专利名称：一株基因重组的红平红球菌及其在脱除原油有害物－硫和氮中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株基因重组菌及其在脱除原油有害物—硫和氮中的应用，具体地说，尤其涉及一株经过基因改造过的红平红球菌及其在脱除原油有害物—硫和氮中的应用。
背景技术：
石油中非烃化合物虽然在数量上不占主导地位，但其组成与含量决定了石油的品质。化石燃料煤和石油中所含有的有机硫和有机氮是环境的重要污染源，这些化合物燃烧时排放出大量的氧化硫、氧化氮等毒性气体，由此转化成的大面积酸雨严重污染大气和水源，破坏生态平衡，危害人类生存。化石燃料中的含氮化合物又是影响炼油工艺、产品性能的重要因素之一。极微量的氮化物就可引起催化裂化、加氢裂化、加氢精制等工艺过程中贵重的催化剂中毒，导致催化剂的使用寿命变短，增加生产成本，据统计减少氮含量的90％，能够使汽油产量提高20％。石油中含氮化合物包括吡啶、喹啉、异喹啉、吡咯、吲哚、咔唑等及其同系物，但主要为咔唑及其烷基衍生物。研究证明，咔唑等含氮化合物对含硫化合物的加氢脱硫过程有抑制作用，当总氮达到5％时就表现出强烈的抑制作用；在油品储藏过程中含氮化合物的存在降低了油品的抗氧化稳定性，导致油色变深及产生胶质和沉淀。另外，某些含氮化合物属于环境污染物，释放到环境中对人体危害较大，例如咔唑，毒理学实验表明咔唑对雄鼠精子细胞具有致突变性。
常规的化学脱有机硫、脱有机氮技术存在着一定的缺陷。高硫、高氮化石燃料必须预先经过处理才能进一步使用。物理的和化学的处理方法成本巨大，而微生物处理工艺由于操作压力、温度低，运转成本少，具有广阔的前景。化学脱硫方法—加氢脱硫(Hydrodesulfurization，HDS)通过催化过程，将有机硫转化成H2S气体，反应是在1～20Mpa的压力和290～450℃的温度下进行的。由于对化石燃料中的硫含量有严格规定，再加上HDS方法耗费比较高，而生物催化法脱硫(Biodesulfurization，BDS)成本低，在常温下即可进行，并且具有高专一性，这使得BDS方法成为一种可供选择的方法。为了保护环境，随着汽车排放控制新技术的发展和应用，以及对燃油质量的深入研究，国际上对燃料油的硫含量要求越来越严格。随着汽车工业的发展和环保要求日益严格，国产燃油质量问题越来越引起社会的关注。
石油脱氮技术的研究一直是石油化工行业的一个活跃的研究方向，石油脱氮技术可分为生物脱氮技术与非生物脱氮技术，目前非生物脱氮技术主要有酸洗脱氮、加氢脱氮、吸附脱氮、溶剂络合等。酸洗脱氮，如用磷酸处理柴油，可脱除总氮30～40％，碱氮90％以上，但需消耗一定数量的化学试剂，并遗留了酸渣处理问题；加氢精制能有效去除油品中非烃化合物及烯烃，全面提高油品质量，但加氢脱氮相对困难，一般轻质油脱氮率小于25％，重质油则更低；吸附法与溶剂络合法脱氮效果较好，可达到60％以上，但存在成本较高，消耗的化学品造成二次污染等问题。生物脱氮技术是近年来国际上令人关注的方向之一。石油中含氮化合物的微生物脱氮技术是一种有潜力的技术，目前国外对微生物脱氮的研究集中在石油中非碱性含氮化合物的降解，尤其是咔唑及其烷基衍生物的降解研究，主要原因一是由于咔唑及其衍生物在石油氮化物中所占比例高，二是由于石油中的碱性含氮化合物较非碱性含氮化合物更易通过有机溶剂提取等方法去除，较之其他含氮杂环化合物，咔唑相对较难被微生物降解。
化石燃料中的有机硫主要是二苯并噻吩(Dibenzothiophene，DBT)以及含有更多苯环的含硫化合物等，生物脱有机硫的研究主要是以较为简单的DBT为模式化合物来进行。现在已经发现许多微生物能够沿着硫专一途径降解DBT。它们不打开这些含硫化合物的苯环结构，因而保留了燃料的热值，具有较大的应用前景，成为近年来研究的热点。同样咔唑(carbazole)也是生物脱氮研究的模式化合物，近年来也得到了很大的重视。现在报道筛选得到的咔唑降解菌株都是遵循同样的代谢途径即在咔唑降解基因carABC所编码的酶系的作用下，降解咔唑生成邻氨基苯甲酸，然后在其他酶(CarDEF)的作用下降解邻氨基苯甲酸生成儿茶酚后，裂解开环生成丁二酸后被菌株完全代谢。该途径完全代谢咔唑，应用该菌株，相比之下会损失燃烧值，所以也限制了生物脱氮的应用。值得注意的是咔唑代谢途径中的中间产物邻氨基苯甲酸是一个很有价值的产物，可以作为合成L-色氨酸的前体化合物。另一方面，生物脱硫、生物脱氮现在是用不同的菌株来完成，在工业化大规模应用的时候必将提高处理的成本，如果能把生物脱硫和生物脱氮过程结合起来，用一个菌株来操作就会大大降低化石燃料生物处理的成本。
发明内容
针对现有生物处理化石燃料技术中的不足，本发明要解决的问题是提供一株红平红球菌，以及利用红平红球菌来同时降解燃料中有害的含硫含氮化合物，所述应用的方法是使用生物法同时脱除原油中的有机硫、有机氮。
本发明提供的一株能够专一性降解DBT生成2-羟基联苯，同时可以降解咔唑生成邻氨基苯甲酸的菌株，命名为红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN。该菌株于2005年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，保藏中心编号为CCTCC No.M205141。
上述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141具有如下生物学特征红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141为革兰氏阳性菌，严格好氧，不运动，形态有杆状和棒杆状，菌落平坦，不透明，凸起，有光泽，不产生水溶性色素，边缘整齐，生长后期为粉红色；表面光滑，无气生菌丝体；含有饱和及不饱和脂肪酸，同时还含有结核菌脂酸；胞壁属于IV型，部分抗酸。部分生化特征如下可以氧化葡萄糖产酸，不发酵，不产气，不能水解淀粉，过氧化氢酶阳性，硝酸盐还原反应阴性。
上述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141中含有的咔唑降解基因序列长度为5070个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141可以降解二苯并噻吩生成2-羟基联苯，同时降解咔唑生成邻氨基苯甲酸。
