专利名称：检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的方法
技术领域：
本发明涉及一种原发性高血压相关性基因及其检测方法和用途。更具体地说，本发明涉及与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的检测方法及用途，例如在制备诊断原发性高血压的试剂或判断患原发性高血压病相对危险性的试剂中的用途。本发明还涉及检测原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的试剂盒。
背景技术：
组织激肽释放酶基因英文名称为kallikrein 1，renal/pancreas/salivary(缩写KLK1)，其蛋白产物组织激肽释放酶。KLK1基因1988年克隆定位于人染色体19q13.3，长约5kb，包括5个外显子。
激肽释放酶是一组存在于不同组织和体液中的丝氨酸蛋白酶，包括血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶。组织激肽释放酶广泛存在于肾、胰腺、胃肠道粘膜及中枢神经系统等许多组织中，它以激肽释放酶原的形式在组织中合成，再经胰蛋白酶激活形成组织激肽释放酶，并可释放至血液循环。组织激肽释放酶作用于激肽原，使之释放生成活性产物胰激肽，并可进入血浆，经氨基肽酶水解生成缓激肽。具有血管活性的缓激肽与靶器官上特定受体结合能升高一氧化氮(NO)、前列环素、EDHF(内皮衍生超极化因子)和tPA，产生扩张血管、降低血压、抗增殖、抗氧化应激等一系列生物效应。激肽的产生主要取决于激肽释放酶的活性和数量。
缓激肽和胰激肽是体内最强的血管舒张物质之一。静脉注射缓激肽可引起全身小动脉舒张，显著降低外周血管循环阻力，血管通透性增强，从而引起血压下降。缓激肽还具有强大的利尿钠效应，可使肾脏血流量增多，肾小管周围毛细血管压增高，抑制肾小管再吸收，并通过刺激入球小动脉压力感受器及致密斑而产生利尿钠作用。另一方面，缓激肽可抑制远端肾小管对钠和水重吸收及抑制抗利尿激素的作用，从而促进水钠排泄。
在部分原发性高血压患者和自发性高血压大鼠，尿中激肽释放酶的水平都显著降低。流行病学研究也发现，黑人尿中激肽释放酶水平较白人低，黑人高血压的发病率也较白人高。在原发性高血压和肾性高血压患者，血管对缓激肽的降压反应明显增强，从而提示缺乏内源性激肽。另有研究报道，血管紧张素转换酶抑制剂的抗高血压作用，与体内激肽水平增高有关。因为同时应用激肽抗体，其降压作用便明显削弱。在低肾素型原发性高血压应用血管紧张素转换酶抑制剂后，肾脏激肽释放酶-激肽系统活性增加，同时肾脏血流量增加，有报道认为其降压作用主要是由于增加了血浆激肽水平。因此，原发性高血压可能与组织激肽释放酶系统性低下有关。
分子遗传学研究发现，单核苷酸多态(single nucleotidepolymorphism，SNP)可以修饰单个基因的功能，导致确定的高血压表型。由此推测，DNA上的碱基突变可能改变特定基因的表达或其编码蛋白的功能。研究显示，在自发性高血压大鼠模型中，KLK1基因多态与血压调节有关。转基因动物过表达人类KLK1基因产生低血压表型。后来，一项以57个犹他大家系为基础的研究表明，一个显性等位基因与尿中组织激肽释放酶活性增高和高血压发病危险降低有关，提示影响尿激肽释放酶分泌的一个主基因效应可以解释该性状总变异的51％。1991年Berge和Berg报道了在挪威人群发现的TaqI限制性片段长度多态和Arg53His错义突变，但是未发现TaqI多态与血压存在关联。在HYPERGENE计划中Slim等人对Arg53His多态进行研究，发现该多态杂合个体的尿组织激肽释放酶活性显著高于其他个体。Richards等和Song等在高加索人，非裔美国人和亚洲人共计108个对象中发现，KLK1基因5’区域转录起始位点前-121到-133位核苷酸之间存在一个多态区域，后来的研究发现该多态区域与高血压有关。
rs5517位于KLK1基因第4外显子，为A/G多态，可以导致第186个氨基酸赖氨酸(Lys，AAA)到谷氨酸(Glu，GAA)的改变。目前KLK1基因rs5517位点变异与原发性高血压间的关系，以及该变异的检测方法、试剂盒及其在预测预报和新药开发中的应用前景，国内外尚没有专利报道。
发明内容
本发明涉及检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的方法，该方法包括检测KLK1基因编码序列的3812位(第4个外显子的第60位碱基)的A/G多态性，其中A等位基因的分布频率与原发性高血压的患病风险率呈正相关，即等位基因A的分布频率越高，患原发性高血压的风险率越高。
本发明所述的多态性位点已被世界权威的生物医学数据库-美国国立卫生研究院(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)收录，为A/G的变异，可以导致第186个氨基酸赖氨酸(Lys，AAA)到谷氨酸(Glu，GAA)的改变。该多态位于KLK1基因的第4个外显子，外显子序列如下，其中斜体字标出的第60位为rs5517(参看图2)。此多态性位点在人类基因组上能被唯一确定，定位于基因编码的3812位。本发明所述的多态基因及其编码的蛋白分别参见序列表中的SEQID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。
