专利名称：萝芙木1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测样品中是否存在萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
本发明的萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
利用本发明的萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶，通过各种常规筛选方法，可筛选出与萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。
本发明在提高萝芙木萜类吲哚生物碱含量上具有明显的作用。提高生物碱的产量，以满足全世界对利血平等药物的巨大需求。因此，本发明具有很大的应用价值。
具体实施例方式 下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因的克隆 1.组织分离(Isolation) 萝芙木(品种为“云南萝芙木”)从重庆南山采集，将种子播种于温室中，待萝芙木苗长至10cm高时，准备抽取DNA或RNA。
2.RNA的分离(RNA isolation) 取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA) 根据各种植物的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因的核苷酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(Clontech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行 (1)核心片断的克隆 PCR[BP001(5’-ACYGGYTCHATWGGVACWCAGAC-3’)+BP002(5’-TTCTCRTTDGCDGCRCTNAGRACTCC-3’)]得到2002BP(947bp)的核心片断，回收后连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知长春花的DXR基因的同源性很高，故初步认为它是一个1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因的片段。
(2)3’-RACE PCR[AP+BP003(5’-CAGATAACATCAAGTACCCATCC-3’)]得到2002BP 3’端序列(490bp)，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与长春花的DXR基因的同源性很高，故初步认为它是一个1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因。
(3).5’-RACE 第一轮PCR[AAP+BP004(5’-CATTTCTGACAGCAACTAACTGAGG-3’)] 第二轮PCR[(AUAP+BP005(5’-CCAGCTGCAAGTGCAACAACTCTAAA-3’)]得到2002BP 5’端序列(506bp)，(过程同(1))。
将测序结果的重叠区拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增DXR编码区(BP006F 1(ATGGCTTTGAATTTGCTGTC-3’)+BP007R1(5’-TCATACAAGGGCAGGGCTCA-3’))得到DXR的编码区(1425bp)。
BLAST的结果证明从萝芙木中新得到的基因确为一个1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因。由于已知的同源1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因具有将1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸转化成甲基-D-赤藓醇-2-磷酸(MEP)的功能，故推测此基因具有相同的功能。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的全长编码序列。在拼接得到全长(包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物BP008F15’-AATCTCAATTCTTTCGGAGA-3’为正向引物，BP009R15’-GATGATCAATATAGATGCTCATA-3’为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，F1/R2的PCR条件为94℃预变性2min；然后94变性45s、50退火45s、72延伸2min；30个循环；最后72延伸8min；电泳检测PCR产物，获得扩增片断长度为1733bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆，测序，获得SEQ ID NO.1所示的序列。
实施例2 萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因序列信息与同源性分析 本发明新的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因序列全长cDNA的长度为1796bp(包括171bp 5端非编码区、1425bp编码区和包括200bp的3端非编码区)，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于172-1596位核苷酸(1425个核苷酸)。根据全长cDNA推导出萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶氨基酸序列，共475个氨基酸残基，分子量为51.46kDa，等电点(pI)为5.88。详细序列见SEQ ID NO.1。
将萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因相关的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与长春花1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因序列在核苷酸水平上具有92％的相同性；在氨基酸水平上，它与长春花DXR在蛋白水平上具有93％的相同性(附表3)。由此可见，萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因与长春花1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶在MEP途径上也具有相似的作用。
