专利名称：一种提高普那霉素发酵产量的方法
技术领域：
本发明涉及始旋链霉菌发酵产物-普那霉素的生成工艺，属于微生物工程领域，特别地，涉及一种提高普那霉素发酵产量的方法。
背景技术：
抗生素的长期使用，尤其是不合理的使用，使临床致病菌感染已成为目前医学界一个十分严峻的问题，研制和开发具有抗耐药菌能力的抗生素显得非常迫切。由始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)发酵产生的一种链阳性菌素类抗生素——普那霉素(Pristinamycins，又名原始霉素)即是这样的抗生素产品，它对革兰氏阳性菌有较好的抗菌能力，不容易产生耐药性。普那霉素由约30％的普那霉素I(由P1A、P1B和P1C组成)和约70％的普那霉素II(由PIIA和PIIB组成)构成，其中PIA和PILA是普那霉素的主要组分。
在现有的普那霉素生产技术中，法国罗纳普朗克罗尔公司(现为安万特公司)的专利技术(US 3154475，1964年；GB 998195，1965年)，采用始旋链霉菌菌株5647和NRRL 2958通过孢子培养、种子液、液体发酵培养的常规操作来制备，但普那霉素的发酵水平只有1190U/mL(相当于0.15g/L)。金志华等人(浙江大学生物工程研究所)先前公开的专利技术(CN 1607245A，2005年)通过对发酵生产普那霉素的种子培养基和发酵培养基进行优化，使始旋链霉菌菌株CGMCC0957发酵生产普那霉素的水平提高到了3000～5000U/mL(相当于0.3～0.6g/L)。尽管如此，由于普那霉素为抗革兰氏阳性菌类抗生素，而生产菌始旋链霉菌本身即为革兰氏阳性菌，因此，在通过始旋链霉菌发酵生产普那霉素的过程中很容易产生发酵产物对生产菌的毒害作用，使生产菌的生长和产物合成过程受到很大的抑制。与此同时，普那霉素在发酵后期还容易被发酵液中所存在的酶所降解。上述原因造成了普那霉素的发酵水平难以进一步地提高，生产成本因此居高不下。
发明内容
本发明的目的是针对始旋链霉菌发酵生产普那霉素过程中所存在的产物抑制难题，提供一种能够提高普那霉素发酵产量的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种提高普那霉素发酵产量的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将始旋链霉菌的孢子培养物接种到种子培养基中，制备得到种子培养液。
(2)再将种子培养液接种到发酵培养基中，进行发酵培养。
(3)在发酵开始时或在发酵进行过程中，加入一定量的已灭菌过的大孔吸附树脂，直至发酵结束。
(4)过滤发酵液，收集所加入的大孔吸附树脂，并将树脂装填于层析柱之中，通过洗脱溶剂解吸普那霉素，进一步精制后制得较纯的普那霉素产品。
进一步地，所述步骤(3)中，所述加入的大孔吸附树脂为Diaion HP-20树脂、Amberlite XAD-2树脂、Amberlite XAD-4树脂、HZ-802树脂、HZ-803树脂、H-103树脂、CAD-40树脂或CAD-45树脂；所述大孔吸附树脂一次性加入到发酵液之中；所添加大孔吸附树脂的湿态质量为发酵液体积的2％～40％；树脂的添加时间为发酵开始时，或发酵开始10～30小时后加入；所述大孔吸附树脂分两到三次加入到发酵液之中；每次所添加树脂的湿态质量为发酵液体积的2％～20％；两到三次累计所添加树脂的湿态总质量不超过发酵液体积的40％；第一次树脂的添加时间为发酵开始时，或发酵开始10～30小时后加入；第二次或第三次树脂的添加时间为发酵开始10～30小时后加入；前后两次树脂添加的时间相隔为1～5小时；所述步骤(4)中，所述洗脱溶剂是质量百分比为50～75％的丙酮溶液。
本发明的有益效果是，在普那霉素生产菌始旋链霉菌的发酵过程中，将能够吸附普那霉素的大孔吸附树脂直接加入到发酵液之中，实现了微生物发酵与发酵产物原位分离的耦合，使发酵液中的普那霉素始终维持在较低的水平，从而在很大程度上缓解了发酵产物对生产菌的抑制作用，促进了始旋链霉菌的生长和普那霉素的生物合成，通过选择大孔吸附树脂的种类、添加量、添加时间和添加方式，可以将普那霉素的发酵产量提高到1.0～2.5g/L的水平，有效提高了普那霉素的产量，从而降低了普那霉素的生产成本。
图1是实施例2的洗脱液中普那霉素的含量分析HPLC图谱；图2是对比实施例2的发酵液中普那霉素的含量分析HPLC图谱。
具体实施例方式
