专利名称：表达嗜热毛壳菌gla基因的酵母工程菌株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种表达热稳定外切糖化酶基因gla的酵母基因工程菌株及其构建方法。
背景技术：
糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase，系统命名为淀粉α-1.4葡聚糖葡萄糖水解酶，α-1.4-Glucanglucohydrolase(EC.3.2.1.3.)]，是一种具有外切活性的酶，它能把淀粉、糊精、糖原等从非还原性末端水解α-1.4葡萄糖苷键，而得到终产物β-D-葡萄糖，也能缓慢水解α-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖，是淀粉转化为葡萄糖过程中的主要酶类之一，糖化酶具有重要商业价值，它已在酿造、食品、医学等工业和农业领域中得到广泛应用。用于生产白酒、黄酒、酒精、醋、啤酒、乳酸钙、柠檬酸、味精等作糖化剂；用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；与木质素酶、纤维素酶、果胶酶等菌种共同作用，可将秸杆等农业废弃物转变为家畜可利用的饲料；也可用于分解低聚糖；还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精、低聚糖进行酶水解的工业上，都可适用。尽管糖化酶对α-1.6糖苷键的活性只有α-1.4糖苷键的0.2％，这足以在工业糖化过程中影响产量。
目前国内外已筛选出多种糖化酶生产菌，并将其分离提纯。但市场应用的糖化酶主要来源于常温菌，因产品成本高，热稳定性差，货架寿命短，酶活力和产率低而制约糖化酶在农业、工业上的应用。由此可见，热稳定性糖化酶的研究和开发具有重要的商业价值。
嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)是一种广泛分布的，生长上限温度较高的一种嗜热真菌，从该菌中已分离了多种嗜热酶，但未见该菌嗜热糖化酶的报道。
本研究是通过RT-PCR及RACE方法从嗜热毛壳菌Chaetomiumthermophilum获得糖化酶gla基因，将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/gla，转化毕赤酵母GS115，再从中筛选出一种高效表达糖化酶的酵母基因工程菌。其中一重组子GS-GLA-22经6d诱导，糖化酶蛋白表达量为0.86mg/mL，其酶活为16.73U/mL，用于淀粉加工及其它工业领域，具有非常显著的经济价值和社会价值。
发明内容本发明的目的是从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得糖化酶gla基因的全长cDNA，命名为gla(DQ104609)，并将gla构建到表达载体pPIC9K上，转化毕赤酵母GS115，培养选择产酶量高的毕赤酵母工程菌株。
嗜热毛壳菌gla全长的cDNA为2016bp，包括起始密码子和多聚A尾。开放阅读框部分为1797bp，由此推得具有599个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现与15家族糖化酶的同源性很高，其中五个基序P-YFY-W-RDAAL、WG-PQRDGP、D-WEEV、AVG-Y-ED和L-W-YA非常保守表明经过上述克隆步骤得到了嗜热毛壳菌gla基因。该序列如下(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度2016碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性
(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源嗜热毛壳菌(f)序列描述1 CTGCCTGACC AGGCAATGCC GCGACGCTAT CATCTGTCAA AAAATGGCTG AACGCCTCTA6061 AGTCAGAATC CGTGATGTCC GCATCGGTCC TGTTGGTCTT TGCACAGCAC GAAGTATCGG120121GTGCCGCATC GCACGCACCC CAGTGGGCTA ATCTCCAACG CTCAGCGGTC GATTCCTACA180181TTGAGCGTGA GACCCCTATC GCGTGGAACG CTTTGCTGAA CAACATAGGC CCATGCGGCG240241ATTGCGTCAC GGGAGCGGCC TGCGGAATCG TCGTGGCGAG GCCCTGCAAG TCCGACCCTG300301ATTACTTCTA CCAGTGGCAG CGAGACGCCG CTCTGCAAGG TCAAATTCCG AGCATACGAT360361TGCATAGGGG ACAGCAAGAA TTTAGCCACG