上述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141的培养温度为25～37℃，可以在基本无机盐培养基上以噻吩类化合物作为唯一硫源生长同时降解咔唑，也可以在含有100μg/ml卡那霉素的LB培养基上生长。
本发明涉及的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141在原油脱硫、脱氮中的应用，其处理方法涉及的步骤顺序如下(1)菌种选择选用红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141；(2)细菌细胞培养用步骤(1)的菌株，在无菌条件下接种到含有质量体积比为0.003～0.008％的二甲基亚砜(DMSO)的液体无机盐基本培养基中，25℃～37℃条件下，振荡培养40～60小时，制得细菌细胞培养液；(3)收集细胞取步骤(2)所得的培养液4,500转/每分钟离心15～20分钟，收集沉淀细胞，使用pH7.0的100mM磷酸钾缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集沉淀细胞；(4)休止细胞制备使用如步骤(3)的磷酸钾缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到6～25克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌细胞悬浊液，也称生物催化剂；(5)处理样品在反应体系中(20～50mL)，以步骤(4)所得的细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶8～25，在25～37℃条件下，200转/每分钟振荡48～72小时，进行样品处理；(6)油样检测以12,000转/每分钟离心8～15分钟分离步骤(5)中处理后的样品，得到上层原油样品；取0.2～3μL原油样品，使用硫氮元素分析仪测定原油中残留的硫含量和氮含量，然后以未处理的原油样品的硫含量和氮含量为对照，得出经以红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141处理的原油中硫化合物和氮化合物的脱除率。
其中，步骤(2)中所述的菌体培养温度优选是28～32℃；二甲基亚砜(DMSO)的浓度优选为0.005～0.008％。
其中，步骤(2)中所述的菌体培养时间优选是36～50小时。
其中，步骤(2)中细菌细胞培养额外添加100μg/ml卡那霉素。
其中，步骤(4)中所述的生物催化剂的菌体浓度优选是每升8～17克干细胞重的菌体；其中，步骤(5)所述原油与水相的体积比例优选为1∶15～20。
其中，步骤(5)中处理样品的温度优选为27～34℃，样品振荡时间优选为60～72小时。
在上述利用红平红球菌细胞脱除原油中有机硫和有机氮的方法中，菌株培养使用液体基本无机盐培养基2(Basal Salts Medium 2，BSM2)，配方为甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，质量百分比为1％的CaCl2100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
以质量体积比为0.002～0.008％的DMSO作为硫源。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
上述LB培养基配方如下，1升蒸馏水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氢氧化钠调节pH值到7.5±0.2，固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6％的琼脂粉，121℃条件下灭菌20分钟。
利用本发明所述的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141可以降解DBT，生成相应的不破坏碳架结构的产物2-羟基联苯，2-羟基联苯更加容易溶解于油相，可以返回原油相中，保持原油的燃烧值；同时红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141可以降解咔唑生成邻氨基苯甲酸，生成的邻氨基苯甲酸可以释放到水相中作为有价值的中间体回收利用(如图1所示)。
本发明采用红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141休止细胞作为生物催化剂，能够有效地同时降解水体系中的DBT和咔唑。经过检测发现，红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141可以在21小时内完全降解掉0.5mM的DBT和200mg/L的咔唑(如图2所示)。使用气相-质谱联用技术分析红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141降解模式化合物DBT和咔唑，发现体系中存在DBT，咔唑，二苯并噻吩砜，2-羟基联苯和邻氨基苯甲酸(三甲基硅烷化的形式)。通过产物的分析确认红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141可以专一性的降解DBT生成不损失燃烧值的2-羟基联苯同时降解咔唑生成有价值的中间体邻氨基苯甲酸(如图3所示)。进一步使用红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141的细胞来处理原油。使用Antek7000硫氮元素分析仪(美国，Antek公司产品)测定原油的初始含硫量为3,022ppm；初始含氮量为4,656ppm。经过红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141的作用，硫含量降低至2,508ppm，达到17％的脱硫率；同时氮含量降低至3,220ppm，达到30％的脱氮率。使用GC-PFPD(气相色谱-脉冲式火焰光度检测器)测定休止细胞处理前后的原油中的含硫化合物的变化。图4所示的是经过休止细胞处理之后，GC-PFPD测定原油中的含硫化合物的分布情况，此时总硫含量为2,508ppm。处理前后含硫化合物的比较，可以明显看出经过休止细胞处理之后，原油中的大部分可检测到的含硫化合物，如噻吩类，二苯并噻吩类及更加复杂的含硫化合物都基本脱除，起到了很好的脱硫效果。