胞外分泌型表达系统pES2c及其制备方法

专利名称：胞外分泌型表达系统pES2c及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种在常用宿主菌如大肠杆菌(E.coli)中表达时，能够呈现完整的有功能的RsaA分泌机器的原核胞外分泌型表达载体系统及其制备方法背景技术在生命科学研究和生物药物、生物制品的生产中，利用表达载体制备重组蛋白是重要而关键的环节。获得足够量的具有生物活性的重组蛋白是进行后续研究和生产的必要条件。利用现有的绝大部分表达载体，重组蛋白表达后定位于胞内或周质间隙而非胞外环境，给重组蛋白的有效表达利用带来了难以克服的问题(参见文献Hoffmann F，Rinas U.Stress induced by recombinant proteinproduction in Escherichia coli.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.2004，8973-92)。高表达的重组蛋白在胞内常常形成包涵体，生物活性不佳，复性困难，有效产率降低，并增加了宿主菌的代谢负担和毒性。周质间隙分泌表达虽可以显著增加重组蛋白生物活性，避免包涵体复性的繁琐程序，但其表达量有限且对重组蛋白的分子大小和结构要求苛刻。当活载体疫苗接种机体时，无论细菌在胞内或周质表达重组抗原，只有当菌体破碎后机体的免疫系统才能接触重组抗原，降低了疫苗的免疫效率。如果将重组蛋白分泌至细胞外，会使宿主菌所受毒性减轻，持续分泌表达重组蛋白；而且胞外环境有利于蛋白的折叠和稳定，重组蛋白活性显著增加；由于杂蛋白的干扰减少，重组蛋白易于纯化；活载体疫苗分泌至胞外的重组抗原可直接被机体免疫系统利用，免疫效率得以明显提高(参见文献Galen J E，Levine M M.can a‘flawless’live vector vaccine strain beengineered？Trends in Microbiology.2001，9(8)372-376)。所以，胞外分泌型表达十分有利于重组蛋白有效产率和生物利用度的提高。
实现重组蛋白向胞外递送的有效而重要的途径(参见文献Shokri A，SandenA M，Larsson G.Cell and process design for targeting of recombinant protein intothe culture medium of Escherichia coli.Appl.Microbiol.Biotechnol.2003，60(6)654-664)是通过基因操作，利用细菌的天然分泌系统，使之成为常用宿主菌如大肠杆菌(E.coli)向胞外分泌重组蛋白的运输工具，这种途径具有高效、特异和高度可控的特点。在革兰阴性菌的五型分泌系统中，I型分泌系统或称ABC(ATP-binding cassette)分泌系统具有转运装置相对简单、分泌途径特异性强、信号序列位于C端保证了重组蛋白的完整表达以及转运蛋白的表达调控相对清楚等优点，因此是最简单、实用、通用的重组蛋白胞外递送工具(参见文献YoungJ.and Holland I B.ABC transporterbacterial exporters-revisited five years on.Biochem.Biophys.Acta.1999，1461177-200)。I型分泌系统的分泌能力由转运蛋白的数量与活性决定。不同I型分泌系统转运蛋白的活性难以改变，因此在新宿主菌中转运蛋白基因的表达与否及表达水平、比例决定了分泌过程的效能和效率。
新月柄杆菌(Caulobacter crescentus，Cc)RsaA分泌系统是新近发现的最具有应用潜力的I型分泌系统，该系统负责将组装新月柄杆菌外膜S-层(SurfaceLayer，S-layer)的RsaA蛋白分子转运至胞外。RsaA分泌系统的转运装置由内膜的ABC转位酶、膜融合蛋白(MFP)以及外膜蛋白(OMP)三种功能蛋白组成。在三磷酸腺苷ATP水解作用下，ABC转位酶可识别RsaA蛋白C-端信号序列并发生构象改变，继而与MFP及OMP组装形成跨越内膜、周质间隙和外膜的连续性中空通道，将RsaA蛋白直接转运至细胞外。同理，外源重组蛋白融合了RsaA蛋白C-端信号序列后，也可被该转运装置识别并分泌至胞外。由于RsaA蛋白N端锚定序列的存在，RsaA蛋白被分泌出胞后会锚定在外膜，形成S-层。而外源重组蛋白缺乏此锚定序列，被分泌出胞后将游离于培养基中。参考文献Hahn H P，von Specht B-U.Secretory delivery of recombinant proteins in attenuatedSamonella strainspotential and limitations of type I protein transporters.FEMSImmunology and Medical Microbiology.2003，3787-98记载了RsaA分泌系统分泌能力很强，且该分泌系统基因为高水平组成型表达，因此该系统能够组成型分泌表达目标蛋白。
RsaA分泌系统的编码基因包括rsaA、rsaD、rsaE、rsaFa和rsaFb，它们分别编码S-层蛋白、ABC转位酶、MFP蛋白和OMP蛋白，rsaFa、rsaFb两个同源基因共同参与OMP蛋白的编码。rsaA、rsaD、rsaE基因存在于rsa操纵子基因座中，其中rsaA基因独立转录，受其上游的启动子PA调控；而rsaD、rsaE基因共表达，受其上游的启动子PDE调控；rsaA与PDE之间有一终止子TA。rsa操纵子结构见图1。
新月柄杆菌启动子不能为E.coli等常用宿主菌所识别，因此在E.coli中重现RsaA分泌系统功能的主要困难是该系统基因的合理表达。由于RsaA分泌系统多个功能基因间存在协调表达，系统功能的移植要求各功能基因的表达维持质的稳定与量的平衡。因此，首先需要通过研究，使RsaA分泌系统各功能基因在E.coli中以合理水平组成型表达；同时表达RsaA分泌系统基因的相关调控序列的选择也非常重要，按基因上下游顺序，分别为启动子、翻译增强序列、RBS位点及其与翻译起始位点的间距、翻译终止密码子和转录终止子等。

发明内容
本发明的目的是提供一种胞外分泌型表达系统pES2c，所述系统可以提高重组蛋白表达的有效产率和生物利用度，有高活性、高产量、低成本、操作简便易控的优点。
本发明的另一个目的是提供一种胞外分泌型表达系统pES2c的制备方法，在相容性质粒基础上，利用基因克隆、DNA重组和DNA定点突变技术改造和移植利用新月柄杆菌RsaA分泌系统的功能基因，同时增加相应调控序列得到胞外分泌型表达载体系统pES2c。
本发明的技术方案是rsaAs与rsaD及rsaE构建在pQE30载体上rsaAs与rsaD及rsaE基因顺式串联，保持了rsa操纵子的野生型组织方式，人工添加组成型启动子、翻译调控元件和强终止子序列，构建在载体pQE30上，处于pQE30原有T5启动子下游，形成重组rsa操纵子表达载体pQE30-rsaAs-PT5-rsaD-rsaE。
rsaFa和rsaFb基因构建在相容质粒pBIOEx上rsaFa和rsaFb基因顺式串联后，构建在相容质粒pBIOEx上，受到人工添加的组成型启动子、翻译调控元件和强终止子序列调控，形成OMP表达载体pBIOEx-PT5-rsaFaFb。重组rsa操纵子表达载体pQE30-rsaAs-PT5-rsaD-rsaE和OMP表达载体pBIOEx-PT5-rsaFaFb共转化至宿主菌BL21(DE3)，组成完整的胞外分泌型表达载体系统。
胞外分泌型表达载体系统的构建方法，包括以下步骤1.选择新月柄杆菌RsaA分泌系统作为目标重组蛋白向胞外递送的有效运输工具。
2.调控序列片段的获得及检测将三种调控序列片段-PT5(组成型T5启动子)、Epsilon-SD(T7噬菌体gene-10翻译增强子序列及其核糖体结合位点序列，后简称ESD)和rmBT1(核糖体终止子序列)分别克隆至pAcGFP质粒载体，通过检测报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达来检测调控序列基因的表达情况。