多态性是指一个基因座位上存在多个等位基因。在某一个基因座位上，一个个体可以有两个等位基因。流行病学研究表明，原发性高血压与遗传因素有关，父母为正常血压者其子女患高血压的概率明显低于父母均有高血压者的概率。发明人通过选择吉林、北京、山东、陕西、贵州、福建，湖北，四川，广西等共9个省市的2411名独立的高血压个体和按年龄、性别、居住地匹配2348名独立的对照个体，取样后进行PCR扩增目标基因，并进行限制性片段长度多态性分析，其中基因型为GG者，病例组和对照组各有808和859例，基因型为AG者，病例组和对照组分别有1114例和1094例，而基因型为AA者，病例组和对照组分别有451例和364例，病例组的A等位基因频率为42.48％，对照组的A等位基因频率为39.32％，P值为0.0019，具有显著性差别。AA基因型者患高血压的概率最高，在相对于A等位基因的隐性模型下，与G等位基因携带者(AG和GG基因型者)相比，AA基因型携带者患高血压的危险为1.26倍，表明了KLK1基因rs5517多态(A/G)与原发性高血压相关。由此判断，KLK1基因rs5517多态A等位基因携带者发生原发性高血压的相对危险性显著升高，本发明的与原发性高血压相关的多态位点的发现对于高血压的诊断、预防和治疗具有重要的意义。
在一个特定实施方案中，本发明提供了检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的方法，该方法包括设计引物扩增目标基因和利用限制性片段长度多态性方法鉴定KLK1基因rs5517多态基因型，其中A等位基因的分布频率与原发性高血压患病风险呈正相关。
在本发明中使用的引物包括足够长度和适当序列的寡核苷酸，用于为靶核苷酸合成提供特异开始。该引物可以包括例如15-30个核苷酸，并且与所要扩增的核苷酸序列的每条链大致地互补，例如是5’CAGTGAAGCAGATGCCTGGT 3’，5’TCCTGCCTAATGATGAGTTC 3’。
限制性片段长度多态性是用某一种限制性内切酶切割来自不同个体的基因组DNA或某一个基因，由于多态基因型，而得到不同长度和数目的DNA片段，通过检测酶切后的DNA长度和数目的不同来确定不同多态基因型。
在另一个特定实施方案中，本发明提供了检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的方法，该方法包括设计引物扩增目标基因和采用直接测序法测定KLK1基因rs5517多态，其中A等位基因的分布频率与原发性高血压患病风险呈正相关。
在又一个特定实施方案中，本发明提供了检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的方法，该方法包括设计引物扩增目标基因和采用标记的核酸探针测定KLK1基因rs5517多态基因型，其中A等位基因的分布频率与原发性高血压患病风险呈正相关。
核酸探针可以用放射性同位素、酶、发光材料(例如荧光和磷光材料)标记。用于标记的这些放射性同位素、酶、发光材料等是本领域的技术人员所已知的，例如、但不限于32P，125I，14C，辣根过氧化物酶、荧光素等。核酸探针可以与多态基因位点为G的基因序列互补，也可以与多态基因位点为A的基因序列互补。或者，可以同时存在与多态基因位点为G的基因序列互补和与多态基因位点为A的基因序列互补的两种核酸探针。探针的长度例如可以是10-50个或更多碱基，或15-30个碱基。例如，在一个实施方案中，探针可以是与图2的核酸序列互补的核酸片段。
除了以上方法以外，还可以采用本领域技术人员已知的其它检测多态位点的方法。
本发明还提供了可用于检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的试剂盒，该试剂盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于限制性片段长度多态方法的内切酶，例如Taq I内切酶。
另外，本发明提供了可用于检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的试剂盒，该试剂盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于检测基因多态位点的标记核酸探针。
另外，本发明提供了可用于检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的试剂盒，该试剂盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于检测基因多态位点的测序试剂盒。