同时使用气相-质谱联用技术(GC-MS)分析红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)XPDN CCTCC No.M205141作用原油前后里面的咔唑类化合物的含量变化。如表1所示，经过红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141处理，原油中大部分的咔唑类化合物得到了降解，说明菌株可以同时降解原油中的含硫化合物和咔唑类含氮化合物。例如在30℃条件下，使用本发明所述的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141细胞可将硫含量为3,022ppm的原油中的硫，降低到2,508ppm，脱除率达到了17％；同时可将氮含量从4,656ppm降低到3,220ppm，脱氮率达到了30％。
表1红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141处理原油前后咔唑类化合物的含量
根据文献和专利检索，Fedorak等人在1984年采用混合菌处理原油，也造成了烷烃的损失。Setti等人1992年报道采用一株能降解烷烃的假单胞菌降解重油中的硫化合物，但是脱硫的过程也造成了烷烃的损失。Kilbane等人2000年报道使用一株假单胞菌脱除页岩油(shale oil)中的氮化合物，仅得到了5％的脱除率。同样Kilbane等人在2002年报道利用一株筛选到的咔唑降解菌处理页岩油，该菌只能降解原油中的咔唑和带有一个甲基的咔唑，而对二甲基的咔唑无降解能力。利用专一性脱硫的红平红球菌同时降解原油中的含硫含氮化合物还未见有文献和专利报道。
红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141对原油的总硫含量达到17％的脱除率，同时对总氮的脱除率为30％；而在同样条件下红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8 ATCC No.53968对相同原油中的总硫有15.3％的脱除率，但是对总氮脱除没有任何效果。说明本发明的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141具有更好的处理效果，在实际应用中比红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968具有更大的价值。
本发明的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141是一个专一性降解含硫化合物并同时可以降解咔唑生成邻氨基苯甲酸的菌。处理原油结果发现有明显的同时脱硫脱氮效果，本菌株具有重要的实际应用价值。
本发明提供的一株红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN，于2005年12月5日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，保藏地址中国湖北省武汉市武汉大学，邮政编码430072，其保藏编号为CCTCC No.M205141。
图1使用红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141处理原油的示意图。
图中示菌体细胞可以降解DBT生成2-羟基联苯返回油相，不损失燃烧值，同时降解咔唑生成邻氨基苯甲酸释放到水相中，可以回收利用。
图2红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141同时降解水体系中的DBT和咔唑的降解曲线。
图3使用气相-质谱联用技术(GC-MS)分析红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141降解DBT和咔唑的途径。
其中A2-羟基联苯；B二苯并噻吩；C咔唑；D二苯并噻吩砜；E邻氨基苯甲酸(三甲基硅烷化的邻氨基苯甲酸)图4使用GC-PFPD检测休止细胞处理前后，原油中的含硫化合物的变化。
其中图对照是处理之前的原油含硫化合物的色谱图，图处理后是红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141处理之后的原油含硫化合物的色谱图。
具体实施例方式
实施例1红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141菌株的构建。
使用聚合酶链式反应(PCR)的手段，使用引物P15’-gCCgACTAgTAAggAgATggACgTggCg-3’和引物P25’-gACgAgTACTgCAgCgCCgTCATACgTTgC-3’从咔唑降解菌株假单胞菌(Pseudomonas sp.)XLDN4-9的基因组中获得咔唑降解基因carABC，该基因片段编码的酶系负责降解咔唑生成邻氨基苯甲酸。将该基因片断使用SpeI和ScaI双酶切后连接到使用SpeI和SnaBI双酶切处理过的质粒载体pRESQ上，其中ScaI和SnaBI酶切位点都是平末端，可以在连接酶的作用下连接起来，利用上述方法构建了重组质粒pCarABC，该质粒可以使carABC基因在红平红球菌中表达。使用电穿孔转化技术将重组质粒pCarABC导入红平红球菌XP中，该菌株可以降解DBT生成2-羟基联苯。上述的电穿孔转化技术条件如下在细胞生长至OD600＝0.9～1.2时收集菌体，4000转每分钟离心收集菌体，使用无菌蒸馏水洗涤菌体两遍，同样离心条件收集菌体，最后使用含有质量体积比为10％的甘油重悬菌体，制备浓度为1011个细胞/mL的感受态细胞，在4℃条件下将0.1mL上述的感受态细胞加入内壁间隔为0.1厘米的电转化杯(美国Bio-Rad公司产品)，电击电压1500伏/厘米，电击结束后立即加入0.4mL的LB培养基，30℃振荡培养3小时，然后涂布含有100μg/mL卡那霉素的LB固体平板，通过筛选获得了红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN。
