专利名称：一种植物超氧化物歧化酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种酶的制备方法，尤其涉及一种植物超氧化物岐化酶的制备方法，属 于生物化学工程技术领域。
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超氧化物岐化酶(superoxide， dismutase，简称SOD)是一种金属酶，能够
催化超氧阴离子自由基发生岐化反应，消除超氧阴离芋自由基所引起的生物大分子过氧 化等细胞损伤，具有消炎祛病，保健美容的功效。目前SOD已广泛被应用于医药、保 健品、食品和日化等许多行业中。
现有的SOD制备主要以三种原料为主，第一，以动物体组织或血为来源，第二， 以微生物为原料来源，第三，以植物为原料来源。 一般以动物体组织或血为原料制备的 SOD存在着价格较贵，体内半衰期短的缺点，再者，现在疯牛病及禽流感的大范围出现， 原料的质量及安全性受到置疑，微生物主要利用其发酵来生物合成，由于微生物易受环 境因素的影响，所得SOD其回收率及活性得不到保证，由于这方面国内研究时间较短， 未建立其相对应完善统一的质量标准，难以监控产品质量。在《成都航空职业技术学院 学报》的2005年3月第1期中由金绍黑发表了《植物超氧化物岐化酶的提取、修饰制 备工艺剂其应用研究》的文章，该文章公开了热变性沉淀法及盐析和金属鳌合亲和层析 法来制备和提纯超氧化物岐化酶，上述这些方法对原料中的病毒及有害细菌没有有效的 措施加以抑制，制得SOD活性不高，且工艺中设备投入成本大，不适合大规模工业化 生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种卫生、适合规模工业化生产的植物超氧化物 岐化酶的制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为 一种植物超氧化物岐化酶的制备方 法，其特征在于包括如下步骤
(1) 将洗净的豆粕、龙葵、白英、筋骨草、蛇莓分别粉碎、打浆；
(2) 合并步骤(1)中的打浆后的产物，添加重量3 4倍于合并后产物、质量百分比为 0.5 2%的碱离子液，厌氧发酵1 12个月；
(3) 发酵完后，添加饱和缓冲液，直至pH值为7 8，厌氧静置4 6小时；
(4) 添加氧化剂和萃取剂到发酵容器中，脱水沉淀，过滤，取滤液，添加脱水氧化 剂，在一10 0。C下，厌氧真空冷冻1 4小时，上述氧化剂添加的量为步骤(3)中溶液体 积的1 100%，上述萃取剂添加的量为步骤(3)中溶液体积的15 80%，上述脱水氧化 剂添加的量为步骤(3)中溶液体积的15 80%;
(5) 沉淀得到粗品酶，采用80 400目滤布抽滤，接着离心分离，取沉淀物，于一 30 0'C真空冷冻干燥8 72小时；
(6) 将重量40 60倍于步骤(5)中产物、质量百分比为10 15%的还原糖培养基添 加到上述产物，再添加重量0.2 0.3倍于还原糖培养基、质量百分比为1.5 3%的掩蔽 剂，在78 9(TC条件下温浴，温浴产物温度至65 75。C，取出；
(7) 在10 20分钟内，冷却至16 20。C，采用400 600目滤布抽滤；
(8) 取滤液，添加脱水氧化剂，厌氧静置2 4小时，抽滤、离心分离，得到产物， 于一30 (TC真空机冷冻干燥24 72小时，再经常温真空器干燥24 72小时，即得超 氧化物岐化酶，上述脱水氧化剂添加的量为步骤(7)中抽滤后溶液体积的15 80%，
其中步骤(l)中各原料之间的质量比为1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100。 进一步提高所得酶的质量及活性，所述步骤(l)中的原料还包括白花蛇舌草和半枝
莲，且各物质之间的质量比为1 跳1 跳1 跳1 跳1 跳1 100: l
100。
进一步提高所得酶的质量及活性，所述步骤(l)中的原料还包括鸭跖草、萚草和鱼 腥草，且各物质之间的质量比为1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1~100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100。