步骤如下(1)以pQE30为模板，扩增rrnBT1强终止子序列。
(2)合成启动子PT5和翻译调控序列Epsilon-SD，进一步延伸获得PT5-Epsilon-SD(PT5ES)调控序列片段。
(3)在pAcGFP质粒载体中的GFP基因上游多克隆位点中插入rrnBT1强终止子序列，形成pAcGFP-T，并转化E.coli IPTG诱导表达，检测绿色荧光蛋白(GFP)表达。
(4)在pAcGFP-T质粒中的rmBT1强终止子序列下游插入PT5ES，形成pAcGFP-PT5质粒，转化E.coli后，检测绿色荧光蛋白(GFP)表达。
3.RsaA分泌系统功能基因的克隆及检测将RsaA分泌系统功能基因片段rsaAs、rsaD、rsaE、rsaFa和rsaFb分别克隆至pAcGFP质粒载体，通过检测报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达来检测RsaA分泌系统功能基因的表达情况。
步骤如下(1)克隆新月柄杆菌RsaA分泌系统rsaAs、rsaD、rsaE、rsaFa、rsaFb基因。
(2)酶切去除pAcGFP-PT5中的GFP基因编码序列，引入rrnBT1强终止子序列，形成pAc-PT5。
(3)rsaD、rsaE、rsaFa、rsaFb基因分别插入pAc-PT5中引入的SD序列与下游rrnBT1终止子中，形成pAc-PT5-rsaD、pAc-PT5-rsaE、pAc-PT5-rsaFa和pAc-PT5-rsaFb，转化E.coli后检测各个分泌功能基因的表达及定位。
(4)双酶切pAc-PT5-rsaD和pAc-PT5-rsaFa，去除引入的下游rrnBT1终止子序列。
(5)双酶切pAc-PT5-rsaE和pAc-PT5-rsaFb，获得片段Epsilon-SD-rsaE-rrnBT1和Epsilon-SD-rsaFb-rrnBT1。
(6)将片段Epsilon-SD-rsaE-rrnBT1和Epsilon-SD-rsaFb-rrnBT1分别与酶切后的pAcGFP-PT5-rsaD和pAcGFP-PT5-rsaFa连接，获得重组质粒pAcGFP-PT5-rsaD-rsaE和pAcGFP-PT5-rsaFaFb，经酶切鉴定，转化E.coli，检测各个分泌功能基因的表达及定位。
(7)在pAcGFP质粒中GFP基因下游多克隆位点中插入rsaAs基因片段，使GFP基因与rsaAs信号序列同框融合，形成pAcGFP-rsaAs，转化E.coli，IPTG诱导表达，检测GFP融合蛋白的表达。
4.分泌表达载体系统的构建及效果验证构建pQE30-GFP-rsaAs-PT5-rsaD-rsaE和pBIOEx-PT5-rsaFaFb重组质粒并共转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)中，通过检测报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况以验证胞外分泌表达载体系统pES2c的胞外分泌效果。步骤如下(1)双酶切pAcGFP-PT5-rsaD-rsaE质粒，获得PT5-rsaD-rsaE-rrnBT1片段。
(2)双酶切pAcGFP-rsaAs质粒中rsaAs序列下游多克隆位点，引入片段PT5-rsaD-rsaE-rrnBT1，使各RsaA分泌系统基因按野生型方式排列，获得pAcGFP-PT5-rsaAsDE。
(3)双酶切pAcGFP-PT5-rsaFaFb，获得PT5-rsaFaFb-rrnBT1片段。
(4)双酶切质粒pBIOEx的多克隆位点，引入PT5-rsaFaFb-rrnBT1片段，获得pBIOEx-PT5-rsaFaFb。
(5)将pAcGFP-PT5-rsaAsD-rsaE与pBIOEx-PT5-rsaFaFb共转化转化E.coli，双抗性筛选阳性克隆，并IPTG诱导表达，检测GFP融合蛋白的分泌表达情况及各个分泌功能蛋白的表达及定位。
(6)将pAcGFP-PT5-rsaAsDE双酶切，获得rsaAs-PT5-rsaD-rsaE-rrnBT1片段。
(7)双酶切pQE30后，引入rsaAs-PT5-rsaD-rsaE-rrnBT1片段，得到pQE30-GFP-rsaAs-PT5-rsaD-rsaE重组质粒。
(8)将重组质粒pQE30-GFP-rsaAs-PT5-rsaD-rsaE与pBIOEx-PT5-rsaFaFb共转化E.coli，双抗性筛选阳性克隆，并IPTG诱导表达，检测GFP融合蛋白的分泌表达情况。
本发明所构建的分泌表达载体系统，是采用DNA克隆与重组技术赋予RsaA分泌系统功能基因能够被大肠杆菌所识别的转录和翻译调控序列，并按不同组合方式与现有载体pQE30、pBIOEx连接后获得。
质粒载体pAcGFP、pQE30、pBIOEx，RsaA分泌系统功能基因rsaA、rsaD、rsaE、rsaFa、rsaFb以及调控序列启动子PT5、翻译增强序列Epsilon-SD、终止子rrnBT1的原始序列及特征如下。
质粒pAcGFP全长共3354bp，由美国CLONTECH公司出品，由pUC19衍生而来，包含了Aequoreacoerulescens来源的绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)。GFP是一个238个氨基酸的蛋白质，在各种不同的系统中表达后，重组GFP均可吸收蓝光，发出明亮的绿色荧光。GFP的生物发光不需要任何底物或辅助因子，因此可以在活组织内监测其表达情况。在细菌内表达水平较高的GFP对细菌没有毒性，并不干扰细菌的生长和功能。检测GFP表达时可在活细菌的情况下检测基因的表达，因此，GFP可以作为在活细胞内基因表达的标记，构建入载体后，用于检测启动子的强度等。GFP的相对分子质量较小，其N、C端均可融合，并不影响其发光。将GFP与其他蛋白作成融合蛋白，即可作为研究细胞内蛋白质定位、蛋白质转运和基因表达水平的一个极好的报告基因。质粒pAcGFP推荐宿主菌为大肠杆菌JM109，拷贝数约为500。其结构特征参见图2。图中95～178为lac启动子(111～124CAP结合位点；143～148为-35区；167～172为-10区；179为转录起始位点；179～199为lac抑制子)，206～209为核糖体结合位点，217～219为起始密码子234～281为5’端多克隆位点(5’MCS)，289～1008为lacZ-AcGFP1融合蛋白编码区，1009～1108为3’端多克隆位点(3’MCS)，1484～2411为氨苄抗性基因，2562～3205为pUC质粒复制原点。
质粒pQE30全长3461bp，由QIAGEN公司出品，属中低拷贝数质粒。该质粒具有诱导型的强T5启动子，在开放阅读框的5’端具有6个组氨酸残基的组氨酸标签，并且还具有强的转录终止子rrnBT1。其序列特征参见图3。图中7～87T5为启动子/lac抑制子元件，61为转录起始位点，127～144为组氨酸标签，145～192为多克隆位点，208～302为λ转录终止子区，1064～1162为rrnBT1转录终止子区，3256～2396为β-内酰胺酶编码区。
质粒载体pQE30的特征为(1)该质粒为QIAGEN公司出品的原核表达质粒载体。
(2)该质粒载体的复制原点为ColE1，与具有pMB1复制原点的质粒载体(如pET系列、pUC系列载体)属于同一不相容组。
(3)该质粒载体的启动子为诱导型T5启动子，与Lac启动子类似，不需要特殊的RNA聚合酶来识别，通用性较好。
(4)该质粒载体的筛选标记为Ampr。
(5)该质粒载体表达的融合蛋白N端具有组氨酸标签(6×His)，表达的目标蛋白可以用抗组氨酸标签的抗体进行鉴定。
同时具有上述质粒载体pQE30的(2)、(3)、(4)项特点的原核表达载体均可以作为分泌表达载体的骨架。
