专利名称：一种辣椒小孢子诱导获得胚状体的培养方法
技术领域：
本发明属于细胞工程领域，涉及一种辣椒小孢子的游离、培养方法，尤其是一种辣椒小孢子诱导获得胚状体的培养方法。
背景技术：
通过小孢子培养可获得单倍体植株。然后，经秋水仙素加倍可获得双单倍体(二倍体纯系)，即可直接获得纯系作为亲本或育种的中间材料。游离小孢子培养是在单细胞水平上获得纯系的一种方法，获得的纯系系内性状整齐一致、世代间稳定性强、具有高度的纯合性。
单倍体在遗传和育种上具有重要的理论意义和应用价值，单倍体育种技术的研究和应用大大加速了选育新品种的进程。如果在杂交育种中把杂交一代或二代已发生基因重组的单倍体配子或植株染色体经人工加倍，就可以得到纯合二倍体株系(DH株系)，不必再进行多代连续自交选育纯系，从而极大地缩短了育种周期。此外，DH株系中的双单倍体植株也是进行分子标记和基因图谱研究的理想材料。多年来，游离小孢子培养技术一直是国内外细胞工程领域的重要内容之一，越来越引起世界各国科研工作者的重视。不仅因为它的实验体系对于认识细胞全能性、发育遗传机制等重大理论问题具有重要价值，而且在植物遗传育种研究方面具有许多重要用途。
辣椒杂种优势十分明显，杂种优势的利用已成为辣椒育种的主要途径。选育综合性状优良，抗病、优质、高产、配合力高的纯系是辣椒杂种优势利用的关键技术。辣椒属常异花授粉作物，天然杂交率高，通过自交分离选育纯系一般需要4～6代选择才能获得，不仅时间长，选择效率差，而且基因之间存在显隐性关系，因此很难选育出综合性状优良、配合力高，适宜作为强优势组合亲本的纯系。开展辣椒小孢子培养技术研究，对于选育强优势组合亲本纯系，加速育种进程，培育强优势辣椒组合具有重要意义。
利用小孢子培养选育亲本自交系(纯系)已广泛应用于大白菜、甘蓝等十字花科植物，然而目前尚未见从辣椒小孢子大量诱导获得胚状体进而再生成植株的报道。众所周知，从小孢子诱导胚状体，再培育其发育成为单倍体植株是小孢子培养最为有效的途径。胚状体是起源于一个非合子细胞，经过胚胎发育过程形成胚状结构，它在最早发生时，即表现为一个具明显两极性的结构。经胚状体诱导产生单倍体植株较通过愈伤组织途径具有数量多、速度快、结构完整、基因型稳定等优点。因此，胚状体作为具有特定优良遗传性状的个体的培养手段，具有特殊价值。
发明内容
本发明的目的在于，针对辣椒小孢子培养中难于通过胚状体途径获得单倍体植株的技术难题，提供一种辣椒小孢子培养获得胚状体的培养方法，该方法能够快速稳定地获得大量小孢子胚状体。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案一种辣椒小孢子诱导获得胚状体的培养方法，其特征在于包括以下步骤(1)确定试材选取具有综合优良性状的杂交一代辣椒品种作为试验材料；(2)选取花蕾在开花初期或盛期，通过醋酸洋红压片法镜检选取处于单核靠边期的花蕾，外观形态特征表现为花冠与花萼等长或花冠稍长于花萼，定期摘除已开放的花朵，让植株始终处于开花状态；(3)花蕾预处理合适的花蕾用自封塑料袋盛装后置于4℃低温冰箱处理1～3天；(4)制备液体培养基和固体培养基两种培养基所用的基本培养基均为Nitsch and Nitsch培养基，所用的碳源为麦芽糖，其浓度为2％～3％；固体培养基添加的凝固剂为琼脂，其浓度为0.6％～0.8％；固体培养基的组成成分为在Nitsch and Nitsch培养基中，加入培养基重量的0.6％～0.8％琼脂，2％～3％的麦芽糖，0.5％～1.0％的活性炭，pH 6.0；液体培养基的组成成分为在Nitsch and Nitsch培养基中，加入2％～3％的麦芽糖，0.4～0.8mg/L的玉米素ZT，0.5mg/L～1.0mg/L的吲哚乙酸IAA，pH 5.8；(5)培养基的灭菌与分装固体培养基于121℃，1.1Mpa条件下灭菌20分钟，液体培养基用装有两层微孔滤膜的塑料滤器过滤灭菌，保证培养基的无菌状态；灭菌后每一培养皿先注入固体培养基6ml，等固体培养基凝固后，再加入液体培养基3ml，进行分装；(6)花蕾消毒先用流水冲洗30分钟，再用体积份数70％的酒精表面消毒30秒钟，之后用体积分数5％的次氯酸钠消毒12～15分钟，然后用无菌水冲洗4次，每次5分钟；(7)无菌剥取花药在无菌滤纸上用消过毒的镊子剥取花药，避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净；(8)花药接种每一培养皿放入12枚花药，用石蜡膜封口；(9)花药培养培养皿置于培养箱中，在9℃条件下暗培养一周，后转入白天25℃、夜间20℃的组织培养室，继续暗培养；(10)小孢子的自然游离胚状体形成在液固双层培养系统下，花药漂浮在上层的液体培养基上，经过2～3周，花药正常裂开，把小孢子释放入培养基中；(11)胚状体的发育形成培养4周后，肉眼可见球型胚和心型胚，培养7周后，可见鱼雷型胚和子叶型胚，培养10周后，子叶型胚非常明显，之后把子叶型胚转入胚萌发培养基上，形成完整植株。