本发明的方法包括以下步骤(1)将始旋链霉菌的孢子培养物接种到种子培养基中，制备得到种子培养液；(2)再将种子培养液接种到发酵培养基中，进行发酵培养；(3)在发酵开始时或在发酵进行过程中，加入一定量的已灭菌过的大孔吸附树脂，直至发酵结束；(4)过滤发酵液，收集所加入的大孔吸附树脂，并将树脂装填于层析柱之中，采用合适的洗脱方式解吸普那霉素，进一步精制后制得较纯的普那霉素产品。
所采用的始旋链霉菌种子培养基、发酵培养基和发酵工艺条件，已如金志华等人先前公开的专利技术(CN 1607245A)所述。具体地，所采用的种子培养基主要含有2～5％的可利用碳源(如葡萄糖)和1～4％的有机氮源(如酵母粉)；将孢子培养物制成孢子悬浮液后接种到种子培养基中，或用挖块法直接接种到种子培养基中培养制备种子；种子培养的培养温度为25～37℃，培养时间为36～60小时。所采用的发酵培养基在主要含有4～8％的可利用碳源(如葡萄糖)和2～5％的有机氮源(如酵母粉)；将种子以1～20％(接入的种子液体积与发酵培养基体积的比例)的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养；发酵采用深层液体沉没培养法，根据规模大小在摇瓶或发酵罐中进行；如摇瓶发酵时装液量为摇瓶体积的10～20％，摇床转速为150～250转/分；如在发酵罐中发酵时通过通入无菌空气和搅拌来提供氧气，通气量为每分钟每升发酵液0.5～1.5升无菌空气，搅拌转速为100～600转/分；发酵培养的培养温度为28～32℃，培养时间为36～60小时。
所采用的树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂，其种类(牌号)包括DiaionHP-20树脂(日本Mitsubishi化学公司)、Amberlite XAD-2或Amberlite XAD-4树脂(美国Rohm & Hass公司)、HZ-802或HZ-803树脂(上海华震科技有限公司)、H-103树脂(南开大学化工厂)、CAD-40或CAD-45树脂(华北制药厂)，优先考虑选用HZ-802树脂。
所选用的大孔吸附树脂，可以在发酵开始时一次性加入，也可以在发酵开始10～30小时后加入，优先考虑在发酵开始15～25小时后加入；所添加树脂的湿态质量(千克)为发酵液体积(升)的2％～40％，更适宜的添加量为10％～20％。
所选用的大孔吸附树脂，还可以在发酵过程中分两到三次加入到发酵液之中；每次所添加树脂的湿态质量(千克)为发酵液体积(升)的2％～20％，更适宜的添加量为5％～15％，两到三次累计所添加树脂的湿态总质量(千克)不超过发酵液体积(升)的40％；第一次树脂的添加时间为发酵开始时，或发酵开始10～30小时后加入，优先考虑在发酵开始15～25小时后加入；第二次或第三次树脂的添加时间为发酵开始10～30小时后加入，优先考虑在发酵开始20～30小时后加入；前后两次树脂添加的时间相隔为1～5小时。
所采用的普那霉素从吸附树脂上解吸的洗脱溶剂，为50～75％(质量百分比)丙酮溶液，最好为70％的内酮溶液；洗脱液体积为2～5倍层析柱床体积，洗脱流速为每小时0.5～2.0倍床体积，更合适的洗脱流速为0.8～1.2倍床体积。
所述的普那霉素的进一步精制方法，采用如下方法将丙酮洗脱液加水稀释，直至丙酮浓度为30％左右，加入0.1倍稀释液体积的氯仿萃取稀释液，减压浓缩后加入正己烷使普那霉素沉淀出来，得到普那霉素粗品；粗品用丙酮溶解，过滤去除不溶物后经过硅胶柱层析，以丙酮与正己烷的混合溶液作洗脱溶剂，分步收集各出峰部分，减压浓缩、烘干后得到普那霉素纯品。
本发明所采取的技术方案适用于任何能够通过微生物发酵过程产生普那霉素的菌种，特别适合于始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)，该菌种在美国标准菌种收藏所(ATCC)和美国农业部北方开发利用研究部(NRRL)均有保存，编号分别为ATCC 25486和NRRL 2958，更特别适合于金志华等人先前的专利技术(CN 1607245A)中所采用的菌株Streptomyces pristinaespiralis CGMCC 0957。
实施例1在摇瓶中添加大孔吸附树脂发酵生产普那霉素新工艺将已培养成熟的始旋链霉菌孢子培养物以挖块法(挖块大小为1×1平方厘米)接种到含有25毫升种子培养基的三角烧瓶中，置于摇床中振荡培养36小时，摇床的转速设定为220转/分，培养温度为28℃，当种子液中始旋链霉菌的菌丝浓度达到20％对结束培养。将1.5毫升种子液接种到含有25毫升发酵培养基的三角烧瓶中，置于摇床中振荡培养，摇床的转速设定为250转/分，培养温度为28℃，当发酵进行到第24小时，直接将已灭菌的HZ-802大孔吸附树脂加入到发酵液之中，树脂加量为2.1g湿重，发酵至第63小时结束。过滤分离出发酵液中的吸附树脂，用8毫升浓度为70％的丙酮溶液分步洗脱二次，合并洗脱液，用HPLC法定量分析发酵液和洗脱液中的普那霉素含量，累计算出普纳霉素的产量为1.72g/L，树脂对普那霉素的吸附容量为18.75mg/g湿树脂。