AAATTCAGCA GCACAGCCAG GCACAAGCTA420421TTCTTCAGTT AATATGGAAC CCGTCAGGTG ACAATGGCGA GGCCTGGGGC TTGGGCGAAC480481CTAGGTTCAT GGTTGACGGC TTCATTCACA GCTGGTTCCA GGGCTGGGGA AGTCCACAGC540541GGGATGGCCC GGCGTTGAGT GCAATTGCAT TTATTCAAAC ACACAGCTGG CTTAAGGACA600601TGGGGCAAGC ACCCCACGCG AAGTTAATAA TCTGGCCTAT CGTTAAAAAC GATCTCACGT660661ACCACGGTCA ATACTGGAAT AATTCGGGCC AGGACCTTTG GGAAGAGGTA TTGCAAACCA720721CCTTCTTCCA AATTGCCGAA CAGCACAGCG CGCTTCTAGA AGGCGCGAAC TTTGCATTCC780781TTTCCGGCCC TCAATGCATT AGCTGCGACC AGGCGCCGCA GGTTTTATGT TTCCAAGGCA840841GGTTCTGGAA AGGCCACCAA TGCTATAATA GCGGCAGGCC CCGGAGCGGG TTAGACTTTA900901ACTGCGAGCT AGGCTCGATC CAAATGTTCG ACCCCAAGGC GGAATGCGAT CAAATTCAAT960961TCCAGCCTCA TAGGGACAGC GCGCTAGCTA ATCACAAGGT TGTTCAAGAC TCGTTCCGCT10201021 ACCACGGCTG TAATAACGGC CACCAGTGGG GCGACGCCGT TGCCGTAGGA AGTTACCCGG10801081 AATTCGTATA CTATAATGGC ATGCCATGGT ACCTTGCCAT TCAGGCGGCC GCGGAGCAGC11401141 TTTACGACGC CGTTTATCAA TGGCAAGATG TTGAATGGAT TCACATGGGC ATTCAATCCC12001201 TTGTGTTCTT CCACGCGGAT GTACTAACCT CGGCGGCCGG GCAATACACC AGGTCCCACA12601261 CGACGTATCA AAATATCCAC GACGCTGTTA AGACCTACGC CGACGGCTTC GTTTCGGTTG13201321 TATCGTGTGC CAAGTACCAC CCCAGGAACG GGACCCTACA TGAGGGCGAA CATAGGAATG13801381 ACGGCAAGCC CGACTCGGCC AGCCACTTGC ACTGGAGGTA TGCGGCCTTG TTGTGCGCCA14401441 TACACAGCAG GGCGACCCAA GTACCTGCCT CGTGGGGCGA GGCGTGCGCG ACGAGCCCCG15001501 GGGTGTGCAC CGCCATTGAG CAATCAGGGC ATTACTCCAC GGCCCATAAT CAATCCTGGC15601561 CGTCCGCGTG CAGTCAACAA CATCATAGGC AGACCCCGTG CCACTGCCAA CATCCCGTGG16201621 CCTACCATTT CAATGGCATT CAACAATACG GCGAAATCTA CGTTCTTGGA ACGATACCCG16801681 CGCTGGGCAA CTGGAGGGAC TGGGGCTGTC ACCTGAGGGC CGACAAATAT ACCAACTCGG17401741 ACCAGATTTG GTATTCCATT GTACAACTTC CAGCGGGCGA AAGGGCCGTT TATAAGTATA18001801 TACGCAAATG GGAAGGCAGG GTCGACCCGA ACCGGCTCAC GCAAGTTCAG GACTGTGGTC18601861 AAGACCACTG GTGAGTCACT TCAGTCGTCT GCAGAGGATT TATCCCCGCG CGTGGTGACA19201921 TTGCAATCCG CCAGCCAGCT CCCGGGGCTT CTCCCGAGGG ACGTCGTCAG CCTGCTGAGG19801981 TACATGACCC GGAGCTAATC GAAAAAAAAA AAAAAA 2016(2)SEQ ID NO 1的信息