pBIOEx质粒由波兰科学家Krzysztof Skowronekl和Andrzej A.Kasprzak构建(参见文献Krzysztof Skowronek and Andrzej A.Kasprzak，A two-plasmid systemfor independent genetic manipulation of subunits of homodimeric proteins andselective isolation of chimeric dimmers，Analytical Biochemistry，2002(2)185-191)，大小为6770bp。具有p15A和f1复制原点，T7启动子，birA基因，四环素和氯霉素双重抗性(TetRCmR)。pAcGFP和pQE30属于同一不相容组，pBIOEx与pAcGFP或pQE30分属不同的不相容组，且具有不同抗性，能够在同一细菌内共存。该质粒的基因分布及多克隆位点参见图4。
RsaA分泌系统基因rsaAs、rsaD、rsaE、rsaFa和rsaFb序列见序列说明。
诱导型T5启动子QIAGEN公司pQE30载体的T5诱导型启动子属高强度启动子，可在E.coli中表达(斜体所示分别为-35区和-10区，-35区和-10区间序列为Lac阻遏子元件，框内A碱基为转录起始位点)。
GAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCA 为达到组成型表达的目的，需要将诱导型T5启动子的Lac阻遏子元件去除，同时保持-35区和-10区间距仍为18bp。故通过寡核苷酸合成获得如下组成型T5启动子(PT5)PT5GAAATCATAAAAAATTTATTTGCTATCCGCTCATGATAGAATTATAATAGATTCA T7噬菌体gene-10翻译增强子序列(Epsilon)及其核糖体结合位点序列(SD)根据GeneBank报道的T7噬菌体gene-10翻译增强子序列(Epsilon)及其核糖体结合位点序列(SD)，同时具备优化的间隔序列(框内序列为翻译增强子Epsilon，斜体所示为核糖体结合位点，黑体为翻译起始密码子)。
Epsilon-SDTCTAGAAATAATTTTGT AGAAGGAGATATCATATGrrnBT1终止子根据QIAGEN公司公布的pQE30载体全序列，rrnBT1强终止子序列如下(图示pQE30载体961～1260区段序列共300bp，其中rrnBT1全序列及其茎环样结构序列如下划线及斜体所示)961AATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGT1021TATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACG1081AAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCT
1141CCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAA1201AACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGG本发明的执行分泌功能的基因rsaD、rsaE、rsaFa、rsaFb均保持了其原始编码序列，它们的转录非翻译区中的翻译调控元件区序列相同。其中，rsaD和rsaE基因顺式串联，rsaFa和rsaFb基因顺式串联，分别受到其共同的组成型启动子调控。分泌信号区序列rsaAs包含了编码必须的82个氨基酸的序列、终止密码子及下游的基因间终止子区序列。分泌信号序列rsaAs上游的多克隆位点，允许目标基因以同框的方式与rsaAs信号序列融合，并受其上游的诱导型启动子调控。Rsa操纵子允许偶尔的重组目标基因转录通读。
胞外分泌表达模式能够显著避免生物活性不佳，复性困难，有效产率降低，宿主菌的代谢负担和毒性的缺点。新月柄杆菌RsaA分泌系统具有高效、特异和组成型表达的特点，具有作为重组蛋白胞外递送工具的巨大潜力，能够在大肠杆菌中重现RsaA分泌系统的功能，以此为基础构建高效通用的胞外分泌表达载体系统。
本发明所构建的胞外分泌表达载体系统，采用DNA克隆与重组技术赋予RsaA分泌系统功能基因能够被大肠杆菌所识别的转录和翻译调控序列，并按不同组合方式与现有载体pAcGFP、pQE30、pBIOEx连接后获得。本发明载体系统能够将目标重组蛋白分泌至胞外培养基，显著增加重组蛋白的有效产率。
本发明分泌表达载体系统pES2c具有完整的rsaD、rsaE、rsaFa、rsaFb基因编码序列，这些功能基因的翻译调控序列均置换为为Epsilon-SD序列，保证了功能基因的翻译效率。同时，rsaD、rsaE、rsaFa、rsaFb四个功能基因也处于组成型启动子T5与强终止子rrnBT1的调控之下，保证了转录的稳定性和效率。完整的分泌信号序列rsaAs具有多克隆位点，允许外源基因的同框融合，并处于背景载体本身所具有的诱导型启动子调控之下。当引入外源基因后，可在选择的时相内使重组蛋白开始快速、大量、持续地表达，并被分泌至胞外环境中。因此，该分泌表达载体能够在大肠杆菌中稳定地持续性表达分泌功能蛋白，重组蛋白的分泌能力、效率以及通用性较现有商品化载体都有显著提高，尤其是能够显著增加重组蛋白的生物活性。
本发明分泌型表达载体系统pES2c利用氨苄抗性、四环素抗性或氯霉素抗性，该载体系统能够在细菌体内长期稳定存在。组成型表达的分泌功能蛋白RsaD和RsaE主要位于细菌内膜上，而RsaFa和RsaFb则定位于细菌的外膜上。构建好的载体系统pES2c示意图见图5。其中图5-1为重组质粒pQE30-PT5-rsaAs-rsaD-rsaE；图5-2为重组质粒pBIOEx-PT5-rsaFaFb。这两个重组质粒需共转化宿主菌方能构成完整的分泌表达载体系统pES2c。
本发明利用DNA操作技术，获得所需的RsaA分泌系统功能基因及调控序列，基于相容质粒pQE30/pBIOEx，按照RsaA分泌系统功能基因的野生型组织方式来安排其在表达载体上的位置，构建了原核胞外分泌型表达载体系统pES2c。该载体系统在大肠杆菌等常用宿主菌中表达时，能够呈现完整的有功能的RsaA分泌机器。由于组成分泌机器的各转运蛋白及被转运的目标重组蛋白的表达水平及其比例会影响到分泌过程的效能与效率，因此通过质粒拷贝数、启动子强度、单双质粒系统等不同层次的组合获得了表达载体系统pES2c系列。本发明胞外分泌型表达载体pES2c系统具有高活性、高产量、低成本、操作简便易控等优点，有望突破现有重组蛋白表达技术瓶颈，为基因工程药物/疫苗研发、生产和相关生物工程技术实验研究提供崭新关键技术平台。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。


图1.rsa操纵子结构示意图；图2.pAcGFP质粒序列结构图；图3.pQE 30质粒序列结构图；图4.pBIOEx质粒序列结构图；图5.构建好的载体系统示意图；图5-1为重组质粒pQE30-PT5-rsaAs-rsaD-rsaE；图5-2为重组质粒pBIOEx-PT5-rsaFaFb；图6为胞外分泌型表达系统pES2c制备流程图。
具体实施例方式
一、材料本实施例中实验所需限制性内切酶均购自英国Biolab公司；PCR扩增酶、连接酶均购自大连Takara公司；质粒载体pAcGFP购自美国Biotech公司，pQE30购自美国Qiagen公司；pBIOEx质粒载体制备方法和用途参见文献Krzysztof Skowronek andAndrzej A.Kasprzak，A two-plasmid system for independent genetic manipulation ofsubunits of homodimeric proteins and selective isolation of chimeric dimmers，Analytical Biochemistry，2002(2)185-191。
新月柄杆菌菌株ATCC 19089购自ATCC；感受态细菌E.coli JM109和E.coli BL21(DE3)均购自上海申能博彩生物科技有限公司。
其余常规试剂均为市售。
