏酵母菌、毕赤氏酵母菌的4株酿酒酵母菌菌株与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌共4株醋酸菌菌株分别进行两两组合接种试验，即一种酿酒酵母菌加一种醋酸菌的组合接种试验，具体操作步骤如下
A、红茶菌糖茶液的配制，取原料茶叶3～10g，糖30～100g，水1000mL，用沸水冲泡茶叶和糖，保持微沸1～10min，静置使茶叶沉淀，取上清液，分装至试管、150mL或250mL三角瓶，108℃～121℃灭菌处理10～25min；B、按两两组合用接种环从上述纯化的4株酵母菌菌株和4醋酸菌菌株的纯培养中挑取一环混合分别接进红茶菌糖茶液中，20℃～35℃静止培养6～15天；即管囊酵母菌分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌菌株混合接种；即酿酒酵母菌分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接种；即德氏酵母菌分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接种；即毕赤氏酵母分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接种；结果是，酿酒酵母菌分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接种后均可以形成典型的带有胶膜的红茶菌液。
上述的红茶菌中酿酒酵母菌的分离纯化方法，从红茶菌菌液中分离纯化酿酒酵母菌的B步骤、D步骤中的葡萄糖酵母膏(GYC)固体培养基配方糖50～100g，酵母膏5～10g，CaCO315～30g，琼脂12～20g，水1000mL。
上述的红茶菌中酵母菌的分离纯化方法，所述葡萄糖酵母膏(GYC)固体培养基和红茶菌糖茶液配方中的糖为红糖或白糖或冰糖或蔗糖或葡萄糖或饴糖或蜂蜜，或者任意几种糖类的混合物。
上述的红茶菌中酵母菌的分离纯化方法，从红茶菌菌液中分离纯化酵母菌的B步骤中的抗生素为青霉素或链霉素或氯霉素或红霉素或庆大霉素，其浓度在1～100mg/L。
上述的红茶菌中酵母菌的分离纯化方法，所述的茶叶为绿茶、红茶、乌龙茶、茶末、各类茶叶提取物、几种茶叶的混合物。
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，其生长特征在于在GYC固体培养基上3-5天菌落大小2～4mm，圆形，边缘整齐，凸起，表面潮湿，奶酪状，乳白色；菌落粘状，接种环易挑起；在GYC液体培养基生长有沉淀；最高生长温度37℃。
细胞一般呈卵圆形，3～8×5～15μm，以出芽方式无性生殖，有性孢子为子囊孢子，无假菌丝。
本发明的菌种已按专利法实施细则第二十五条第三款的规定在国家知识产权局专利局指定的保藏单位——中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2006年4月6日，保藏号CGMCC1670，并附具存活性报告书。
采用现代生物工程技术发掘改进传统产品和工艺，是我国食品工业发展的重要方向。本发明采用微生物学技术从传统的红茶菌饮料中分离纯化出红茶菌的主要酿酒酵母菌菌株，以利于用纯菌株培养出具有醇、酸、甜、香独特风格的红茶菌。这种工艺具有无杂菌污染、菌种易保藏、产品质量稳定、降低消耗、易于工业化生产和产品商业化的特点。
红茶菌具有广泛的营养保健功能，生产红茶菌的原料价格低廉，采用现代生物技术提升传统的饮料产品的技术含量和质量水平，促进其商业化开发，具有重要的社会意义和经济价值。本发明分离纯化的酿酒酵母菌为工业化开发利用红茶菌提供了保证。
具体实施例方式
下面对本发明作进一步地说明。
实施例1酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，其生长特征在于在GYC固体培养基上3-5天菌落大小2～4mm，圆形，边缘整齐，凸起，表面潮湿，奶酪状，乳白色；菌落粘状，接种环易挑起；在GYC液体培养基生长有沉淀；最高生长温度37℃。
细胞一般呈卵圆形，3～8×5～15μm，以出芽方式无性生殖，有性孢子为子囊孢子，无假菌丝。
分离纯化酿酒酵母菌的方法如下(1)A、取家庭或市售的红茶菌菌液，在超净工作台上，在无菌条件下，用无菌的取样器从菌膜下吸取0.1mL的菌液，采用0.85％生理盐水进行10倍、100倍、1000倍的梯度稀释，逐渐稀释样品，得三份稀释液；B、在超净工作台上，取融化后降温至约50℃的葡萄糖酵母膏GYC固体培养基倒平板，在直径9cm的平板中注入约20mL的培养基，在培养基中加入0.1～100mg/L浓度的抑制细菌的抗生素，待培养基凝固后，取不同稀释度的三份稀释液菌液0.05mL～0.2mL加入三个平板上，用无菌的三角刮铲将菌液均匀涂布于平板表面；