实施例3 萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白或多肽在萝芙木中进行真核细胞表达及转基因植株的TIAs含量检测 含目的基因的表达载体的构建，根据萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因编码序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因cDNA克隆至中间载体(如pGEM T-ease)，进一步克隆到双元表达载体(如改进的pCAMBIA1304)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入发根农杆菌中，利用叶盘法技术转化萝芙木。
1.发苗采取萝芙木成熟的种子，用0.1％(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡5分钟，用无菌水冲洗6次；将萝芙木种子接种在种子萌发培养基上(培养基盛于150ml的三角瓶中，于121℃灭菌20分钟)，该培养基配方为MS基本培养基，添加30g/L蔗糖，调节培养基pH值为5.8，再添加5％琼脂粉。在光照培养箱中培养萝芙木的幼芽，培养条件为25℃，黑暗条件下培养。待种子萌动后，改变培养条件为25℃，12小时光照，光照强度为25μmol.m-2.s-1。等到植株片长到3cm高时时可用于遗传转化。
2.转化共培养将萝芙木无菌苗的幼嫩叶片用小刀片削成约1cm2放入事先培养好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分钟。接着取出放入共培养基暗培养2天。
3.除菌培养共培养结束后，将外植体放入除菌培养基培养。4周继代一次。待除菌培养结束后，转入抗性筛选培养基进行转基因毛状根初步筛选。
除菌培养基MS+cb(头孢菌素)(250mg/l) 筛选培养基MS+hygr(潮霉素)(30mg/l) 4.毛状根的离体培养当毛状根长至大约4cm长时切下，在不含任何植物激素的MS培养基上于25±1.0℃无光照的恒温培养箱中继代培养。每三周继代一次，经过几次继代培养后可进行液体发酵培养，以进一步进行分子检测。
5.转基因萝芙木的分子检测 毛状根DNA的提取和纯化均参照分子克隆实验指南(Sambrook，J.et al 1993)根据Furner等的Ri质粒基因序列分析设计rolB、rolC基因的特异性引物。rolB基因的一对引物为5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’和5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’。rolC基因的一对引物为5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’和5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’。rolB、rolC基因的片段大小分别423bp和626bp。
由于萝芙木中含有1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因，所以在对转1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因的毛状根克隆时不能检测直接DXR基因，而检测植物表达载体上的潮霉素(hygr)抗性基因，潮霉素抗性基因(812bp)的检测使用引物fhygr(5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’)和rhygr(5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG-3’，退火温度，58℃)。
PCR结果表明所获得的根为毛状根，对潮霉素抗性基因的检测表明萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因已经成功整合到萝芙木基因组。
6.1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因在萝芙木毛状根中的northern blot分析 1).RNA的提取利用TRIzol试剂盒(GIBCO BRL，USA)提取并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)提取萝芙木转基因毛状根各个单克隆的RNA。
2).RNA的定量参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD260；RNA含量计算1OD260＝40μg/ml。
3).总RNA琼脂糖凝胶电泳分离1)取6ml 25*(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2ul 10*上样缓冲液，混匀。7)在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。
4).RNA尼龙膜上转移1)转移之前，将尼龙膜用10*SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2*SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃烘烤2小时。
5).膜上杂交信号的检出1)将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA]，65℃下预杂交2小时。2)将用Gene ImagesTM Contents CDP-StarTM labelling module标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入1)的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。4)用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。
Northern blot结果表明转萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因的毛状根中1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因转录水平比空白毛状根的明显偏高。
7.转1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因的毛状根中利血平的HPLC分析 生物碱的提取取萝芙木的毛状根，在烘箱里50度恒温干燥5-6个小时至恒重，取1.0g发根研磨成细粉，水润湿，用超声波在20ml甲醇中抽提3次，每次15min，提取液浓缩后用5％冰乙酸提取，提取液用石油醚洗涤，而后用氯仿提取，将氯仿提取液浓缩蒸干，得到粗制的生物碱。用流动相溶解，定容至1mL，用0.122μm微孔滤膜过滤后，可用于HPLC分析。