所述步骤(2)中的碱离子液采用氢氧化钠溶液、氯化钾溶液或氯化钠溶液，步骤(3) 中的缓冲液采用柠檬酸、柠檬酸钠、醋酸、醋酸钠、磷酸二氢钾或氯化钠溶液，步骤(4) 中的氧化剂采用100%乙醇、质量百分比为1 20%的氢氧化钠溶液、质量百分比为10~ 40%的双氧水、质量百分比为5 38%的盐酸或质量百分比为10 98%的硫酸，萃取剂 采用丙酮、二氯甲垸或三氯甲烷，步骤(4)中的脱水氧化剂采用乙醇、三氯甲烷、丙酮、 二氯甲烷或硫酸钠溶液，步骤(6)中的还原糖培养基采用麦芽糖培养基或葡聚糖培养基， 步骤(6)中的掩蔽剂采用EDTA溶液、聚乙二醇或上述两种的混合物，步骤(8)中的脱水 氧化剂采用100%乙醇、质量百分比为1 20%的氢氧化钠溶液、质量百分比为10 40 %的双氧水、质量百分比为5 38%的盐酸或质量百分比为10 98%的硫酸。
为进一步减少厌氧发酵时间和提高厌氧发酵效果，所述步骤(2)中厌氧发酵前添加 质量百分比为20 100%的步骤(4)中过滤后的沉淀物。
作诱导激活剂使用，所述的步骤(6)中在温浴之前添加步骤(6)中抽滤后的上层物质， 且该上层物质抽滤后添加前经过一20~ — IO'C冷冻干燥，该上层物质添加的量为步骤(I)
中产物合并后混合物质量的10 50%。
与现有技术相比，本发明的优点在于将具有解毒消肿抗癌功效的龙葵、白英、筋 骨草、蛇莓等廉价中草药与含有大量金属离子的豆粕配合，各取所长，相互协同，经过
厌氧发酵，制得卫生无污染具有抑制病菌酶活性很高的SOD，直接可以服用或外涂，并
且具有良好的消炎效果，而且可根据具体的病症，适当地添加其中一种或多种原料，针
对性地能提高疗效；重复利用，反复发酵，同时诱导激活可大大提高产品质量和縮短制 备时间；依照本发明制得的SOD，可以在常温下保存，适合长途运输，减少了保存和运 输费用，本发明所用的各原料成本低廉，设备投入少，操作过程简单安全，工作人员易 学易会；由于工艺过程中产生吸附和抑制病菌的气体，所以如果大规模生产本产品，可 改善当地的空气环境。
图1为本发明实施例工艺流程图
具体实施例方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例，参考图1 ，本实施例中植物超氧化物岐化酶的制备方法，包括如下步骤-
(1) 将洗净的100克豆粕、50克龙葵、50克白英、50克筋骨草、50克蛇莓白、50 克花蛇舌草、50克半枝莲、50克鸭跖草、50克萚草和50克鱼腥草分别粉碎、打浆；
(2) 合并步骤(1)中的打浆后的产物，添加重量3.5倍(一般控制在3 4倍)于合并后 产物、质量百分比为1.5%(—般控制在0.5 2%)的碱离子液，本实施例采用氯化钠溶液 作为碱离子液，厌氧发酵2个月,如果原料是干的，可以适当延长发酵时间,一般厌氧发 酵时间范围控制在1 12月；
(3) 发酵完后，添加饱和缓冲液，本实施例采用柠檬酸溶液，直至pH为7左右，厌 氧静置5小时(一般控制在4 6小时)；
(4) 添加氧化剂和萃取剂到发酵容器中，脱水沉淀，虹吸上层清夜，过滤，取滤液， 合并清液和滤液，添加脱水氧化剂，于一5X:(—般控制在一10 (TC)厌氧真空冷冻2小 时(一般控制在1 4小时),上述氧化剂添加的量为步骤(3)中溶液体积的50%(—般控制在 1~100%)，本实施例采用质量百分比为15% (—般控制在1 20%倍)的氢氧化钠溶液， 萃取剂添加的量为步骤(3)中溶液体积的50%(—般控制在15 80%)，本实施例采用丙 酮，上述脱水氧化剂添加的量为步骤(3)中溶液体积的50%(—般控制在15 80%)，本 实施例采用乙醇；
(5) 沉淀得到粗品酶，采用300目(一般控制在80 400目)滤布抽滤，接着用3000 转/分钟，甩水机工作4分钟，取沉淀物，于一1(TC(一般控制在一30 (TC)冷冻真空干 燥32小时(一般控制在8 72小时)；