(a)序列特征*长度457氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述1 MSASVLLVFA QHEVSGAASH APQWANLQRS AVDSYIERET PIAWNALLNN IGPCGDCVTG 6061 AACGIVVARP CKSDPDYFYQ WQRDAALQGQ IPSIRLHRGQ QEFSHEIQQH SQAQAILQLI 120121WNPSGDNGEA WGLGEPRFMV DGFIHSWFQG WGSPQRDGPA LSAIAFIQTH SWLKDMGQAP 180181HAKLIIWPIV KNDLTYHGQY WNNSGQDLWE EVLQTTFFQI AEQHSALLEG ANFAFLSGPQ 240241CISCDQAPQV LCFQGRFWKG HQCYNSGRPR SGLDFNCELG SIQMFDPKAE CDQIQFQPHR 300301DSALANHKVV QDSFRYHGCN NGHQWGDAVA VGSYPEFVYY NGMPWYLAIQ AAAEQLYDAV 360361YQWQDVEWIH MGIQSLVFFH ADVLTSAAGQ YTRSHTTYQN IHDAVKTYAD GFVSVVSCAK 420421YHPRNGTLHE GEHRNDGKPD SASHLHWRYA ALLCAIHSRA TQVPASWGEA CATSPGVCTA 480481IEQSGHYSTA HNQSWPSACS QQHHRQTPCH CQHPVAYHFN GIQQYGEIYV LGTIPALGNW 540541RDWGCHLRAD KYTNSDQIWY SIVQLPAGER AVYKYIRKWE GRVDPNRLTQ VQDCGQDHW 599构建重组表达质粒载体pPIC9K/gla，利用电转仪提供的优化参数进行电击转化Pichia pastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行诱导表达。获得一重组子GS-GLA-22经6d诱导，该基因工程菌的糖化酶表达量为0.86mg/mL，其酶活为16.73U/mL。表达量和产酶活力都较高，具有非常重要的经济价值和社会价值。
附图1、糖化酶基因gla PCR产物电泳图谱泳道1，RT-PCR泳道2，3′RACE泳道3，5′RACE泳道4，ORF cDNA泳道M，DL2000；
附图2、重组质粒pPIC9K/gla的酶切分析泳道1，DNA Maker DL2000泳道，2，SnaB I+Not I，泳道3，Bgl II，泳道4，Sac I，泳道5，Sac I，泳道6，λ-HindIII digest DNAMarker；附图3、酵母转化子在不同G418YPD培养基的平板筛选；附图4、酵母转化子GS-GLA-22的PCR结果；泳道1，pPIC9K使用5′α-factor和3′AOX1引物的扩增结果，泳道2，P1，P2的PCR鉴定结果，泳道3，酵母转化子使用5′α-factor和3′AOX1引物的PCR鉴定结果，M，DNA Maker DL2000；附图5、重组糖化酶的SDS-PAGE分析泳道1-6，酵母转化子GS-GLA-22甲醇诱导1d、2d、3d、4d、5d、6d，泳道7，低分子量标准蛋白，泳道8，酵母转化子GS115/pPIC9K甲醇诱导6d。
(五)具体发明实施方式实施方式1嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilium糖化酶gla基因的克隆方法(1)RNA的提取参照Trizol试剂盒说明，提取总RNA。
(2)cDNA第一条链的合成按照Promega公司的Reverse TranscriptionReaction试剂盒说明书进行，以Oligo(dT)20为引物合成cDNA第一链。反应条件为42℃1小时；95℃5分钟。
(3)PCR反应聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为首先将下列试剂混在一起10X反应缓冲液 2.5μl25mM MgCl22μl
10mM dNTP 2μl上游引物(10μM) 1μl下游引物(10μM) 1μl模板cDNA2μlTaq DNA聚合酶 0.5μl灭菌双蒸水 14μl总体积 25μlPCR反应条件为95℃预变性4min；94℃变性1min；55℃退火1.5min，72℃延伸2min，30个循环；72℃再延伸10min。
(4)基因克隆取2μl PCR产物与pGEM-T easy载体进行连接，操作步骤按照Promega公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨卞青霉素(100μg/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
(5)质粒DNA的提取碱法提取质粒DNA。
(6)序列测定在上海生工进行。
(7)3′和5′序列的分离按照5’/3’RACE Kit，2nd Genneration(RocheApplied Science)使用说明进行。
(8)同源检索利用BLAST软件将分离出的序列与Genbank中的序列进行比较。
实施方式2嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilium糖化酶ebhl基因的核苷酸序列和氨基酸序列见“发明内容”部分。