再生植株经细胞学和形态学鉴定确定为小孢子发育的植株。
本发明突出的创新点在于实行液固双层培养系统，采用麦芽糖作为碳源，低温处理，连续黑暗培养，从而建立起一种辣椒小孢子培养胚状体的新方法，通过此方法获得的胚状体高达1个胚状体/花药，且胚状体生长发育正常，成苗率高。
本发明对辣椒小孢子培养胚状体所采取的方法步骤简单、实用，效率高，特别适用于辣椒细胞工程领域方面应用。
图1是小孢子培养4周后形成的胚状体。
图2是小孢子培养7周后形成的胚状体。
图3是小孢子培养10周后形成的胚状体。
图4是小孢子所形成胚状体的继代培养情况。
图5是小孢子诱导的胚状体再生成苗植株。
图6是小孢子诱导的单倍体苗移栽成活(左)与正常的种子二倍体苗(右)生长情况。
图7是小孢子诱导的单倍体植株的染色体(n＝12)。
图8是小孢子诱导的双单倍体植株的染色体(n＝24)。
以下结合附图和发明人给出的具体实施例对本发明进一步的详细说明。
具体实施例方式
依照本发明的技术方案，辣椒小孢子培养胚状体的方法，具体实施步骤为(1)确定试材取具有综合优良性状的杂交一代辣椒品种P51作为试验材料。
(2)选取花蕾在P51开花初期或盛期，通过醋酸洋红压片法[引自Dudu zkum cinek，Rukiye Tipirdamam.The effect of cold treatment andcharcoal on the in vitro androgenesis of pepper(Capsicum annuum L.).TurkJ Bot，2002，26131-139]镜检选取处于单核靠边期的花蕾，花蕾外观形态特征表现为花冠与花萼等长或花冠稍长于花萼，花蕾直径5mm，长度7mm。定期摘除植株上已开放的花朵，让其始终处于开花状态。
(3)花蕾预处理合适的花蕾用自封塑料袋盛装后置于4℃低温冰箱处理1天。
(4)制备液体培养基和固体培养基两种培养基所用的基本培养基均为Nitsch and Nitsch培养基(引自H A Collin，G S Edwards.Plant Cell Culture.BIOS Scientific Publishers Limited，1998，pp20。具体组成成分详见附表)，所用的碳源均为麦芽糖，其浓度为2％。固体培养基添加的凝固剂为琼脂，其浓度为0.8％。
固体培养基的组成成分为Nitsch and Nitsch培养基(Nitsch and Nitsch配方见附表)+0.8％琼脂+2％麦芽糖+0.5％活性炭，pH 6.0；液体培养基的组成成分为Nitsch and Nitsch培养基+2％麦芽糖+0.5mg/L ZT(玉米素)+0.8mg/LIAA(吲哚乙酸)，pH 5.8。
(5)两种培养基的灭菌与分装固体培养基于121℃，1.1Mpa条件下灭菌20分钟；液体培养基通过装有0.45μm和0.22μm两层微孔滤膜的直径为25mm的塑料滤器过滤灭菌，其中滤膜和塑料滤器使用前需经高压灭菌。
每一培养皿(直径60mm)先注入固体培养基6ml，待固体培养基凝固后，再用刻度移液管加入液体培养基3ml。
分装、过滤除菌均在超净工作台上进行。
(6)花蕾消毒先用流水冲洗30分钟，再用体积分数70％的酒精表面消毒30秒钟，之后用体积分数5％的次氯酸钠消毒15分钟，然后用无菌水冲洗4次，每次5分钟。
(7)无菌剥取花药在无菌滤纸上用消过毒的镊子小心剥取花药，避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净。
(8)花药接种每一培养皿放入12枚花药(花药来自不同的花蕾，以免花蕾的位置、大小、年龄等引起误差)，用石蜡膜(Parafilm)封口。
(9)花药培养培养皿置于培养箱中，在9℃条件下暗培养一周，后转入白天25℃、夜间20℃的组织培养室，继续暗培养。