高压液相检测标准品的制备精密量取利血平标准品1mg，用流动相溶解成1mg/ml母液。从母液配成50，40，30，20，10mg/ml的浓度梯度，HPLC分析，根据标准品的浓度和峰面积绘制标准曲线. 高压液相检测条件色谱柱为C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相0.5％(v/v)三乙胺-水∶乙腈(50∶50)，流速1.0mL.min-1，柱温室温。检测波长268nm。利血平大约在22min处出峰。
HPLC结果表明转萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因的毛状根中利血平的含量比空白毛状根的明显偏高。
序列表
<110>西南大学
<120>萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因序列
<140>
<141>
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1796
<212>DNA
<213>萝芙木(Rauvolfia verticillata)
AATCTCAATT CTTTCGGAGA AAGAGTTTTC TAACGTAAGA ATTTGCTTTT GCGAAGTGTA 60
AGGGCCAAAG GGTTCGTTTG TTTTGTTTTC AATCTTGCAA AAAGAGGGAA TCTTGCAAGC 120
TTCATTTGAA GCGGGTTACT CTGTGTGTGT TTTCTGAGCG GTGGAAGTGA T ATG GCT 177
Met Ala
1
TTG AAT TTG CTG TCC CCG ACT GAA ATC AAG ACT ATT TCG TTC TTG GAT 225
Leu Asn Leu Leu Ser Pro Thr Glu Ile Lys Thr Ile Ser Phe Leu Asp
5 10 15
TCC TCC AAG TCG AAT TAT AAT CTT AAT CTT CTC AAG CTT CAA GGA GGA 273
Ser Ser Lys Ser Asn Tyr Asn Leu Asn Leu Leu Lys Leu Gln Gly Gly
20 25 30
TTT GCT TTC AAG AAG AAA GAT TGT GGA GCA ACT GTT GGA AAG AAA ATT 321
Phe Ala Phe Lys Lys Lys Asp Cys Gly Ala Thr Val Gly Lys Lys Ile
35 40 45 50
CAA TGT TCA GTA CAG CCA CCT CCA CCA GCA TGG CCA GGG AGG GCT GTG 369
Gln Cys Ser Val Gln Pro Pro Pro Pro Ala Trp Pro Gly Arg Ala Val
55 60 65
GCA GAA CCA GGT TAT AAG ACT TGG GAA GGT CAA AAG CCC ATT TCA ATA 417
Ala Glu Pro Gly Tyr Lys Thr Trp Glu Gly Gln Lys Pro Ile Ser Ile
70 75 80
GTT GGA TCT ACA GGC TCC ATT GGA ACT CAG ACA CTG GAC ATA GTT GCT 465
Val Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Thr Gln Thr Leu Asp Ile Val Ala
85 90 95
GAA AAT CCA GAC AAA TTT AGA GTT GTT GCA CTT GCA GCT GGT TCA AAC 513
Glu Asn Pro Asp Lys Phe Arg Val Val Ala Leu Ala Ala Gly Ser Asn
100 105 110
GTG ACT CTT CTT GCT GAT CAG GTT AAA ACA TTC AAA CCT CAG TTA GTT 561
Val Thr Leu Leu Ala Asp Gln Val Lys Thr Phe Lys Pro Gln Leu Val
115 120 125 130
GCT GTC AGA AAT GAA TCG TTG GTT GAT GAA CTC AAA GAG GCT TTA TCT 609
Ala Val Arg Asn Glu Ser Leu Val Asp Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser
135 140 145
GAT GTT GAA GAC AAA CCT GAG ATC ATT CCT GGA GAA CAA GGT GTT GTT 657
Asp Val Glu Asp Lys Pro Glu Ile Ile Pro Gly Glu Gln Gly Val Val
150 155 160
GAG GTT GCC CGC CAT CCA GAT GCT GTC ACT GTT GTT ACT GGA ATA GTT 705
Glu Val Ala Arg His Pro Asp Ala Val Thr Val Val Thr Gly Ile Val
165 170 175
GGC TGT GCA GGT CTT AAG CCT ACA GTT GCT GCC ATA GAA GCC GGA AAA 753
Gly Cys Ala Gly Leu Lys Pro Thr Val Ala Ala Ile Glu Ala Gly Lys
180 185 190
AAC ATT GTT TTG GCC AAT AAA GAG ACA CTA ATT GCT GGT GGT CCC TTT 801
Asn Ile Val Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu Ile Ala Gly Gly Pro Phe
195 200 205 210
GTA CTT CCT CTT GCA CAC AAG CAT AAA GTG AAG ATT CTT CCT GCT GAT 849
Val Leu Pro Leu Ala His Lys His Lys Val Lys Ile Leu Pro Ala Asp
215 220 225
TCA GAA CAT TCT GCT ATA TTC CAG TGT ATC CAA GGC TTG CCA GAG GGT 897
Ser Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys Ile Gln Gly Leu Pro Glu Gly
230 235 240