实施方式3表达载体的构建(1)根据cbhl基因的成熟肽全编码序列设计引物，分别引入SnaB I和Not I
酶切位点正向引物ep-gla55’-GCG GCGGTCGATTCCTACATTG-3’(SnaB I)反向引物ep-gla35’-GTC TCACCAGTGGTCTTGACCAC-3’(Not I)以嗜热毛壳菌总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应(2)取2μl PCR产物与pGEM-T easy载体进行连接，操作步骤按照Promega公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨卞青霉素(100μg/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。减法提取质粒DNA，进行序列测定。
(3)用SnaB I和Not I两个限制性内切酶将该基因从pGEM-T easy载体上切下，同样酶切pPIC9K空载体并在CIAP作用下使之去磷酸化。将去磷酸化的线性化的pPIC9k空载体于双酶切得到的目的片段在T4 DNA连接酶的作用下4℃过夜。连接产物转化JM109感受态细胞，然后在含氨卞青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。
(4)将构建好的表达载体转化用限制性内切酶Sac I线性化，转化毕赤酵母菌株GS115。
实施方式4阳性转化子筛选(1)用灭菌牙签挑取单个菌落分别点种到MM和MD平板上，30℃倒置培养2-4d，在MD平板和MM平板上均能正常生长的转化子(表现型为His+Mut+)为阳性转化子。
(2)挑取阳性转化子，分别点种于含0.50mg/mL、1.00mg/mL、2.00mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL G418YPD培养基平板上，以筛选多拷贝转化子。
(3)分别使用gla的特异引物ep-gla5/ep-gla3和载体pPIC9K上5′α-factor和3′AOXl通用引物进行PCR鉴定。反应条件为94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min。
实施方式5毕赤酵母工程菌株诱导表达(1)将阳性转化子接种于含25mLBMGY培养基的250mL的摇瓶中，30℃下250-300rpm培养至OD600为2-6。室温1500-3000g离心收集菌体，用无菌水洗三次，将菌体转移至BMMY诱导培养基中，30℃继续培养，每12h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5-1％。每12h取样，离心收集上清，即为粗酶液。
(2)重组糖化酶的酶活力检测采用DNS法测定诱导上清液中的糖化酶活性，反应体系包含0.2mL(0.5％w/v)可溶性淀粉(悬浮于0.05mol/L、pH5.0的醋酸缓冲液)，200μL酶液，60℃保温10min。用DNS法测定上清液中的还原糖量。一个酶活力单位(U)定义反应条件下，每分钟水解可溶性淀粉产生1μmol还原糖所需的酶蛋白量。
(3)蛋白含量的测定蛋白质含量测定采用Bradford法，以牛血清白蛋白为标准蛋白测定。
(4)SDS-PAGE电泳分析gla基因的表达情况。
应用以上方法我们筛选得到了表达量和产酶活力都较高的毕赤酵母工程菌株GS-GLA-22，可在酿造、食品、医学等工业和农业领域中得到广泛应用。
权利要求
1.一种表达嗜热毛壳菌gla基因编码蛋白的酵母工程菌株，其特征是该菌株为一种毕赤酵母，通过RT-PCR及RACE方法从嗜热毛壳菌Chaetomiumthermophilum获得糖化酶基因gla，将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/gla，转化毕赤酵母GS115，从中筛选出高效表达糖化酶的酵母基因工程菌。
全文摘要
本发明是一种酵母基因工程菌Pichia pastoris GS－GLA－22，通过RT－PCR及RACE方法从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得糖化酶gla基因，将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/gla，转化毕赤酵母GS115，再从中筛选出一种高效表达糖化酶的酵母基因工程菌。其中一重组子GS－GLA－22经6d诱导，糖化酶蛋白表达量为0.86mg/mL，其酶活为16.73U/mL，用于淀粉加工及其它工业领域，具有非常显著的经济价值和社会价值。
文档编号C12N15/56GK101070524SQ20061004393
公开日2007年11月14日 申请日期2006年5月11日 优先权日2006年5月11日
发明者李多川, 陈静 申请人:山东农业大学