例如，根据一个具体的实施方案，试剂盒含有用于PCR的以下试剂引物5’CAGTGAAGCAGATGCCTGGT 3’，5’TCCTGCCTAATGATGAGTTC 3’各0.2μl(5μM)，dNTP MIX 0.4μl(10mM)，Taq酶 0.1μl(5u/μl)，PCR buffer 1.0μl(10X)，DNA模板 1.0μl(10ng/μl)；另外含有用于限制性片段长度多态方法的下列试剂Taq I buffer 1.5μl(10X)；和Taq I 0.1μl(10u/μl)。
本发明的用于检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的试剂盒的使用方法包括下列步骤A、从活体获取生物样本，通过上述PCR引物，进行PCR扩增反应；B、纯化PCR反应产物，用限制性内切酶内切PCR反应产物；C、电泳鉴定酶切DNA片段。
本发明所提出的KLK1基因rs5517多态可在人体样本比如血液、活组织中检出。本发明的方法可用来在人群中进行筛查，从而可以根据个体的KLK1基因rs5517多态基因型来判断患原发性高血压的风险率。同时，还可以采用该方法早期诊断遗传性高血压。通过检测该基因多态，对于高血压高风险个体，可以及早采取预防措施，防止高血压的发生。
原发性高血压是一种一旦患病需终生服药的顽固性疾病，目前尚无彻底的治疗手段。高血压是最常见的心血管疾病，不仅患病率高，而且可引起严重的心、脑、肾并发症，是一种对人类健康危害极大的疾病。本发明的原发性高血压基因多态位点的提出，为彻底治疗原发性高血压提供了一种新的途径。通过矫正多态基因缺陷，或者通过减少或消除缺陷KLK1基因产物，有可能达到预防或治疗高血压的目的。因此，本发明的与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的提出为开发原发性高血压基因治疗药物及基因治疗方法提供了可能。而且，本发明的基因多态位点的提出，为原发性高血压的病因提出了新的观点，深化了对原发性高血压疾病的认识。
图1示出了KLK1基因的结构示意图。
图2示出了KLK1基因的第4个外显子的基因序列，该多态位于KLK1基因的第4个外显子，其中斜体字标出的第60位为rs5517，为A/G的变异。
图3示出了基因型电泳示意图，右侧条带为Marker，即标准电泳图谱。当rs5517多态出现A等位基因时，电泳为194bp的条带，出现G等位基因时，电泳为174bp和20bp的两条带。
具体实施例方式
1、检测rs5517多态的试验样本和方法通过PCR与限制性片段长度多态性方法结合进行检测rs5517多态。
1.1试验样本的获得所有的DNA样本和临床数据均来自亚洲国际心血管病协作研究(the International Collaborative Study of Cardiovascular Disease in Asia，InterASIA)。本计划通过了当地的伦理委员会的批准，并且每一位参与者都自愿签署了知情同意书。共有15,838名有代表性的35到74岁的志愿者参加了此计划，我们从中选择了吉林、北京、山东、陕西、贵州、福建，湖北，四川，广西等共9个省市的2411名独立的高血压个体和按性别、年龄、居住地匹配2348名独立的对照个体。参加者均详细填写调查表，包括疾病个人史、家族史、吸烟与饮酒史和药物使用情况，并测量身高、体重、腰围及臀围以及血浆脂质等各项生化指标。每位志愿者的血压都由训练有素和通过认证的调查人员测量三次。所有研究对象均为汉族且无血缘关系。本次研究所选择的高血压的定义为收缩压≥150mmHg和或舒张压≥95mmHg；服用降压药但是收缩压＜150mmHg，舒张压＜95mmHg。患有继发性型高血压、冠心病和糖尿病的个体不在调查范围之内。
1.2rs5517多态扩增片段的获得通过设计的错配引物，使用ABI公司的9700PCR仪和大连宝生物工程有限公司Taq酶进行聚合酶链反应(PCR)获得rs5517多态扩增片段(194bp)。扩增引物和扩增条件见表1和表2。
表1 rs5517多态的扩增引物
表2 rs5517多态PCR扩增体系和扩增条件
1.3限制性片段长度多态性方法鉴定rs5517多态基因型含有rs5517多态的DNA片段扩增成功后，用限制性内切酶对产物进行酶切，从凝胶电泳图谱即可分辨出此位点的基因型。
用大连宝生物工程有限公司的Taq I内切酶使194bp的扩增产物在65℃酶切10h。酶切体系见表3。
表3 rs5517多态酶切体系和酶切条件
1.4琼脂糖凝胶电泳检查酶切产物在溴乙锭染色的浓度为3％的琼脂糖凝胶中电泳酶切产物，电压250伏，电泳时间为50分钟。当rs5517多态出现A等位基因时，电泳为194bp的条带，出现G等位基因时，电泳为174bp和20bp的两条带。图3示出了基因型电泳示意图，右侧条带为Marker，即标准电泳图谱。
2rs5517多态与人类原发性高血压的相关性2.1病例对照样本临床特征描述病例组和对照组的性别，年龄，吸烟率和饮酒率均无显著性差异。与对照组相比较，病例组的体重指数(BMI)，总胆固醇(CHO)，甘油三酯(TG)，血糖(Glu)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL_C)，肌酐水平(Cr)较高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL_C)水平较低，均具有显著性差异。见表4。