二、实施例参见图6。
实施例1调控序列片段的获得及检测1.克隆核糖体终止子序列rrnBT1(1)用于扩增rrnBT1终止子序列的引物序列如下T1(上游引物)5’-TAAACGCCTGGGGTAATGA-3’，T2(下游引物)5’-GTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCA-3’。
(2)以pQE30质粒为模板，T1与T2等摩尔比混合并加入ddNTP和DNA聚合酶，94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸30秒，完成30个循环反应，扩增出rrnBT1终止子序列，并克隆入pMD18-T，转化感受态大肠杆菌后，氨苄抗性加蓝白斑筛选阳性克隆，酶切鉴定并经测序确定插入片段的序列正确性，获得pMD18-rrnBT1。
2.获得组成型T5启动子(PT5)、T7噬菌体gene-10翻译增强子序列及其核糖体结合位点序列(Epsilon-SD)。
(1)合成如下两条寡核苷酸片段PT5S15’-GAAATCATAAAAAATTTATTTGCTATCCGCTCATGATAGAATTATAATAGATTCAA-3’；PT5S25’-TCTAGAAATAATTTTGT AGAAGGAGATATCATATG-3’；(2)PT5S1与PT5S2等摩尔比混合并加入ddNTP和DNA聚合酶，94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸30秒，完成1个循环反应，PCR产物克隆入pMD18-T，蓝白斑筛选阳性克隆，酶切鉴定并经测序确定插入片段的序列正确性，获得pMD18-PT5-ESD。
3.pMD18-rrnBT1双酶切得到rrnBT1片段，同时用双酶切质粒pAcGFP，连接rrnBT1片段与pAcGFP载体，转化感受态大肠杆菌后，酶切鉴定并经测序确定插入片段的正确性，获得pAcGFP-rrnBT1。取pAcGFP-rrnBT1阳性克隆单菌落接种于5ml AmpRLB培养基中，抗生素浓度为Amp 50μg/ml，37℃摇菌培养8h。取50μl菌液重新接种于5ml AmpR LB培养基中，当OD600≈0.3时加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L进行诱导，诱导8h，期间不断用手提式长波紫外线(302nm)照射，肉眼观察菌液有无可见的绿色荧光发出，其亮度变化情况。诱导8h后，取1ml菌液，6000rpm离心后，观察培养液上清及湿菌体有无绿色荧光发出及强度。收集的菌体用10倍体积的1×TE缓冲液(pH8.0)重悬后，取出100μl重悬菌液加入等体积的SDS-PAGE电泳2×上样缓冲液混合。将样品沸水中煮3min，取10μl上样进行SDS-PAGE电泳。剩余重悬菌液用超声波粉碎机破菌，细胞破碎液16000g×30min 4℃离心分离上清和沉淀，并观察培养液上清及湿菌体有无绿色荧光发出及强度(检测过程以pAcGFP载体作为阳性对照，pUC19质粒作为阴性对照)。
4.双酶切pMD18-PT5-ESD，获得PT5-Epsilon-SD序列片段，同时对pAcGFP-rrnBT1双酶切。将PT5-Epsilon-SD片段与pAcGFP-rrnBT1连接，转化感受态大肠杆菌后，用手提式长波紫外线(302nm)照射AmpRLB培养基平皿上的转化细菌克隆，观察克隆是否发出绿色荧光。对能够发出绿色荧光的克隆进行酶切鉴定并经测序确定插入片段的正确性，获得pAcGFP-T-PT5-ESD。取pAcGFP-T-PT5-ESD重组质粒阳性克隆单菌落接种于5ml AmpRLB培养基中，抗生素浓度为Amp 50μg/ml，37℃摇菌培养8h。取50μl菌液重新接种于5ml AmpRLB培养基中，当OD600≈0.3时加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L进行诱导，诱导8h，期间可用手提式长波紫外线(302nm)照射，肉眼观察菌液有无可见的绿色荧光发出。诱导8h后，取1ml菌液，6000rpm离心后，观察培养液上清及湿菌体有无绿色荧光发出及强度。收集的菌体用10倍体积的1×TE缓冲液(pH8.0)重悬后，取出100μl重悬菌液加入等体积的SDS-PAGE电泳2×上样缓冲液混合。将样品沸水中煮3min，取10μl上样进行SDS-PAGE电泳。剩余重悬菌液用超声波粉碎机破菌，细胞破碎液16000g×30min 4℃离心分离上清和沉淀，并观察培养液上清及湿菌体有无绿色荧光发出及强度(检测过程以pAcGFP载体作为阳性对照，pAcGFP-rrnBT1质粒作为阴性对照，pUC19质粒作为空白对照)。
实施例2RsaA分泌系统功能基因的克隆及检测1.用经典的基因组DNA提取方法抽提新月柄杆菌CB15的基因组DNA。
2.按照GenBank公布的rsaAs、rsaD、rsaE、rsaFa、rsaFb基因序列，设计如下引物p15’-GCCTTCGGCGCTGCGGTCACCCTGGGC-3’；p25’-GCGATCCTCGCCTAGGCGAGGATCAGACGTTC-3’；p35’-GCTACGCGCTGGCCGGCCTTGCCTAG-3’；p45’-TTACTGGACGCGCTGCAACGGCGCGGG-3’；p5；5’-ATGTTCAAGCGCAGCGGCGCGAAGCCGACG-3；p6；5’-CTACTCCTAGCGCATCGTGGTGCGCAGG-3p75’GCTAGCATGCGAGTGCTGTCGAAAGTTCTGTCCGTG，含NheI酶切位点。
p85’TCTAGAAATTCAGCTCCGTCGGCAAAGCGCCGCGG，含XbaI酶切位点。
p95’TCTAGAATGTTGATGTCGAACCGTCGACGGG，含XbaI酶切位点。
p105’AAGCTTAATCTATTTCGAGCCGCTCGGGGGCTT，含HindIII酶切位点。
3.p1与p2、p3与p4、p5与p6、p7与p8、p9与p10p分别配对，以新月柄杆菌CB15基因组DNA为模板，PCR方法扩增获得改造了的rsaAs、rsaD、rsaE、rsaFa、rsaFb基因序列，并将这些基因序列克隆入pMD18-T。转化感受态大肠杆菌后，蓝白斑筛选阳性克隆，酶切鉴定并经测序确定所得基因序列的正确性，获得pMD18-rsaAs、pMD18-rsaD、pMD18-rsaE、pMD18-rsaFa和pMD18-rsaFb。
4.用rrnBT1片段置换重组质粒pAcGFP-T-PT5-ESD的Epsilon-SD-AcGFP序列，使新插入的rrnBT1终止子序列与原有的rrnBT1终止子和PT5启动子序列顺式串联，经酶切和测序鉴定，获得重组质粒pT-PT5-T。同时分别对pMD18-rsaAs、pMD18-rsaD、pMD18-rsaE、pMD18-rsaFa和pMD18-rsaFb双酶切，获得经改造的rsaD、rsaE、rsaFa和rsaFb基因片段。将这些基因片段插入pT-PT5-T质粒相应酶切位点，使rsaD、rsaE、rsaFa和rsaFb基因处于上游PT5启动子和下游rrnBT1终止子的调控之下。连接后的质粒载体转化感受态大肠杆菌后，酶切鉴定并经测序确定插入片段的方向和序列正确性，获得重组质粒p-PT5-ESD-rsaD、p-PT5-ESD-rsaE、p-PT5-ESD-rsaFa和p-PT5-ESD-rsaFb。
分别取p-PT5-ESD-rsaD、p-PT5-ESD-rsaE、p-PT5-ESD-rsaFa和p-PT5-ESD-rsaFb重组质粒阳性克隆单菌落接种于5ml AmpRLB培养基中，抗生素浓度为Amp 50μg/ml，37℃摇菌培养8h。取50μl菌液接种于重新接种于5ml AmpRLB培养基中，培养8h，期间分别在1，2，3，5，8h取0.5ml菌液，6000rpm离心5min后，弃去上清。收集的菌体用10倍体积的1×TE缓冲液(pH8.0)重悬。免疫荧光检测全菌细胞膜上的RsaD、RsaE、RsaFa和RsaFb蛋白。分离细菌细胞膜成分，SDS-PAGE、Western BlottinG、ELISA对细胞膜上的RsaD、RsaE、RsaFa和RsaFb蛋白进行定性和定量分析。