将红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN接种于含有质量体积比为0.005％的DMSO的固体斜面基本无机盐培养基，30℃条件下静止培养40小时；然后将斜面上的菌转接到25mL的液体基本无机盐培养基2中，30℃，转速250转/每分钟条件下，震荡培养48小时，制得种子液；以10％的体积比的接种量，将种子液接种于100mL含有质量体积比为0.005％的DMSO液体无机盐基本培养基中，30℃条件下，振荡培养30小时。将获得的菌体4,500转/每分钟离心15分钟，收集沉淀细胞，使用pH7.0的100mM磷酸钾缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2次，收集沉淀细胞；使用上述磷酸钾缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到8克干细胞/升，将此收集得到的细胞取25ml加入质量体积比为0.005％的DBT和质量体积比为0.02％的咔唑，30℃，转速250转/每分钟条件下，震荡培养24小时。测定剩余的DBT和咔唑含量，发现经过红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN处理后，DBT和咔唑完全被降解掉，同时生成了质量体积比为0.012％的邻氨基苯甲酸，证实了获得红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN具有同时降解DBT和咔唑的能力。
上述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN，于2005年12月5日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，保藏地址中国湖北省武汉市武汉大学，邮政编码430072，其保藏编号为CCTCC No.M205141。
上述菌株培养使用液体基本无机盐培养基2(Basal Salts Medium 2，BSM2)，配方为甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，质量百分比为1％的CaCl2100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
上述固体斜面基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.6％的琼脂粉。
上面所述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl120mmol/L。
上面所述的维生素混合物的配方为，每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB 12(Cyanocobalamin)。
上述LB培养基配方如下，1升蒸馏水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氢氧化钠调节pH值到7.5左右，固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6％的琼脂粉，121℃条件下灭菌20分钟。
上述的LB固体平板为上述LB培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.6％的琼脂粉。
实施例2上述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141中含有的咔唑降解基因的提取。
使用LB培养基培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.5ml培养物，5000转/每分钟离心5分钟；沉淀物加入567μl的TE缓冲液，TE缓冲液配方如下10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用盐酸调整pH为8.0，用吸管反复吹打使之重悬，加入30μl质量体积比为10％的十二烷基磺酸钠(SDS)和3μl 20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育2小时；加入100μl，5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80μl的CTAB/NaCl溶液，所述CTAB/NaCl溶液配方如下质量体积比为10％的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)溶解于0.7mol/L的NaCl中，混匀，于65℃温育10分钟；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12,000转/每分钟离心10分钟，将上清液转入一个新管中；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，12,000转/每分钟离心10分钟，将上清转入一支新管中；加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来，用一个封口的离心管将沉淀转移至1ml的70％乙醇中洗涤；12,000转/每分钟离心20分钟，弃上清，用冻干机稍加干燥，重溶于100μl的TE缓冲液。以提取的基因组DNA为模板，利用上海博亚生物技术有限公司合成的引物P1和P2(与实施例1中给出的引物P1和P2相同)，进行PCR扩增，在100μl反应体系依次混匀下列试剂63μl H2O，10μl 10倍浓度的PCR反应缓冲液，10倍浓度的PCR反应缓冲液配方如下500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)、100mmol/L的用盐酸调整pH为8.8的Tris缓冲液、1mg/ml的牛血清白蛋白、15mmol/L的MgCl2，8μl 25mmol/LMgCl2，16μl 4种dNTP的混合物，1μl引物P1，1μl引物P2，1μl模板DNA即上述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141的基因组DNA，1μl LA Taq DNA聚合酶，混匀后离心5秒钟。将混合物在94℃加热5分钟。94℃变性1分钟，55℃退火0.5分钟，72℃延伸6分钟，总共30个循环。最后一个循环后，于72℃下保温10分钟，使反应混合物扩增充分，得到红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCM205141的咔唑降解基因的PCR扩增产物，将产物测序。