C、将上述制备好的平板置于25℃～35℃的培养箱中培养3～7天；D、用接种环挑取经纯化的各种典型的酵母菌菌株的菌落至另一新配置的葡萄糖酵母膏GYC固体培养基平板划线，将平板置于25℃～35℃的培养箱中培养3～7天；持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化；上述B步骤、D步骤中的葡萄糖酵母膏GYC固体培养基配方白糖75g，酵母膏7g，CaCO325g，琼脂16g，水1000mL。
葡萄糖酵母膏GYC固体培养基和红茶菌糖茶液配方中的糖，可为红糖或白糖或冰糖或蔗糖或葡萄糖或饴糖或蜂蜜，或者任意几种糖类的混合物。
上述B步骤中的抗生素可以是青霉素或链霉素或氯霉素或红霉素或庆大霉素，其浓度在1～100mg/L。
(2)、按照《微生物分类学》(张纪忠主编，复旦大学出版社，1990)的方法对分离获得的多个纯的酿酒酵母菌菌株进行菌种鉴定，经鉴定获得管囊酵母菌、酿酒酵母菌、德氏酵母菌、毕赤氏酵母菌共4种酵母菌菌株。
按照微生物学研究的原则，在分离到某一纯菌株后，要根据微生物分类和鉴定的通用方法，对种名未知的菌株进行鉴定，获取有关其分类的信息，为进一步的研究和应用提供分类学的依据。
酵母菌不是分类学上的名称，而是单细胞的真菌的通称，酵母菌在分类学上分属于子囊菌、担子菌和半知菌。酵母菌的形态特征简单，基本为球形、卵园形，因此对酵母菌进行鉴定主要是以生理生化特征为主、形态学特征为辅。本研究是以张纪忠主编的《微生物分类学》第四篇(第368页—第428页)中规定的方法和技术对分离获得的酵母菌菌株进行鉴定，将这些菌株定为接合酵母、汉逊德氏酵母、路德酵母和酿酒酵母共4个种。
(3)、用斜面菌种接种静止培养红茶菌的方法以筛选酿酒酵母菌菌株将鉴定为管囊酵母菌、酿酒酵母菌、德氏酵母菌、毕赤氏酵母菌的4株酿酒酵母菌菌株与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌共4株醋酸菌菌株分别进行两两组合接种试验，即一种酿酒酵母菌加一种醋酸菌的组合接种试验，具体操作步骤如下A、红茶菌糖茶液的配制，取原料绿茶3～10g，蔗糖30～100g，水1000mL，用沸水冲泡茶叶和糖，保持微沸1～10min，静置使茶叶沉淀，小心取出取上清液，分装至试管、150mL或250mL三角瓶，108℃～121℃灭菌处理10～25min；B、按两两组合用接种环从上述纯化的4株酵母菌菌株和4株醋酸菌菌株的纯培养中挑取一环混合分别接进红茶菌糖茶液中，20℃～35℃静止培养6～15天；即管囊酵母菌分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接种；即酿酒酵母菌分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接种；即德氏酵母菌分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接种；即毕赤氏酵母分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接种；结果是，酿酒酵母菌分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接种后均可以形成典型的带有胶膜的红茶菌液。
利用纯化取得的酿酒酵母菌菌株与醋酸菌菌株配合，采用液体菌种培养静止红茶菌和振荡通气培养红茶菌的方法即可生产出典型的具有醇、香、酸、甜特征的红茶菌液。
实施例2在分离纯化酿酒酵母菌的方法中，上述B步骤、D步骤中的葡萄糖酵母膏(GYC)固体培养基配方葡萄糖50g，酵母膏5g，CaCO315g，琼脂12g，水1000mL。
配制红茶菌糖茶液的茶为红茶上述步骤中的糖也可以是任意几种糖类的混合物，比例任意调配。
其它同实施例1。
实施例3在分离纯化酿酒酵母菌的方法中，上述B步骤、D步骤中的葡萄糖酵母膏GYC固体培养基配方蜂蜜100g，酵母膏10g，CaCO330g，琼脂20g，水1000mL。
配制红茶菌糖茶液的茶为乌龙茶，也可以是茶末、各类茶叶提取物、几种茶叶的混合物。
其它同实施例1。
权利要求