(10)小孢子的自然游离和胚状体形成在液固双层培养系统下，花药漂浮在上层的液体培养基上，经过2周，花药正常裂开，把小孢子释放入培养基中。
(11)胚状体的发育形成培养4周后，肉眼可见球型胚和心型胚(图1)。培养7周后，可见鱼雷型胚和子叶型胚(图2)。培养10周后，子叶型胚非常明显，之后把子叶型胚转入胚萌发培养基上继代培养，可见子叶转绿，子叶展平，真叶出现，根系形成，形成完整植株(见图3、4、5)。小孢子诱导的单倍体苗移栽成活(左)与正常的种子二倍体苗(右)生长情况参见图6，再生成苗植株经细胞学和形态学鉴定以确定其倍性，即鉴定是单倍体还是二倍体。小孢子诱导的单倍体植株的染色体(n＝12)图片见图7，小孢子诱导的双单倍体植株的染色体(n＝24)图片见图8。通过根尖压片法(李懋学，张赞平.作物染色体及其研究技术.北京中国农业出版社.1996，pp231-233)，单倍体植株染色体数目为n＝12。单倍体相对于二倍体在形态学上表现为叶片狭小，节间缩短，生活力弱，花蕾不结实。
需要说明的是，上述实施例选取杂交一代辣椒品种P51作为实验材料，但并不局限于该材料，该方法对于其他优良性状的杂交一代辣椒品种可实现本发明的目的。
附表Nitsch and Nitsch培养基组成成分一览表(mg/L)
权利要求
1.一种辣椒小孢子诱导获得胚状体的培养方法，其特征在于包括以下步骤(1)确定试材选取具有综合优良性状的杂交一代辣椒品种作为试验材料；(2)选取花蕾在开花初期或盛期，通过醋酸洋红压片法镜检选取处于单核靠边期的花蕾，其外观形态特征表现为花冠与花萼等长或花冠稍长于花萼，定期摘除已开放的花朵，让植株始终处于开花状态；(3)花蕾预处理合适的花蕾用自封塑料袋盛装后置于4℃低温冰箱处理1～3天；(4)制备液体培养基和固体培养基两种培养基所用的基本培养基均为Nitsch and Nitsch培养基，所用的碳源为麦芽糖，其浓度为2％～3％；固体培养基添加的凝固剂为琼脂，其浓度为0.6％～0.8％；固体培养基的组成成分为在Nitsch and Nitsch培养基中，加入培养基重量的0.6％～0.8％琼脂，2％～3％的麦芽糖，0.5％～1.0％的活性炭，pH 6.0；液体培养基的组成成分为在Nitsch and Nitsch培养基中，加入2％～3％的麦芽糖，0.4～0.8mg/L的玉米素ZT，0.5mg/L～1.0mg/L的吲哚乙酸IAA，pH 5.8；(5)培养基的灭菌与分装固体培养基于121℃，1.1Mpa条件下灭菌20分钟，液体培养基用装有两层微孔滤膜的塑料滤器过滤灭菌，保证培养基的无菌状态；灭菌后每一培养皿先注入固体培养基6ml，等固体培养基凝固后，再加入液体培养基3ml，进行分装；(6)花蕾消毒先用流水冲洗30分钟，再用体积分数70％的酒精表面消毒30秒钟，之后用体积分数5％的次氯酸钠消毒12～15分钟，然后用无菌水冲洗4次，每次5分钟；(7)无菌剥取花药在无菌滤纸上用消过毒的镊子剥取花药，避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净；(8)花药接种每一培养皿放入12枚花药，用石蜡膜封口；(9)花药培养培养皿置于培养箱中，在9℃条件下暗培养一周，后转入白天25℃、夜间20℃的组织培养室，继续暗培养；(10)小孢子的自然游离胚状体形成在液固双层培养系统下，花药漂浮在上层的液体培养基上，经过2～3周，花药正常裂开，把小孢子释放入培养基中；(11)胚状体的发育形成培养4周后，肉眼可见球型胚和心型胚，培养7周后，可见鱼雷型胚和子叶型胚，培养10周后，子叶型胚非常明显，之后把子叶型胚转入胚萌发培养基上，形成完整植株。
全文摘要
本发明涉及一种辣椒小孢子诱导获得胚状体的培养方法，属于植物细胞工程领域。该方法通过确定试材、选取花蕾、花蕾预处理、制备液固两种培养基、两种培养基的灭菌与分装、花蕾消毒、无菌剥取花药、花药接种、花药培养、小孢子的自然游离和胚状体形成等步骤，获得了小孢子胚状体，且胚状体能正常生长，成苗率高。本发明从开始培养到获得胚状体一般需要8周时间。本发明若应用于育种实践，必将大大加快育种进程，显著地提高选择效果，节省大量人力、物力，是一项加速育种纯系选育的有效方法。
文档编号C12N5/04GK1836496SQ20061004261
公开日2006年9月27日 申请日期2006年4月3日 优先权日2006年4月3日
发明者巩振辉, 张菊平, 刘珂珂, 黄炜, 李大伟 申请人:西北农林科技大学