GCT CTA AGG CGC GTA ATT TTA ACA GCT TCT GGA GGT GCT TTC AGG GAT 945
Ala Leu Arg Arg Val Ile Leu Thr Ala Ser Gly Gly Ala Phe Arg Asp
245 250 255
TGG CCA GTT GAG AAA TTG AAG GAA GTT AAA GTA GCG GAT GCT TTG AAG 993
Trp Pro Val Glu Lys Leu Lys Glu Val Lys Val Ala Asp Ala Leu Lys
260 265 270
CAT CCC AAC TGG AAT ATG GGA AAG AAG ATT ACT GTG GAT TCT GCT ACT 1041
His Pro Asn Trp Asn Met Gly Lys Lys Ile Thr Val Asp Ser Ala Thr
275 280 285 290
CTC TTC AAT AAG GGT CTA GAA GTT ATT GAG GCC CAC TAC CTT TTT GGC 1089
Leu Phe Asn LVs Gly Leu Glu Val Ile Glu Ala His Tyr Leu Phe Gly
295 300 305
GCT GAA TAT GAC AAC ATT GAC ATA GTC ATT CAT CCC CAA TCT ATC ATA 1137
Ala Glu Tyr Asp Asn Ile Asp Ile Val Ile His Pro Gln Ser Ile Ile
310 315 320
CAC TCA ATG GTT GAA ACA CAG GAT TCA TCT GTC TTG GCA CAA TTG GGG 1185
His Ser Met Val Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val Leu Ala Gln Leu Gly
325 330 335
TGG CCT GAT ATG CGT TTG CCT ATT CTT TAT ACT CCA TCC TGG CCT GAC 1233
Trp Pro Asp Met Arg Leu Pro Ile Leu Tyr Thr Pro Ser Trp Pro Asp
340 345 350
AGA ATT TAC TGT TCT GAG ATA ACT TGG CCC CGC CTT GAT CTT TGC AAG 1281
Arg Ile Tyr Cys Ser Glu Ile Thr Trp Pro Arg Leu Asp Leu Cys Lys
355 360 365 370
CTT GGG TCT CTG ACA TTT AAA GCC CCA GAT AAC ATC AAG TAC CCA TCC 1329
Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Ala Pro Asp Asn Ile Lys Tyr Pro Ser
375 380 385
ATG GAA TTG GCA TAT GCT GCT GGT CGA GCA GGA GGG ACG ATG ACC GGA 1377
Met Glu Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Arg Ala Gly Gly Thr Met Thr Gly
390 395 400
GTT CTT AGT GCA GCA AAT GAG AAG GCA GTT GAG TTG TTT ATC AAT GAA 1425
Val Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu Leu Phe Ile Asn Glu
405 410 415
AAA ATT AGC TAT TTG GAC ATT TTC AAG GTG GTT GAG CTG ACA TGC GAG 1473
Lys Ile Ser Tyr Leu Asp Ile Phe Lys Val Val Glu Leu Thr Cys Glu
420 425 430
AAG CAT CAA GCA GAA CTG GTA ACC TCA CCA TCC CTC GAG GAA ATT ATA 1521
Lys His Gln Ala Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser Leu Glu Glu Ile Ile
435 440 445 450
CAT TAC GAC TTG TGG TCT AGG GAC TAT GCT GCC GGT GTG CAA GGC ACT 1569
His Tyr Asp Leu Trp Ser Arg Asp Tyr Ala Ala Gly Val Gln Gly Thr
455 460 465
CTC GGT TTG AGC CCT GCC CTT GTA TGA CGATGAACAA TATCATCCAT 1616
Leu Gly Leu Ser Pro Ala Leu Val ***
470 474
CGGTCTTCTT TGTACTGTCA CATCTTTGCC TAAATTTGAG CAGATGGGTG ATGGGGCTGC 1676
AATGCAATTG TATCACATTC AAGAGAATGA AATATATGAG CATCTATATT GATCATCAAA 1736
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAGAAAA AAAAAAAAAA 1796
<210>2
<211>474
<212>PRT
<213>萝芙木(Rauvolfia verticillata)
<400>2
Met Ala Leu Asn Leu Leu Ser Pro Thr Glu Ile Lys Thr Ile Ser Phe
1 5 10 15
Leu Asp Ser Ser Lys Ser Asn Tyr Asn Leu Asn Leu Leu Lys Leu Gln
20 25 30
Gly Gly Phe Ala Phe Lys Lys Lys Asp Cys Gly Ala Thr Val Gly Lys
35 40 45
Lys Ile Gln Cys Ser Val Gln Pro Pro Pro Pro Ala Trp Pro Gly Arg
50 55 60
Ala Val Ala Glu Pro Gly Tyr Lys Thr Trp Glu Gly Gln Lys Pro Ile
65 70 75 80
Ser Ile Val Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Thr Gln Thr Leu Asp Ile
85 90 95