(6) 重量50倍(一般控制在40 60倍)于步骤(5)中产物、质量百分比为12%(— 般控制在10 15%)的还原糖培养基添加到上述产物，再添加重量0.25倍(一般控制在 0.2 0.3倍)于还原糖培养基、质量百分比为2%(—般控制在1.5 3%)的掩蔽剂(温度 达到45。C时添加)，本实施例釆用EDTA溶液，在80。C (一般控制在78 90'C)条件下 温浴，温浴产物至温度7(TC(—般控制在65 75°C)，取出；
(7) 在18分钟内(一般控制在16 20分钟)，冷却至18。C(一般控制在16 20°C)， 采用500目(一般控制在400 600目)滤布抽滤；
(8) 取滤液，添加脱水氧化剂到步骤(7)得到的滤液中，静置3小时(一般控制在2 4小时)，500目(一般控制在400 600目)滤布抽滤，用3000转/分钟，甩水机工作4分 钟，取沉淀物，一2(TC冷冻真空机24小时(一般控制在24 72小时)后，再经常温真空器 干燥48小时(一般控制在24 72小时)，即得优质超氧化物岐化酶50克，上述脱水氧化 剂添加的量为步骤(7)中抽滤后溶液体积的50%(—般控制在15 80%)，本实施例采用 乙醇。
其中，本可根据具体的病症，适当地添加其中一种或多种原料， 一般质量比控制在 1 100。廉价的豆粕也可以用大豆或黄豆替代，其作用是一样的。
步骤(2)中的碱离子液还可以采用氯化钾或氯化钠；步骤(3)中的缓冲液还可以采用 柠檬酸钠、醋酸、醋酸钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠或氯化钠溶液；步骤(4)中的氧化剂 还可以采用质量百分比为10 40%的双氧水、质量百分比为5 38%盐酸或质量百分比 为10 98%硫酸等，萃取剂还可以采用二氯甲烷或三氯甲烷；步骤(4)中的脱水氧化剂 还可以采用丙酮、三氯甲烷、二氯甲垸或硫酸钠溶液等；步骤(6)中的还原糖培养基可以 采用麦芽糖培养基或葡聚糖培养基，本实施例中采用麦芽糖培养基；步骤(6)中的掩蔽剂 还可以采用聚乙二醇或EDTA与乙二醇的混合物。
步骤(2)中厌氧发酵前可添加质量百分比为20 100%的步骤(4)中过滤后的沉淀， 本实施例里添加50%的步骤(4)中过滤后的沉淀物(为上次发酵后的产物)，重复利用、 反复发酵。
作诱导激活剂使用，步骤(6)中在温浴之前添加步骤(7)中抽滤后的上层物质，添加 的量为步骤(l)中产物合并后混合物质量的30%(—般控制在10 50%)且该上层物质抽 滤后添加前经过一2(TC冷冻干燥。
为进一步节约辅助原料及提高发酵效果，步骤(5)和步骤(8)中抽滤回收的溶液分离 提取试剂后剩下的母液可添加到步骤2中的碱离子液中循环使用，
本实施例制得的SOD于2002年7月22日，经上海市农科院畜牧兽医研究所检验， 测得酶活性为3456U/mg，常温下保存至2006年3月10日，再次测同一样品，测得酶 活性为2589U/mg，存活力为75%，本工艺所用主要设备，如下721电子可见分光光 度机、冷柜、50升塑料桶(作为厌氧发酵罐)、真空抽滤装置、蒸馏器、LG-5或LG-2
真空冷冻干燥机(由上海市离心机械研究所生产)、离心机、甩水机和冷却制冷设备。
根据本发明工艺制得的SOD具有良好的消炎作用，口服剂量为每次500/mg,每
12小时口服一次，可做成粉剂、水剂和胶囊，均可应用与各种癣症、便秘、多发性关节 炎、风湿心肌痛、化脓性溃疡、神经肿痛和急、慢性肠胃炎，已经有多个病例证明本发 明制得的SOD具有良好的消炎作用。
本实施例中的原料也可以采用以下五种制备豆粕、龙葵、白英、筋骨草和蛇莓， 其制得的SOD也具有良好的消炎作用，其他与实施例1相同。
本实施例中的原料也可以采用以下八种制备豆粕、龙葵、白英、筋骨草、蛇莓、 鸭跖草、萚草和鱼腥草，其制得的SOD也具有良好的消炎作用，其他与实施例l相同。
权利要求