实施例3分泌表达载体系统的构建及检测1.p-PT5-ESD-rsaD和p-PT5-ESD-rsaFa重组质粒分别双酶切，去掉下游rrnBT1终止子序列。
2.分别双酶切p-PT5-ESD-rsaE和p-PT5-ESD-rsaFb，获得片段Epsilon-SD-rsaE-rrnBT 1和Epsilon-SD-rsaFb-rrnBT1。
3.将酶切得到的DNA片段分别与去除了下游rrnBT1终止子的p-PT5-ESD-rsaD和p-PT5-ESD-rsaFa连接，转化E.coli JM109，酶切鉴定，获得重组质粒p-PT5-ESD-rsaD-rsaE和p-PT5-ESD-rsaFaFb。
4.在pAcGFP质粒中GFP基因的下游多克隆位点中插入rsaAs基因片段，使GFP基因与rsaAs信号序列同框融合，转化E.coli JM109，酶切鉴定并测序，获得重组质粒pAcGFP-rsaAs。取重组质粒pAcGFP-rsaAs阳性克隆单菌落接种于5ml AmpRLB培养基中，抗生素浓度为Amp 50μg/ml，37℃摇菌培养8h。取50μl菌液重新接种于5ml AmpRLB培养基中，当OD600≈0.3时加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L进行诱导，诱导5h，期间可用手提式长波紫外线(302nm)照射，肉眼观察菌液有无可见的绿色荧光发出。诱导5h后，取1ml菌液，6000rpm离心收集细菌。收集的菌体用10倍体积的1×TE缓冲液(pH8.0)重悬后，取出100μl重悬菌液加入等体积的SDS-PAGE电泳2×上样缓冲液混合。将样品沸水中煮3min，取10μl上样进行SDS-PAGE电泳。剩余重悬菌液用超声波粉碎机破菌，细胞破碎液16000g×30min 4℃离心分离上清和沉淀，观察上清和沉淀有无绿色荧光发出及强度，同时用SDS-PAGE电泳分别对上清和沉淀中的GFP融合蛋白进行检测(检测过程以pAcGFP载体作为阳性对照，pUC19质粒作为阴性对照)。
5.双酶切p-PT5-ESD-rsaD-rsaE，获得PT5-ESD-rsaD-rsaE-rrnBT1片段。
6.将获得的PT5-ESD-rsaD-rsaE-rrnBT1片段插入pAcGFP-As质粒的rsaAs序列下游多克隆位点，使rsaAs、rsaD、rsaE基因按野生型方式排列，转化E.coliJM109，酶切鉴定，获得重组质粒P-PT5-GFP-rsaAs-rsaD-rsaE。
7.双酶切p-PT5-ESD-rsaFaFb，获得PT5-ESD-rsaFaFb-rrnBT1片段。
8.双酶切质粒pBIOEx，引入PT5-ESD-rsaFaFb-rrnBT1片段，转化E.coliJM109，酶切鉴定，获得重组质粒pBIOEx-PT5-rsaFaFb。
9.从37℃培养16～20h的CmRLB培养平板上挑取重组质粒pBIOEx-PT5-rsaFaFb阳性克隆，接种100ml CmRLB培养基中，抗生素浓度为Cm 50μg/ml，37℃剧烈震摇培养3h后利用氯化钙制备感受态细胞E.coliJM109-BF2。
10.重组质粒p-PT5-GFP-rsaAs-rsaD-rsaE转化感受态细胞E.coli JM109-BF2(相当于质粒p-PT5-GFP-rsaAs-rsaD-rsaE和质粒pBIOEx-PT5-rsaFaFb共表达)，利用AmpRCmRLB培养平板筛选双阳性转化克隆。挑取双阳性转化细菌克隆，接种5ml AmpRCmRLB液体培养基，抗生素浓度为Amp 50μg/ml，Cm 60μg/ml，37℃摇菌培养8h。取500μl培养菌液重新接种于50ml AmpRCmRLB液体培养基中，当OD600≈0.3时加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导，诱导16h，期间可用手提式长波紫外线(302nm)照射，肉眼观察菌液有无可见的绿色荧光。诱导期间，分别于3h，6h，9h，12h，16h各取5ml菌液，4℃ 6000rpm离心10min后，吸取上清液3ml。培养液上清经0.22μm滤菌膜过滤除菌后，用手提式长波紫外线(302nm)照射，肉眼观察菌液有无可见的绿色荧光。用三氯乙酸沉淀法沉淀上清中的蛋白，SDS-PAGE、Western Blotting检测GFP-RsaAs融合蛋白(检测过程以pAcGFP转化克隆、p-PT5-GFP-rsaAs-rsaD-rsaE转化克隆、pAcGFP/pBIOEx-PT5-rsaFaFb双转化克隆作为阴性对照)。
离心沉淀的菌体用10倍体积的1×TE缓冲液(pH8.0)重悬后，超声波粉碎机破菌，细胞破碎液16000g×30min 4℃离心分离上清和沉淀。对上清和沉淀用SDS-PAGE、Western Blotting检测GFP-RsaAs融合蛋白(检测过程以pAcGFP-rsaAs转化克隆作为阳性对照，pUC19质粒作为空白对照)。
序列表<110>中国人民解放军第三军医大学<120>一种胞外分泌型表达载体系统及其构建策略与方法<130>
<160>24<170>
<210>1<211>3354<212>DNA<213>大肠杆菌(E.coli)<220>
<221>
<222>
<223>pAcGFP质粒<400>1AGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACCGGCATCGTGCCCATCCTGATCGAGCTGAATGGCGATGTGAATGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCTGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTGAGCTACGGCGTGCAGTGCTTCTCACGCTACCCCGATCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCTGAGGGCTACATCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCGAGGATGACGGCAACTACAAGTCGCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGATACCCTGGTGAATCGCATCGAGCTGACCGGCACCGATTTCAAGGAGGATGGCAACATCCTGGGCAATAAGATGGAGTACAACTACAACGCCCACAATGTGTACATCATGACCGACAAGGCCAAGAATGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGATGGCAGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAATACCCCCATCGGCGATGGCCCTGTGCTGCTGCCCGATAACCACTACCTGTCCACCCAGAGCGCCCTGTCCAAGGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGATCTACTTCGGCTTCGTGACCGCCGCCGCCATCACCCACGGCATGGATGAGCTGTACAAGTGAGCGGCCGCGACTCTAGAATTCCAACTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAACTTGTCTGGTGTCAAAAATAATAGGCCTACTAGTCGGCCGTACGGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGGCCTTAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAG
ATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG<210>2<211>3461<212>DNA<213>大肠杆菌(E.coli)<223>pQE30质粒<400>2CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCGCATGCGAGCTCGGTACCCCGGGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGAT
GCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACG AAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC<210>3<211>249<212>DNA<213>新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)<223>rsaAs基因片段<400>3gccttcggcgctgcggtcaccctgggcgctgctgcgaccctggctcagtacctggacgctgctgctgccggcgacggcagcggcacctcggttgccaagtggttccagttcggcggcgacacctatgtcgtcgttgacagctcggctggcgcgaccttcgtcagcggcgctgacgcggtgatcaagctgaccggtctggtcacgctgaccacctcggccttcgccaccgaagtcctgacgctcgcctaa<210>4<211>1737<212>DNA
<213>新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)<223>rsaD基因片段<400>4atgttcaagcgcagcggcgcgaagccgacgatcctcgaccaggccgtgctggtcgcccgcccggcggtgatcaccgccatggtcttcagcttcttcatcaacattctggccctggtcagcccgctgtacatgctgcaggtctatgaccgcgtgctgaccagccgcaacgtttcgaccctgatcgtgttgacggtcatctgcgtcttcctgttcctggtctacggcctgctcgaggcgctgcgcacccaggtgctggtgcgcggcggtctgaagttcgacggcgtggcccgggatccgatcttcaagtcggtgctggactccacgctcagccgcaagggcatcggcggccaggcgttccgcgacatggaccaggtccgagagttcatgaccggcggcctgatcgccttctgcgatgcgccctggacgccggtgttcgtcatcgtctcgtggatgctgcacccgttcttcggcatcctggcgatcatcgcctgtatcatcatcttcggcctggccgtgatgaacgacaacgccaccaagaacccgatccagatggccaccatggcctcgatcgccgcccagaacgacgccggttccaccctgcgcaacgccgaggtcatgaaggccatgggcatgtggggcggcctgcaagcccgctggcgcgcgcgccgcgacgagcaggtggcctggcaggccgccgccagcgacgccggcggcgcggtgatgtcgggcatcaaggtgttccgcaacatcgtccagaccctgatcctgggcggcggcgcctatctggccatcgacggcaagatctcggccggcgcgatgatcgccggctcgatcctggtcggccgcgccctggcgcccatcgagggcgccgtgggtcagtggaagaattatatcggcgcgcgcggcgcctgggatcgcctgcagaccatgctgcgcgaggaaaagagcgccgacgaccacatgccgctgcccgagccgcgcggcgtgctgtcggccgaagccgcctcgatcctgccgccgggcgcgcaacagccgaccatgcgccaggccagcttccgtatcgacgccggcgccgcggtggcccttgtcggtcccagcgcggcgggcaagtcctcgctgctgcgcggtatcgtcggcgtctggccctgcgcggcgggcgtcatccgcctcgacggctacgacatcaagcagtgggatcccgagaagctgggtcgccacgtcggctacctgccgcaggacatcgagctgttctcgggcaccgtcgcccagaacatcgcccgcttcaccgagttcgaatcgcaggaagtcatcgaggccgcgaccctggcgggcgtgcacgagatgatccagagcctgccgatgggctatgacacggcgatcggcgagggcggcgcctcgctgtccggcggccagcgccagcgcctggccctggcgcgtgcggtgttccgcatgccggccctgctggtgctggacgagccgaacgccagcctcgaccaggtgggcgaagtggcgctgatggaagcgatgaagcggcttaaggccgctaagcgcacggtgatcttcgccacccacaaggtgaacctgttggcccaggccgactacatcatggtgatcaaccagggtgtgatcagcgactttggcgaacgcgacccgatgctggccaagctgaccggggctgcgccgccccagacgccgccgccgacgccgccgcccgcgccgttgcagcgcgtccagtaa<210>5<211>1311<212>DNA<213>新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)<223>rsaE基因片段<400>5atgaagccccccaagatccagcgtccgacggacaacttccaggctgtggcccgtatcggctacggcatcatcgccctgacctttgtcggtctgttgggctgggccgcgttcgccccgctcgacagcgcggtgatcgccaacggcgtcgtctccgccgagggtaatcgcaagaccgtgcagcacctcgaaggcggcatgctggccaagatcctggtccgcgaaggcgagaaggtgaaggccggccaggtgctgttcgagctggacccgacccaggccaacgccgccgccggcatcacccgcaaccagtacgtggctttgaaggccatggaagcgcgcctgctggccgagcgcgaccagcgtccgtccatcagcttccccgccgacctgaccagccagcgcgccgatccgatggtcgcccgcgccatcgccgacgaacaggcccagttcactgagcgtcgccagacgatccagggccaggtcgacctgatgaacgcccagcgtttgcagtatcagagcgagatcgagggcatcgaccgtcagacccagggcctgaaggaccaactcggcttcatcgaggacgagctgatcgacctgcgtaagctctatgacaagggcctggtgccccggccgcgtctgctggccctggagcgcgagcaggccccgctgtcgggctcgatcggccgtctgaccgcagaccgctccaaggccgtccagggcgcctctgac