测序结果红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141菌株含有的咔唑降解基因序列长度为5070bp，与实施例1所述的咔唑降解基因序列完全一致，说明导入红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141的基因为正确的基因，核苷酸序列如下gccgactagt aaggagatgg acgtggcgaa cgttgatgag gcaattttaa aaagagtaaa 60aggctgggcg ccctacgtgg atgcgaagct aggctttcgc aatcattggt acccggtgat 120gttttcgaaa gagatcgacg agggcgagcc gaagacacta aaactgctcg gtgagaactt 180gctcgtcaat cgtatcgatg ggaagctgta ttgcctcaag gaccgctgcc tacatcgcgg 240cgtccagttg tcggtcaaag tcgagtgcaa aacgaagtcg acgatcacat gctggtacca 300cgcgtggacc tatcgctggg aagacggcgt tctgtgcgac atcttgacga atccgacaag 360cgcacagatc ggtcgacaaa agctgaaaac ttacccagtg caggaagcca agggctgcgt 420cttcatttat cttggcgatg gcgaccctcc tcccttggcc cgcgatacgc cacccaattt 480ccttgacgat gacatggaaa tcctcgggaa gaaccaaatc atcaagtcta actggcgcct 540cgctgtggaa aacggtttcg atccgagcca catttatatt cacaaagact caattctggt 600caaggacaac gatcttgcct tgccactagg tttcgcgcca ggaggggatc gaaagcaaca 660aactcgtgtg gttgacgatg acgtcgtcgg acgcaagggt gtttacgatc ttattggcga 720acatggggtc ccagtgtttg agggaactat cgggggcgaa gtggtccgcg aaggtgccta 780cggcgaaaaa attgtagcga acgatatctc catttggctc ccgggtgttc tcaaggtcaa 840tccgttcccc aatccggaca tgatgcagtt cgagtggtac gtgccgattg acgaaaacac 900acactattac ttccaaactc ttggcaaacc atgtgccaat gacgaggaac ggaagaatta 960cgaacaagag ttcgaaagca agtggaaacc gatggcgctc gaagaattca acaacgatga 1020catctgggct cgcgaagcta tggtggattt ctacgccgat gataaaggct gggtcaacga 1080gattttgttc gaggtggacg aggctatcgt ggcatggcgc aagctggcga gcgaacacaa 1140tcagggtatt cagacccaag cgcacgtttc gggctgaaag aatttgtcgg tagtcgtgcc 1200actcaccaat ggcacgaaca acgaggagaa cgcaatggct cgatatgaag tcgatcgcct 1260Aattcaggac atgtcgaaaa aagaagggct cattgggcgc gtgatcgaca caccatcgga 1320tgtctttgag gagtacggtt taacgcctcc tgaacgcact gcgctgctcg agggtactcc 1380gcaagcacta gcttcgattg gtgtgcatcc gattctgcag atgcactact tgatgtacaa 1440aaatcctgaa atggctactc acgtttctat taaggattat tccgatatgt tgaaaggagg 1500
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实施例3利用红平红球菌细胞同时降解水体系中的咔唑和二苯并噻吩方法，处理温度为30℃。
本发明利用红平红球菌在同时降解水体系中的DBT和咔唑的应用，其方法涉及的步骤顺序如下(1)菌种选择红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141；(2)菌种培养红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141接种于100mL含有质量体积比为0.008％的DMSO液体无机盐基本培养基中，30℃条件下，振荡培养48小时；(3)收集细胞取步骤(2)所得的培养液4,500转/每分钟离心10分钟，收集沉淀细胞，使用pH7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2次，收集沉淀细胞；(4)休止细胞制备使用如步骤(3)的磷酸缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到8克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞悬浊液，也称生物催化剂；(5)处理样品在20mL的反应体系中，以步骤(4)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入质量体积比为0.01％的DBT和质量体积比为0.02％的咔唑，在30℃条件下，250转/每分钟振荡21小时，进行样品处理；(6)检测将步骤(5)所处理的样品，加入20mL的乙酸乙酯，30℃条件下，250转/每分钟振荡1小时，以萃取水相中残余的DBT和咔唑，然后将该体系以10,000转/每分钟离心5分钟，得到上层乙酸乙酯相，该乙酸乙酯相体系中应该含有要检测的DBT和咔唑；取1μL乙酸乙酯样品，使用气相-氢火焰检测器(GC-FID)测定乙酸乙酯中残留的DBT和咔唑，然后以未加入红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDNCCTCC No.M205141处理的样品中的DBT和咔唑含量为对照，得出经红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141处理后，水体系中的DBT和咔唑得到100％的降解，说明红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141就是目的菌株；在上述利用红平红球菌细胞脱除水体系中的DBT和咔唑的方法中，菌株培养使用液体基本无机盐培养基2(Basal Salts Medium，BSM2)，配方为甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，质量百分比为1％的CaCl2100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
以0.005％的DMSO作为硫源。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB 12(Cyanocobalamin)。
实施例4利用红平红球菌休止细胞脱除原油中有机硫和有机氮的方法，其中加入的原油与水相的体积比为1∶15，处理温度为27℃。
本发明利用红平红球菌在原油脱硫脱氮中的应用，其脱硫脱氮方法涉及的步骤顺序如下(1)菌种选择红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141；(2)菌种培养将红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141接种于50mL含有质量体积比为0.005％的DMSO液体无机盐基本培养基中，28℃条件下，振荡培养36小时；(3)收集细胞取步骤(2)所得的培养液4,500转/每分钟离心10分钟，收集沉淀细胞，使用pH7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2次，收集沉淀细胞；(4)休止细胞制备使用如步骤(3)的磷酸缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到12克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞悬浊液，也称生物催化剂；(5)处理样品在30mL的反应体系中，以步骤(4)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶15，在27℃条件下，250转/每分钟振荡60小时，进行样品处理；(6)油样检测以12,000转/每分钟离心10分钟分离步骤(5)中处理后的样品，得到上层原油样品；取0.2μL步骤原油样品，使用Antek7000硫氮元素分析仪(美国，Antek公司产品)测定原油中残留的硫含量和氮含量，然后对照未处理的样品硫含量和氮含量，得出经红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141处理的原油的脱硫率为7.3％，脱氮率为15％；在上述利用红平红球菌细胞脱除原油中有机硫、有机氮的方法中，菌株培养使用液体基本无机盐培养基2(Basal Salts Medium 2，BSM 2)，配方为甘油4克/升，KH2P042.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，质量百分比为1％的CaCl2100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
以0.005％的DMSO作为硫源。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB 12(Cyanocobalamin)。
实施例5利用红平红球菌细胞脱除原油中有机硫和有机氮的方法，其中加入的原油与水相的体积比为1∶20，处理温度为30℃。
本发明利用红平红球菌在原油脱硫脱氮中的应用，其脱硫脱氮方法涉及的步骤顺序如下(1)菌种选择选用红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141；
(2)菌种培养将红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141接种于50mL含有质量体积比为0.008％的DMSO液体无机盐基本培养基中，30℃条件下，振荡培养48小时；(3)收集细胞取步骤(2)所得的培养液4,500转/每分钟离心10分钟，收集沉淀细胞，使用pH7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2次，收集沉淀细胞；(4)休止细胞制备使用如步骤(3)的磷酸缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到16克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞悬浊液，也称生物催化剂；(5)处理样品在30mL的反应体系中，以步骤(4)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶20，在30℃条件下，250转/每分钟振荡72小时，进行样品处理；(6)油样检测以12,000转/每分钟离心10分钟分离步骤(5)中处理后的样品，得到上层原油样品；取0.2μL原油样品，使用Antek7000硫氮元素分析仪(美国，Antek公司产品)测定原油中残留的硫含量和氮含量，然后对照未处理的样品硫含量和氮含量，得出经红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141处理的原油的脱硫率为17％，脱氮率为30％；在上述利用红平红球菌细胞脱除原油中有机硫、有机氮的方法中，菌株培养使用液体基本无机盐培养基2(Basal Salts Medium 2，BSM 2)，配方为甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，质量百分比为1％的CaCl2100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