1、一种植物超氧化物岐化酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)将洗净的豆粕、龙葵、白英、筋骨草、蛇莓分别粉碎、打浆；(2)合并步骤(1)中的打浆后的产物，添加重量3～4倍于合并后产物、质量百分比为0.5～2％的碱离子液，厌氧发酵1～12个月；(3)发酵完后，添加饱和缓冲液，直至pH值为7～8，厌氧静置4～6小时；(4)添加氧化剂和萃取剂到发酵容器中，脱水沉淀，过滤，取滤液，添加脱水氧化剂，在-10～0℃下，厌氧真空冷冻1～4小时，上述氧化剂添加的量为步骤(3)中溶液体积的1～100％，上述萃取剂添加的量为步骤(3)中溶液体积的15～80％，上述脱水氧化剂添加的量为步骤(3)中溶液体积的15～80％；(5)沉淀得到粗品酶，采用80～400目滤布抽滤，接着离心分离，取沉淀物，于-30～0℃真空冷冻干燥8～72小时；(6)将重量40～60倍于步骤(5)中产物、质量百分比为10～15％的还原糖培养基添加到上述产物，再添加重量0.2～0.3倍于还原糖培养基、质量百分比为1.5～3％的掩蔽剂，在78～90℃条件下温浴，温浴产物温度至65～75℃，取出；(7)在10～20分钟内，冷却至16～20℃，采用400～600目滤布抽滤；(8)取滤液，添加脱水氧化剂，厌氧静置2～4小时，抽滤、离心分离，得到产物，于-30～0℃真空机冷冻干燥24～72小时，再经常温真空器干燥24～72小时，即得超氧化物岐化酶，上述脱水氧化剂添加的量为步骤(7)中抽滤后溶液体积的15～80％，其中步骤(1)中各原料之间的质量比为1～100∶1～100∶1～100∶1～100∶1～100。
2、 根据权利要求1所述的植物超氧化物岐化酶的制备方法，其特征在于所述步骤 (l)中的原料还包括白花蛇舌草和半枝莲，且各物质之间的质量比为1 100: 1 100: l 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100。
3、 根据权利要求2所述的植物超氧化物岐化酶的制备方法，其特征在于所述步骤(l)中的原料还包括鸭跖草、萚草和鱼腥草，且各物质之间的质量比为1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100。
4、 根据权利要求1至3任一所述的植物超氧化物岐化酶的制备方法，其特征在于 所述步骤(2)中的碱离子液采用氢氧化钠溶液、氯化钾溶液或氯化钠溶液，步骤(3)中的 缓冲液采用柠檬酸、柠檬酸钠、醋酸、醋酸钠、磷酸二氢钾或氯化钠溶液，步骤(4)中的 氧化剂采用100%乙醇、质量百分比为1 20%的氢氧化钠溶液、质量百分比为10 40 %的双氧水、质量百分比为5 38%的盐酸或质量百分比为10 98%的硫酸，萃取剂采 用丙酮、二氯甲烷或三氯甲垸，步骤(4)中的脱水氧化剂采用乙醇、三氯甲垸、丙酮、二 氯甲烷或硫酸钠溶液，步骤(6)中的还原糖培养基采用麦芽糖培养基或葡聚糖培养基，步 骤(6)中的掩蔽剂采用EDTA溶液、聚乙二醇或上述两种的混合物，步骤(8)中的脱水氧 化剂采用100%乙醇、质量百分比为1 20%的氢氧化钠溶液、质量百分比为10 40% 的双氧水、质量百分比为5 38%的盐酸或质量百分比为10 98%的硫酸。
5、 根据权利要求1至3任一所述的植物超氧化物岐化酶的制备方法，其特征在于 所述步骤(2)中厌氧发酵前添加质量百分比为20 100%的步骤(4)中过滤后的沉淀物。
6、 根据权利要求1至3任一所述的植物超氧化物岐化酶的制备方法，其特征在于 所述的步骤(6)中在温浴之前添加步骤(6)中抽滤后的上层物质，且该上层物质抽滤后添 加前经过一20^^ — 10。C冷冻干燥，该上层物质添加的量为步骤(l)中产物合并后混合物质 量的10 50%。
全文摘要
一种植物超氧化物岐化酶的制备方法，包括如下步骤将各原料分别粉碎、打浆；合并上述打浆后的产物，加碱离子液，厌氧发酵；添加饱和缓冲液；将氧化剂和萃取剂加入到发酵容器中，脱水沉淀，过滤，取滤液，厌氧真空冷冻；添加脱水氧化剂，沉淀得到粗品酶，抽滤，离心分离，取沉淀物，真空冷冻干燥；将还原糖培养基添加到上述产物，再添加掩蔽剂，温浴抽滤；取滤液，将脱水氧化剂加到步骤(7)得到的滤液中，厌氧静置，抽滤、离心分离，冷冻真空机干燥，冷冻真空器干燥即得超氧化物岐化酶。与现有技术相比，本发明的优点在于以廉价中草药与豆粕配合，各取所长，相互协同，经过厌氧发酵，制得卫生无污染具有抑制病菌酶活性很高的SOD，直接可以服用或外涂，并且具有良好的消炎效果。
文档编号C12N9/08GK101104848SQ20061005249
公开日2008年1月16日 申请日期2006年7月13日 优先权日2006年7月13日
发明者王海宝 申请人:王海宝