Val Ala Glu Asn Pro Asp Lys Phe Arg Val Val Ala Leu Ala Ala Gly
100 105 110
Ser Asn Val Thr Leu Leu Ala Asp Gln Val Lys Thr Phe Lys Pro Gln
115 120 125
Leu Val Ala Val Arg Asn Glu Ser Leu Val Asp Glu Leu Lys Glu Ala
130 135 140
Leu Ser Asp Val Glu Asp Lys Pro Glu Ile Ile Pro Gly Glu Gln Gly
145 150 155 160
Val Val Glu Val Ala Arg His Pro Asp Ala Val Thr Val Val Thr Gly
165 170 175
Ile Val Gly Cys Ala Gly Leu Lys Pro Thr Val Ala Ala Ile Glu Ala
180 185 190
Gly Lys Asn Ile Val Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu Ile Ala Gly Gly
195 200 205
Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala His Lys His Lys Val Lys Ile Leu Pro
210 215 220
Ala Asp Ser Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys Ile Gln Gly Leu Pro
225 230 235 240
Glu Gly Ala Leu Arg Arg Val Ile Leu Thr Ala Ser Gly Gly Ala Phe
245 250 255
Arg Asp Trp Pro Val Glu Lys Leu Lys Glu Val Lys Val Ala Asp Ala
260 265 270
Leu Lys His Pro Asn Trp Asn Met Gly Lys Lys Ile Thr Val Asp Ser
275 280 285
Ala Thr Leu Phe Asn Lys Gly Leu Glu Val Ile Glu Ala His Tyr Leu
290 295 300
Phe Gly Ala Glu Tyr Asp Asn Ile Asp Ile Val Ile His Pro Gln Ser
305 310 315 320
Ile Ile His Ser Met Val Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val Leu Ala Gln
325 330 335
Leu Gly Trp Pro Asp Met Arg Leu Pro Ile Leu Tyr Thr Pro Ser Trp
340 345 350
Pro Asp Arg Ile Tyr Cys Ser Glu Ile Thr Trp Pro Arg Leu Asp Leu
355 360 365
Cys Lys Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Ala Pro Asp Asn Ile Lys Tyr
370 375 380
Pro Ser Met Glu Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Arg Ala Gly Gly Thr Met
385 390 395 400
Thr Gly Val Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu Leu Phe Ile
405 410 415
Asn Glu Lys Ile Ser Tyr Leu Asp Ile Phe Lys Val Val Glu Leu Thr
420 425 430
Cys Glu Lys His Gln Ala Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser Leu Glu Glu
435 440 445
Ile Ile His Tyr Asp Leu Trp Ser Arg Asp Tyr Ala Ala Gly Val Gln
450 455 460
Gly Thr Leu Gly Leu Ser Pro Ala Leu Val ***
465 470 47权利要求
1.一种萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列，其特征在于，包括编码具有1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第172-1596位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第172-1596位的核苷酸序列杂交。
2.根据权利要求1所述的萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列，其特征是，所述的序列编码具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列，其特征是，该序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第172-1596位的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列，其特征是，包含DNA分子中8-100个连续核苷酸。
5.根据权利要求4所述的萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列，其特征是，DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。
全文摘要
一种萝芙木1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶蛋白编码序列，属于基因工程领域。包括编码具有1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第172-1596位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第172-1596位的核苷酸序列杂交。本发明对提高利血平等萜类吲哚生物碱含量具有明显的作用，本发明具有很大的应用价值。
文档编号C12N15/61GK101182528SQ20061005459
公开日2008年5月21日 申请日期2006年11月14日 优先权日2006年11月14日
发明者廖志华, 敏 陈, 容 谌 申请人:西南大学