以0.008％的DMSO作为硫源。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
实施例6利用红平红球菌休止细胞脱除原油中有机硫和有机氮的方法，其中加入的原油与水相的体积比为1∶18，处理温度为34℃。
本发明利用红平红球菌在原油脱硫脱氮中的应用，其脱硫脱氮方法涉及的步骤顺序如下
(1)菌种选择选用红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141；(2)菌种培养将红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141接种于50mL含有质量体积比为0.005％的DMSO液体无机盐基本培养基中，32℃条件下，振荡培养36小时；(3)收集细胞取步骤(2)所得的培养液4,500转/每分钟离心10分钟，收集沉淀细胞，使用pH7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2次，收集沉淀细胞；(4)休止细胞制备使用如步骤(3)的磷酸缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到15克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞悬浊液，也称生物催化剂；(5)处理样品在30mL的反应体系中，以步骤(4)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶18，在34℃条件下，250转/每分钟振荡68小时，进行样品处理；(6)油样检测以12,000转/每分钟离心10分钟分离步骤(5)中处理后的样品，得到上层原油样品；取0.2μL原油样品，使用Antek7000硫氮元素分析仪(美国，Antek公司产品)测定原油中残留的硫含量和氮含量，然后对照未处理的样品硫含量和氮含量，得出经红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141处理的原油的脱硫率为10％，脱氮率为12％；在上述利用红平红球菌细胞脱除原油中有机硫、有机氮的方法中，菌株培养使用液体基本无机盐培养基2(Basal Salts Medium 2，BSM 2)，配方为甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，质量百分比为1％的CaCl2100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
以0.008％的DMSO作为硫源。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB 12(Cyanocobalamin)。
实施例7利用红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968休止细胞脱除原油中有机硫的方法，其中加入的原油与水相的体积比为1∶20，处理温度为30℃。
本发明利用红平红球菌在原油脱硫脱氮中的应用，其脱硫脱氮方法涉及的步骤顺序如下(1)菌种选择红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968〖该菌株保藏于美国典型微生物收藏中心(12301 Park Lawn Drive，Rockville，Md.20852)〗；(2)菌种培养将红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968接种于50mL含有质量体积比为0.005％的DMSO液体无机盐基本培养基中，30℃条件下，振荡培养36小时；(3)收集细胞取步骤(2)所得的培养液4,500转/每分钟离心10分钟，收集沉淀细胞，使用pH7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2次，收集沉淀细胞；(4)休止细胞制备使用如步骤(3)的磷酸缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到17克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞悬浊液，也称生物催化剂；(5)处理样品在30mL的反应体系中，以步骤(4)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶20，在30℃条件下，250转/每分钟振荡72小时，进行样品处理；(6)油样检测以12,000转/每分钟离心10分钟分离步骤(5)中处理后的样品，得到上层原油样品；取0.2μL原油样品，使用Antek7000硫氮元素分析仪(美国，Antek公司产品)测定原油中残留的硫含量和氮含量，然后对照未处理的样品硫含量和氮含量，得出经红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968处理的原油的脱硫率为15％，脱氮率为0％；在上述利用红平红球菌细胞脱除原油中有机硫、有机氮的方法中，菌株培养使用液体基本无机盐培养基2(Basal Salts Medium 2，BSM 2)，配方为甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，质量百分比为1％的CaCl2100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
以0.005％的DMSO作为硫源。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB 12(Cyanocobalamin)。