实施例2在5升发酵罐中添加大孔吸附树脂发酵生产普那霉素新工艺将180毫升种子液接种到含有3升发酵培养基的5升发酵罐中，进行发酵培养，在发酵罐中通入无菌压缩空气，通气量为1.2升/(分钟×升)，搅拌转速为200转/分)，温度控制为28℃。当发酵进行到第18小时时，将已灭菌的HZ-802大孔吸附树脂用火焰法加入到发酵罐之中，树脂加量为150克湿重；然后当发酵继续进行到第25小时时，再用火焰法加入150克HZ-802湿树脂，发酵直至第63小时结束。过滤分离出发酵液中的吸附树脂，用1200毫升浓度为70％的丙酮溶液分步洗脱二次，合并洗脱液，用HPLC法定量分析发酵液和洗脱液中的普那霉素含量，累计算出普纳霉素的产量为1.64g/L，树脂对普那霉素的吸附容量为15.6mg/g湿树脂。洗脱液中普那霉素的含量分析HPLC图谱如图1所示。
对比实施例1普那霉素摇瓶发酵生产常规工艺与实施例1平行类似进行，只是在发酵过程中不添加大孔吸附树脂，结果是普那霉素的产量为0.58g/L，只相当于实施例1的百分之三十四。
比较例2普那霉素发酵罐生产常规工艺与实施例2平行类似进行，只是在发酵过程中不添加大孔吸附树脂，结果是普那霉素的产量为0.47g/L，约为实施例2的百分之二十九。发酵液中普那霉素的含量分析HPLC图谱如图2所示。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
权利要求
1.一种提高普那霉素发酵产量的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将始旋链霉菌的孢子培养物接种到种子培养基中，制备得到种子培养液。(2)再将种子培养液接种到发酵培养基中，进行发酵培养。(3)在发酵开始时或在发酵进行过程中，加入一定量的已灭菌过的大孔吸附树脂，直至发酵结束。(4)过滤发酵液，收集所加入的大孔吸附树脂，并将树脂装填于层析柱之中，通过洗脱溶剂解吸普那霉素，进一步精制后制得较纯的普那霉素产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述加入的大孔吸附树脂为Diaion HP-20树脂、Amberlite XAD-2树脂、Amberlite XAD-4树脂、HZ-802树脂、HZ-803树脂、H-103树脂、CAD-40树脂或CAD-45树脂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述大孔吸附树脂一次性加入到发酵液之中；所添加大孔吸附树脂的湿态质量为发酵液体积的2％～40％；树脂的添加时间为发酵开始时，或发酵开始10～30小时后加入。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述大孔吸附树脂分两到三次加入到发酵液之中；每次所添加树脂的湿态质量为发酵液体积的2％～20％；两到三次累计所添加树脂的湿态总质量不超过发酵液体积的40％；第一次树脂的添加时间为发酵开始时，或发酵开始10～30小时后加入；第二次或第三次树脂的添加时间为发酵开始10～30小时后加入；前后两次树脂添加的时间相隔为1～5小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述洗脱溶剂是质量百分比为50～75％的丙酮溶液。
全文摘要
本发明公开了一种提高始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis)发酵产物——普那霉素(Pristinamycin，又名原始霉素)产量的方法。通过将大孔吸附树脂直接添加于发酵液之中，实现微生物发酵与产物分离的原位耦合，在很大程度上缓解了普那霉素对生产菌的抑制作用，同时避免了普那霉素在发酵后期容易被降解的可能性。通过选择大孔吸附树脂的种类、添加量、添加时间和添加方式，可以将普那霉素的发酵水平提高到1.0～2.5g/L，有效提高了普那霉素的产量，从而降低了普那霉素的生产成本。
文档编号C12P21/02GK1876827SQ200610050350
公开日2006年12月13日 申请日期2006年4月14日 优先权日2006年4月14日
发明者金志华, 雷引林, 贾波, 李宁惠, 陶正利, 吴亚铭, 梅乐和 申请人:浙江大学宁波理工学院