1.从红茶菌中分离纯化酿酒酵母菌的方法，其特征在于(1)、从红茶菌中分离纯化酿酒酵母菌A、取家庭或市售的红茶菌菌液，在无菌条件下，用取样器从菌膜下吸取0.1mL的菌液，采用0.85％生理盐水进行10倍、100倍、1000倍的梯度稀释，得三份稀释液；B、在超净工作台上，取融化后降温至约50℃的葡萄糖酵母膏(GYC)固体培养基倒平板，在平板中注入约20mL的培养基，在培养基中加入0.1～100mg/L浓度的抑制细菌的抗生素，待培养基凝固后，取上述三份稀释液0.05mL～0.2mL分别加入三个平板上，用三角刮铲将菌液均匀涂布于平板表面；C、将上述制备好的平板置于25℃～35℃的培养箱中培养3～7天；D、用接种环挑取经纯化的过各种典型的酵母菌菌株的菌落至另一新配置的葡萄糖酵母膏(GYC)固体培养基平板划线，将平板置于25℃～35℃的培养箱中培养3～7天；E、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化；得到20株以上纯的酵母菌菌株；(2)、按照《微生物分类学》的方法对分离获得的多个纯的酵母菌菌株进行菌种鉴定，经鉴定获得管囊酵母菌、酿酒酵母菌、德氏酵母菌、毕赤氏酵母菌共4种酵母菌；(3)、用斜面菌种接种静止培养红茶菌的方法以筛选酿酒酵母菌菌株将鉴定为管囊酵母菌、酿酒酵母菌、德氏酵母菌、毕赤氏酵母菌的4株酿酒酵母菌菌株与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌共4株醋酸菌菌株分别进行两两组合接种试验，即一种酿酒酵母菌加一种醋酸菌的组合接种试验，具体操作步骤如下A、红茶菌糖茶液的配制，取原料茶叶3～10g，糖30～100g，水1000mL，用沸水冲泡茶叶和糖，保持微沸1～10min，静置使茶叶沉淀，取上清液，分装至试管、150mL或250mL三角瓶，108℃～121℃灭菌处理10～25min；B、按两两组合用接种环从上述纯化的4株酵母菌菌株和4醋酸菌菌株的纯培养中挑取一环混合分别接进红茶菌糖茶液中，20℃～35℃静止培养6～15天；即管囊酵母菌分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌菌株混合接种；即酿酒酵母菌分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接种；即德氏酵母菌分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接种；即毕赤氏酵母分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接种；结果是，酿酒酵母菌分别与木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接种后均可以形成典型的带有胶膜的红茶菌液。
2.根据权利要求1所述的红茶菌中酿酒酵母菌的分离纯化方法，其特征在于从红茶菌菌液中分离纯化酿酒酵母菌的B步骤、D步骤中的葡萄糖酵母膏(GYC)固体培养基配方糖50～100g，酵母膏5～10g，CaCO315～30g，琼脂12～20g，水1000mL。
3.根据权利要求1所述的红茶菌中酵母菌的分离纯化方法，其特征在于所述葡萄糖酵母膏(GYC)固体培养基和红茶菌糖茶液配方中的糖为红糖或白糖或冰糖或蔗糖或葡萄糖或饴糖或蜂蜜，或者任意几种糖类的混合物。
4.根据权利要求1所述的红茶菌中酵母菌的分离纯化方法，其特征在于从红茶菌菌液中分离纯化酵母菌的B步骤中的抗生素为青霉素或链霉素或氯霉素或红霉素或庆大霉素，其浓度在1～100mg/L。
5.根据权利要求1所述的红茶菌中酵母菌的分离纯化方法，其特征在于所述的茶叶为绿茶、红茶、乌龙茶、茶末、各类茶叶提取物、几种茶叶的混合物。
全文摘要
本发明涉及从普通混杂的红茶菌液中纯化获得酿酒酵母菌菌株的方法。所要解决的问题是提供一种分离纯化红茶菌中重要菌种—酿酒酵母菌的工艺方法。特点是包括下述步骤，取家庭或市售的红茶菌菌液进行纯化分离；按照《微生物分类学》一书中的方法对分离获得的多个纯的酵母菌菌株进行菌种鉴定；用斜面菌种接种静止培养红茶菌的方法以筛选酿酒酵母菌菌株；本发明采用微生物学技术从传统的红茶菌饮料中分离纯化出红茶菌的主要酿酒酵母菌菌株，以利于用纯菌株培养出具有醇、酸、甜、香独特风格的红茶菌。这种工艺具有无杂菌污染、菌种易保藏、产品质量稳定、易于工业化生产和产品商业化的特点。
文档编号C12R1/865GK1935980SQ20061003995
公开日2007年3月28日 申请日期2006年4月27日 优先权日2006年4月27日
发明者唐欣昀 申请人:安徽农业大学