表4 病例对照样本临床特征描述
数值为均值±标准差2.2rs5517多态在病例对照样本中的频率分布rs5517多态三种基因型在病例和对照中分布的差异具有显著性。A等位基因在病例中的频率明显高于对照组，差异具有显著性。见表5。
表5 rs5517多态在病例对照样本中的频率分布
2.3rs5517多态与高血压的相对危险性在相对于A等位基因的隐性遗传模型(即合并GG和AG两种基因型)下，AA基因型个体发生原发性高血压的危险比G等位基因携带者显著升高。进行多变量非条件Logistic回归分析，调整年龄，性别，吸烟，饮酒，BMI，TG，CHO，Glu，Cr，HDL_C等传统危险因素后，rs5517隐性遗传模型仍然与高血压的发生保持显著关联。与G等位基因携带者相比，AA基因型携带者发生高血压的风险增加了25％，见表6。
表6 rs5517多态相对于原发性高血压的相对危险性
#为调整传统的环境危险因素后
3用于检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的试剂盒3.1引物5’CAGTGAAGCAGATGCCTGGT 3’，5’TCCTGCCTAATGATGAGTTC 3’各0.2μl(5μM)，dNTP MIX 0.4μl(10mM)，Taq酶 0.1μl(5u/μl)，PCR buffer 1.0μl(10X)，DNA模板1.0μl(10ng/μl)；3.2另外含有用于限制性片段长度多态方法的下列试剂Taq I buffer 1.5μl(10X)；和Taq I 0.1μl(10u/μl)。
3.3操作步骤3.3.1从活体获取生物样本，通过上述PCR引物，进行PCR扩增反应。
3.3.2纯化PCR反应产物，用限制性内切酶酶切PCR反应产物。
3.3.3电泳鉴定酶切DNA片段。
4用于检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的试剂盒该试剂盒包括引物5’CAGTGAAGCAGATGCCTGGT 3’，
5’TCCTGCCTAATGATGAGTTC 3’各0.2μl(5μM)，dNTP MIX 0.4μl(10mM)，Taq酶 0.1μl(5u/μl)，PCR buffer 1.0μl(10X)，DNA模板 1.0μl(10ng/μl)；操作步骤A、从活体获取生物样本，通过上述PCR引物，进行PCR扩增反应。
B、纯化PCR反应产物，对PCR反应产物直接测序。
SEQUENCE LISTING<110>北京诺赛基因组研究中心有限公司<120>检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的方法<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4640<212>DNA<213>人<400>1agttcctcca cctgctggcc cctggacacc tctgtcacca tgtggttcct ggttctgtgc 60ctcgccctgt ccctgggggg gactggtgag acagtggggg gatgtgggag ggggaacggg 120ccctgattct cttgctggcc tcacatcccc ccccgataag accttcccct ccaacacccc 180accctcatcc ctctggccca cagtctatcc tagtccgggg tgccccggct cttatctatc 240ttgcgcggcc ccaccctaaa cttccacccc cgctcctcca tgttgtcata gtgctcactc 300ccacaccaga ttcctgctcc tcccaggaag cctcagtact ttctcctctt ccctagccaa 360cgccctgtcc caccgcttta ccaaaggggc agattctggg ccatctctgt ctctctctgg 420aggaccccaa ccctcccatg ggcttccccc accccacagg actctgatca tcccctcctg 480ccccctagtt ccctgcggcc acctatttgg ctcctgagtc tacaaatccc accacactcc 540agtgactttt tccatccagc tgtccgctct caactgtgtc ctccagaccc tgacatctgg 600tctccccagt ccttccaggg tcccccaaat ttcaccagaa aaccctgctt cccaaactgg 660catgtgggat cccccatctg gtatgggggg gggtctgcaa atgtcccttc ccacccagca 720cccccagctc tcccaggaaa aacaccacac cctcccacca catgctcctt tccttgggga 780agttccatcc cgccccaggc cccagccctt ctctgcctga attgttccta