acccagctcaaggttcgccagatcaagcaggagttcttcgagcaggtcagccagagcatcaccgagacccgggttcgcctggccgaggtgaccgagaaggaggtcgtcgcctccgacgcccagaagcggatcaagatcgtgtcgcccgtcaacggcacggcgcagaacctgcgcttcttcaccgagggcgctgtcgttcgcgccgccgagccgctggtcgacatcgcgcccgaggacgaggccttcgtgatccaggcgcatttccagccgaccgatgtggacaatgtccatatgggcatggtcaccgaagttcggctgccggccttccactcgcgggaaatcccgatcctgaacggcacgatccagtcgctgtcgcaggaccgcatttccgatccgcagaacaagctcgactacttcctcgggatcgtgcgcgtggacgtcaagcagctgccgccgcatctgcgcggcagggtcaccgccggcatgccggcccaggtgatcgtgccgaccggcgagcgcaccgtgctgcagtacctgttctcgccgctgcgagacaccctgcgcaccacgatgcgcgaggagtag<210>6<211>1584<212>DNA<213>新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)<223>rsaFa基因片段<400>6atgcgagtgctgtcgaaagttctgtccgtgcgaacgtctctgatcgccttggccatggccatggcggtcgtcggtcgcgctgatctcgcccacgccgagaccttggccgaggcgatcaccgcagcctatcagagcaatccgaatattcaggcccaacgcgccgccatgcgcgcgctggacgagaactacacccaggcccgttcggcctatgggctgcaagccagcgcctcggtcgctgaggtctatggctggtccaagggcgtcaacgccaagaacggcgtcgaggccgccagccagacctcgaccctctctctgagccagagcctctacaccaacggtcgtttctcggcccgcctggcgggtgtcgaggcgcagatcaaggccgcgcgcgagaacctgcgccgcatcgagatggacctgctggtccgcgtgaccaacgcctatatctcggtgcgccgcgaccgcgagatcctgcggatcagccaaggcggtgaagcctggctgcagaagcaattgaaggacaccgaggacaagtacagcgtccgtcaggtgaccttgaccgacgtgcagcaggccaaggcccgcctggcgtcggccagcactcaggtggcgaacgcccaggcgcagctgaatgtcagcgtagcgttctacgcgtccctggtggggcgccagccggagacgctgaagcctgaacccgatattgacggcctgcctacaaccctcgacgaggcgttcaatcaggccgaacaagccaatccggtcctgctggcggcgggctacaccgagaaggcctctcgcgccggcgtcgccgaggcgcgggcccagcgcctgttctcggtcggcgcgcgcgcggactatcgcaatggctccagcacgccgtactacgcgcgtggcggtctgcgcgaggacaccgtcaacgcctcgatcaccctgacccagccgctgttcaccagcggtcagctgaacgcctcggtgcggcagtcgatcgaggagaacaaccgcgacaagctgctgatggaagacgcacgtcgcagcatggtcctgagcgtctcgcagtactgggacagcctggtggccgcgcggaagtcgctggtcagcctcgaagaggaaatgaaggccaacacgatcgccttctatggggtgcgcgaagaagagcgtttcgcgcttcgcagcacgatcgaagtgctgaacgcccaagccgaattgcagaacgcccagatcaatttcgtccgcgggcgcgccaacgagtatgtcggtcggctccatcttctggcgcaggtcggcacgcttgaggtcggcaatctcgctcccggcgtccagccctacgatcctgagcgtaacttcaggaaggtccggtaccgcggcgctttgccgacggagctgatcatcggaaccttcgacaagatcgccttgccgctcgagcccaagaagccggcgccgggggacacctcgccgatccggccgccgtcgagcgaactgccggccaggcctgtttcggccgacaaggtgacgccgccggcgtcgatgaacgatctgcccgccctgaccgacgacacgccggtccagaccgcgccccgcaactag<210>7<211>1452<212>DNA<213>新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)<223>rsaFb基因片段
<400>7atgttgatgtcgaaccgtcgacgggccgggttgctggccgccgcttgcagcgctggtcttctggccgggtccttctccatcgcgaacgccgagactctcgccgatgcgatcgcgctcgcctatcagaccaatccgacgctgcagcaacagcgcgccagcgcccgcatcaccgacgaaggcgtggtgcaagccaagaccggcttccgcccgaccgtgggcgccaccgccgatatcacgggggcgaacaccaatccggccagcgccggcgcggatgtgaagctctctggcagcagcgcggcgctttcgatcatccagccgctctacaccggcggtcgcgccagcgcgggcgtcagcgccgctgaagccgacgtgctgtctgcgcgggaaggtcttcgcgcggtcgagcagggggtgctggtcagcgtcgtccaggcctatgtcgacgtgcgccgagaccaggaacgcctgcgcatcgccaaggaaaacgtcgcggttctgcagcgccagctcgaagaatcgaacgctcgcttcgacgtgggtgagatcacccggacggacgtcgcccagtctcaggcgcgcttggcttcggccaaggccagcctgtcgggcgcccaggcccagttggaagtcagccgcgcctcctacgctgcggtggtcggtcaaacgcccggcgaactggctcccgagccgagcttggccggactgctgcccgccagcgtcgaccaggctttcgaggccgcccagacgaacaatcctggcgtgacctcggcgaagttcaatgaagaggcggccgccgcgcgtgtcgccgtcgccaaggcgggctatcgaccgacggtctcggcgcgcgcttcgctgggttacgatgcgacgcgtcgttctggcgtcggcagccagtttgacgactattcgcgcaccgtttcgggcgcgatcacggcctcgatcccgcttttcgccggcggcttgaccacgtcgcaggtccgggcggccaatgaacgtgagagcgctgcgcgcagcgccgtcgaaggcgccaagcgcaccgcgatccagcaagtctcgaacgcgtggagcaatctgctggcgtcgcgcgccggtctggtcgccaacgaggagcaggttcgagcgacccgcatcgctttcgaaggcgtgcgtcaggagcaacaggtcggcctgcggacgacgctggacgttctgaacgcccagctggagctgtccaacgccgaactggcgctggtttcggcccgtcgcgacgaatacctggcttccgccgtggtcttgcaggccatgggccaactggaggtgaccaagctcgcctccaacaccgccgcctatgacccgaaaacctcctacaaccgcgtgacgcgcggcgtgggctgggtgccgtgggagccggtggtgcaggcgatcgacagcgtcggcgcggcttccaccaagcccccgagcggctcgaaatag<210>8<211>56<212>DNA<213>大肠杆菌(E.coli)<223>T5启动子序列<400>8GAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAA<210>9<211>56<212>DNA<213>人工序列<223>寡核苷酸合成的T5启动子序列PT5<400>9GAAATCATAAAAAATTTATTTGCTATCCGCTCATGATAGAATTATAATAGATTCAA<210>10
<211>71<212>DNA<213>大肠杆菌(E.coli)<223>β-内酰胺酶基因启动子序列<400>10CGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTG<210>11<211>44<212>DNA<213>人工序列<223>寡核苷酸合成的Epsilon-SD序列<400>11TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATCATATG<210>12<211>300<212>DNA<213>大肠杆菌(E.coli)<223>rrnBT1终止子序列<400>12AATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGG<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>扩增rrnBT1终止子序列的上游引物
<400>13TAAACGCCTGGGGTAATGA<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>扩增rrnBT1终止子序列的下游引物<400>14GTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCA<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<223>扩增rsaAs序列的上游引物<400>15GCCTTCGGCGCTGCGGTCACCCTGGGC<210>16<211>32<212>DNA<213>人工序列<223>扩增rsaAs序列的下游引物<400>16GCGATCCTCGCCTAGGCGAGGATCAGACGTTC<210>17<211>26<212>DNA
<213>人工序列<223>扩增rsaD序列的上游引物<400>17GCTACGCGCTGGCCGGCCTTGCCTAG<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<223>扩增rsaD序列的下游引物<400>18TTACTGGACGCGCTGCAACGGCGCGGG<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<223>扩增rsaE序列的上游引物<400>19ATGTTCAAGCGCAGCGGCGCGAAGCCGACG<210>20<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>扩增rsaE序列的下游引物<400>20CTACTCCTAGCGCATCGTGGTGCGCAGG<210>21<211>36
<212>DNA<213>人工序列<223>扩增rsaFa序列的上游引物<400>21GCTAGCATGCGAGTGCTGTCGAAAGTTCTGTCCGTG<210>22<211>35<212>DNA<213>人工序列<223>扩增rsaFa序列的下游引物<400>22TCTAGAAATTCAGCTCCGTCGGCAAAGCGCCGCGG<210>23<211>31<212>DNA<213>人工序列<223>扩增rsaFb序列的上游引物<400>23TCTAGAATGTTGATGTCGAACCGTCGACGGG<210>24<211>33<212>DNA<213>人工序列<223>扩增rsaFb序列的下游引物<400>24AAGCTTAATCTATTTCGAGCCGCTCGGGGGCTT
权利要求
1.一种胞外分泌型表达系统pES2c，其特征在于重组rsa操纵子表达载体pQE30-rsaAs-PT5-rsaD-rsaE和OMP表达载体pBIOEx-PT5-rsaFaFb共转化至宿主菌，组成胞外分泌型表达载体系统。
2.根据权利要求1所述的胞外分泌型表达系统pES2c，其特征在于重组rsa操纵子表达载体+pQE30-rsaAs-PT5-rsaD-rsaE由rsaAs与rsaD及rsaE构建在pQE30载体上形成。
3.根据权利要求2所述的胞外分泌型表达系统pES2c，其序列特征在于rsaAs与rsaD及rsaE基因顺式串联，将所述基因与PT5、Epsilon-SD和rrnBT1三种调控序列片段一起克隆至载体pQE30的多克隆位点中，插入片段顺序为GFP-rsaAs-PT5-ESD-rsaD-ESD-rsaE-rrnBT1，使绿色荧光蛋白GFP基因片段与pQE30载体所带的组氨酸标签同框融合，并处于pQE30载体原有的诱导型T5启动子下游。
4.根据权利要求1所述的胞外分泌型表达系统pES2c，其特征在于OMP表达载体pBIOEx-PT5-rsaFaFb由rsaFa和rsaFb基因构建在相容质粒pBIOEx上形成。
5.根据权利要求4所述的胞外分泌型表达系统pES2c，其序列特征在于rsaFa和rsaFb基因顺式串联，将所述基因与权利要求4所述的三种调控序列片段一起克隆至相容质粒载体pBIOEx的多克隆位点中，插入片段顺序为rrnBT1-PT5-ESD-rsaFa-ESD-rsaFb-rrnBT1。
6.制备如权利要求1～5任一所述的胞外分泌型表达系统pES2c的方法，其特征在于包括以下步骤(1)选择新月柄杆菌RsaA分泌系统作为目标重组蛋白向胞外递送的有效运输工具；(2)将三种调控序列片段分别克隆至pAcGFP质粒载体；(3)将RsaA分泌系统功能基因片段rsaAs、rsaD、rsaE、rsaFa和rsaFb分别克隆至pAcGFP质粒载体；(4)根据权利要求4和权利要求5所述的胞外分泌表达载体序列特征，分别构建pQE30-GFP-rsaAs-PT5-rsaD-rsaE和pBIOEx-PT5-rsaFaFb重组质粒并共转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)中。
全文摘要
本发明公开了一种胞外分泌型表达系统pES2c及其制备方法。本发明利用DNA操作技术，获得所需的RsaA分泌系统功能基因及调控序列，基于相容质粒pQE30/pBIOEx，按照RsaA分泌系统功能基因的野生型组织方式安排其在表达载体上的位置，构建了原核胞外分泌型表达载体系统pES2c。本发明载体系统pES2c在大肠杆菌等常用宿主菌中表达时，能够呈现完整的有功能的RsaA分泌机器，可以提高重组蛋白表达的有效产率和生物利用度，有高活性、高产量、低成本、操作简便易控的优点。
文档编号C12N15/65GK1873000SQ20061005414
公开日2006年12月6日 申请日期2006年3月16日 优先权日2006年3月16日
发明者邹全明, 宁亚蕾, 周立雄, 毛旭虎, 郭刚, 杨珺, 肖洁, 张卫军 申请人:中国人民解放军第三军医大学