通过实施例7与实施例5的对比可以看到，红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141对原油的总硫含量达到17％的脱除率，同时对总氮的脱除率为30％；而在同样条件下红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968对相同原油中的总硫有15.3％的脱除率，但是对总氮脱除没有任何效果，说明上述的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141具有更好的处理效果，在实际应用比红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968具有更大的价值。
序列表SEQ ID N0.1<110>山东大学<120>一株基因重组的红平红球菌及其在脱除原油有害物--硫和氮中的应用<141>2006-2-15<211>5070<212>DNA<213>红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)<221>红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141咔唑降解基因<222>(1)…(5070)<400>
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权利要求
1.一株红平红球菌，其特征在于该菌名为红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN，已于2005年12月5日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，其保藏编号为CCTCC No.M205141。
2.如权利要求1所述的红平红球菌，其特征是，红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141为革兰氏阳性菌，严格好氧，形态有杆状和棒杆状，菌落平坦，不透明，凸起，有光泽，不产生水溶性色素，边缘整齐，生长后期为粉红色；表面光滑，无气生菌丝体；含有饱和及不饱和脂肪酸，同时还含有结核菌脂酸；胞壁属于IV型，部分抗酸；所述的红平红球菌中含有的咔唑降解基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1；所述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141可以降解二苯并噻吩生成2-羟基联苯，同时降解咔唑生成邻氨基苯甲酸。
3.权利要求1所述的红平红球菌在脱除原油有害物—硫和氮中的应用。
4.如权利要求3所述的红平红球菌在脱除原油有害物—硫和氮中的应用，其方法涉及的步骤顺序如下(1)菌种选择选用红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141；(2)细菌细胞培养用步骤(1)的菌株，在无菌条件下接种到含有质量体积比为0.003～0.008％的二甲基亚砜的液体无机盐基本培养基中，25℃～37℃条件下，振荡培养40～60小时，制得细菌细胞培养液；(3)收集细胞取步骤(2)所得的培养液4,500转/每分钟离心15～20分钟，收集沉淀细胞，使用pH7.0的100mM磷酸钾缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集沉淀细胞；(4)休止细胞制备使用如步骤(3)的磷酸钾缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到6～25克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌细胞悬浊液，也称生物催化剂；(5)处理样品在反应体系中，以步骤(4)所得的细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶8～25，在25～37℃条件下，200转/每分钟振荡48～72小时，进行样品处理；(6)油样检测以12,000转/每分钟离心8～15分钟分离步骤(5)中处理后的样品，得到上层原油样品；取0.2～3μL原油样品，使用硫氮元素分析仪测定原油中残留的硫含量和氮含量，然后以未处理的原油样品的硫含量和氮含量为对照，得出经以红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141处理的原油中硫化合物和氮化合物的脱除率。
5.如权利要求4所述的红平红球菌在原油脱硫脱氮中的应用，其特征在于，步骤(2)、(3)中所述的菌体培养温度是28～32℃；二甲基亚砜的浓度为0.005～0.008％。
6.如权利要求4所述的红平红球菌在原油脱硫脱氮中的应用，其特征在于，步骤(2)中所述的菌体培养时间是36～50小时。
7.如权利要求4所述的红平红球菌在原油脱硫脱氮中的应用，其特征在于，步骤(3)、(4)中所述的生物催化剂的菌体浓度是每升8～17克干细胞重的菌体。
8.如权利要求4所述的红平红球菌在原油脱硫脱氮中的应用，其特征在于，步骤(5)中所述的原油与水相的体积比例为1∶15～20。
9.如权利要求4所述的红平红球菌在原油脱硫脱氮中的应用，其特征在于，步骤(5)中处理样品的温度为27～34℃，样品振荡时间为60～72小时。
全文摘要
本发明公开了一株基因重组的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN，该菌株于2005年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，保藏中心编号为M205141。本发明还公开了所述的红平红球菌及其在脱除原油有害物一硫和氮中的应用，其脱硫脱氮方法包括菌体培养；收集菌体；制备休止细胞；处理原油样品；油样检测等步骤；该方法操作简单，具有在处理原油时一次脱除原油有害物—硫和氮的能力，降解二苯并噻吩生成2－羟基联苯并降解咔唑生成邻氨基苯甲酸等特点，在污染治理方面具有很大的应用前景。
文档编号C12S1/02GK1834229SQ200610042259
公开日2006年9月20日 申请日期2006年2月15日 优先权日2006年2月15日
发明者许平, 于波, 马翠卿, 李福利, 冯进辉, 周文娟, 陶飞, 王颖, 蔡晓凤 申请人:山东大学