cacagctctg 840gttttctgga accccacccc aaggatcctg aatgccttct cagccagcgc ttctgccctg 900gcctccccca agtcagtatg tgattctaca acctcacgtc aagtgggtcc tgcattgcat 960tcccacagct gcttggcgcc tgttctcacc acttctccaa tcctcttcct aggattgcct 1020ccaagaggac cccatatcct tccagtaccc tcagaccatg aaccccatcc ccatgagaaa 1080cgaagatccc atccttcacc ctgtccgaga aggactgcca ctcacgcctc cctcctcctg 1140agccccgtcc cagtcctgac cgcaactgtg ttctcagggc cccaacctcc cctcagattg 1200ccattcctgg ttcacaggaa ggaccccaaa acctctcgga agcccacctc tagccttaac 1260catagccctt tcttttaccc tttaaccagg aagccctgaa atctaactgt cccagccaag 1320ctggcccctt ccaaccccaa tgtagggacc ccaagtcacc cccaaactct tcagtccaga 1380tgctcttctt tacctctcag acctggttcc ctaaagctgc atcctttcct gaacctcaaa 1440agcccaaccc aggtcctgtt tccctagcct aggagcccct tagccctcca gattcttcct 1500cagtgagcct ctgatcctgt cccacccttg gcgccttgat ccctggtttc cagaatccct 1560ttccactccc ctaacccacc acctcccatc ccccagcccc agaccccaaa tgacctgacg 1620cccagatgca gtgtctgctc cagacactgt ctcctgtctc ctaccctgat ccctggaggc 1680tgctctactg tcagagcaca aaatctcccc accaggtcca gccaccactc caaaagccca 1740
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Pro Ala Asp Thr Ile Thr Asp Ala Val Lys Val Val Glu Leu Pro Thr130 135 140Glu Glu Pro Glu Val Gly Ser Thr Cys Leu Ala Ser Gly Trp Gly Ser145 150 155 160Ile Glu Pro Glu Asn Phe Ser Phe Pro Asp Asp Leu Gln Cys Val Asp165 170 175Leu Lys Ile Leu Pro Asn Asp Glu Cys Lys Lys Ala His Val Gln Lys180 185 190Val Thr Asp Phe Met Leu Cys Val Gly His Leu Glu Gly Gly Lys Asp195 200 205Thr Cys Val Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Cys Asp Gly Val Leu210 215 220Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr Val Pro Cys Gly Thr Pro Asn Lys225 230 235 240Pro Ser Val Ala Val Arg Val Leu Ser Tyr Val Lys Trp Ile Glu Asp245 250 255Thr Ile Ala Glu Asn Ser260<210>4<211>262<212>PRT<213>人<400>4Met Trp Phe Leu Val Leu Cys Leu Ala Leu Ser Leu Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Ala Ala Pro Pro Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu20 25 30Gln His Ser Gln Pro Trp Gln Ala Ala Leu Tyr His Phe Ser Thr Phe35 40 45Gln Cys Gly Gly Ile Leu Val His Arg Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala50 55 60His Cys Ile Ser Asp Asn Tyr Gln Leu Trp Leu Gly Arg His Asn Leu65 70 75 80Phe Asp Asp Glu Asn Thr Ala Gln Phe Val His ValSer Glu Ser Phe85 90 95Pro His Pro Gly Phe Asn Met Ser Leu Leu Glu Asn His Thr Arg Gln100 105 110Ala Asp Glu Asp Tyr Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Thr Glu115 120 125
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权利要求
1.检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的方法，该方法包括检测KLK1基因编码序列的3812位的A/G多态性，其中A等位基因的分布频率与原发性高血压的患病风险率呈正相关。
2.检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的方法，该方法包括设计引物扩增目标基因和利用限制性片断长度多态性方法鉴定KLK1基因rs5517多态多态基因型，其中A等位基因的分布频率与原发性高血压患病风险呈正相关。
3.如权利要求2所述的检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的方法，其中所述引物是5’CAGTGAAGCAGATGCCTGGT 3’，5’TCCTGCCTAATGATGAGTTC 3’。
4.检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的方法，该方法包括设计引物扩增目标基因和采用直接测序法测定KLK1基因rs5517多态，其中A等位基因的分布频率与原发性高血压患病风险呈正相关。
5.检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的方法，该方法包括设计引物扩增目标基因和采用标记的核酸探针测定KLK1基因rs5517多态基因型，其中A等位基因的分布频率与原发性高血压患病风险呈正相关。
6.可用于检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的试剂盒，该试剂盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于限制性片段长度多态方法的内切酶，例如Taq I内切酶。
7.可用于检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的试剂盒，该试剂盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于检测基因多态位点的标记核酸探针。
8.可用于检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的试剂盒，该试剂盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于检测基因多态位点的测序试剂盒。
9.可用于检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的试剂盒，试剂盒含有用于PCR的以下试剂引物5’CAGTGAAGCAGATGCCTGGT 3’，5’TCCTGCCTAATGATGAGTTC 3’各0.2μl(5μM)，dNTP MIX 0.4μl(10mM)，Taq酶0.1μl(5u/μl)，PCR buffer 1.0μl(10X)，DNA模板1.0μl(10ng/μl)；另外含有用于限制性片段长度多态方法的下列试剂Taq I buffer 1.5μl(10X)；和Taq I 0.1μl(10u/μl)。
10.用于检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的试剂盒的使用方法包括下列步骤A、从活体获取生物样本，通过上述PCR引物，进行PCR扩增反应；B、纯化PCR反应产物，用限制性内切酶内切PCR反应产物；C、电泳鉴定酶切DNA片段。
全文摘要
本发明涉及检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的方法，该方法包括检测KLK1基因编码序列的3812位的A/G多态性，其中A等位基因的分布频率与原发性高血压的患病风险率呈正相关。本发明还涉及检测原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101033487SQ200610056749
公开日2007年9月12日 申请日期2006年3月7日 优先权日2006年3月7日
发明者顾东风, 赵维艳, 王来元, 李宏帆, 王亚平, 陈恕凤 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院, 北京诺赛基因组研究中心有限公司