昆虫寄生菌子实体的生产方法

专利名称：：昆虫寄生菌子实体的生产方法
技术领域：
：本发明是有关快速稳定生产作为保健食品、医药品、化妆品等加以利用的冬虫夏草菌类等的昆虫寄生菌子实体(蘑菇)的方法。
背景技术：
：昆虫寄生菌的子实体，例如冬虫夏草菌类等，可以用作中药药材和高级食品材料。冬虫夏草菌类等的子实体，通常都是采摘天然生长的，所以往往数量很少，大小不等，质量也不稳定。另外，昆虫寄生菌即使是如同蛹虫草那样的同一属种，在生育速度、菌子生育和昆虫病原性等方面，也往往都有差别。因此，人们一直都在探索优良的昆虫寄生菌，研究其人工培养的方法。具体来说，有人提出过给寄主昆虫人工接种冬虫夏草菌类，在不到发育程度的低温下控制温度的同时进行饲养来生产子实体的方法(例如，参照日本专利特开平8-75号公报)。该方法是一种将蛹浸泡在冬虫夏草菌类的子囊孢子悬浮液中，进行接种的方法。还有人提出过先制备以蚕蛹组分(水萃取物)为主成分的培养基，再用该培养基生成子实体，利用子囊孢子的方法(例如，参照日本专利特开平10-42691号公报)。据此方法，利用蚕蛹作培养基，可进行冬虫夏草的连续培养。除了这些方法之外，大家知道还有一种方法是，先制备包含冬虫夏草菌类等的昆虫病原菌类菌丝段(虫菌体，hyphalbody)的接种剂，用其给昆虫接种，以该昆虫作为昆虫菌床，生成子实体的方法(例如，参照国际公开第WO01/022801号小册子)。按照该方法接种以后，可以縮短生成子实体的时间，能简便地、在短期间内高效率大量生产昆虫病原菌类的子实体。然而，在特开平8-75号公报所记载的方法中，在常温下大部分寄主昆虫都羽化了，或者显著产生细菌。按照基于悬浮液的接种感染法，在感染个体上会出现色斑，感染所需时间非常长。另一方面，如果控制在低温之下，要生成来自子囊孢子的子实体，必需1至3个月这样相当长的时间。另外，在特开平10-42691号公报以及国际公开第WO01/022801号小册子所记载的方法中，也很难生成子囊孢子，作为接种源，也很难确保稳定。也就是说，这些方法存在着如下问题冬虫夏草菌类等的昆虫寄生菌产生子实体较少，在天气干燥的年份，即便在野外都几乎看不到，很难确保能稳定生产。同时，即便在野外采摘到子实体，也很难得到有同样稳定的质量且未被细菌污染的子囊孢子。例如，即便用这种自然发生的子囊孢子做成的悬浮液，注射到昆虫例如幼虫或蛹的体内使之感染，也依然存在有特别多的被细菌腐败的个体、成品率变低、不能稳定生产子实体这样的问题。
发明内容本发明就是针对上述现有技术所存在问题而做出的。其目的在于提供一种能快速稳定生产昆虫寄生菌子实体的昆虫寄生菌子实体的生产方法。为了达到上述目的，权利要求l所记载发明的昆虫寄生菌子实体生产方法的特征在于通过弄伤昆虫表皮，在负伤部接种昆虫寄生菌，使昆虫寄生菌在昆虫体内繁殖，来生成昆虫寄生菌的子实体。权利要求2所记载发明的昆虫寄生菌子实体生产方法的特征在于在权利要求l涉及的发明中，上述昆虫寄生菌是冬虫夏草菌类。权利要求3所记载发明的昆虫寄生菌子实体生产方法的特征在于在权利要求1或2涉及的发明中，把上述昆虫寄生菌置于琼脂培养基或谷物培养基上培养，在让昆虫寄生菌的菌丝在该培养基上生成的状态下，在其上放置表皮负了伤的昆虫，接种昆虫寄生菌。权利要求4所记载发明的昆虫寄生菌子实体生产方法的特征在于在权利要求3涉及的发明中，上述昆虫寄生菌的菌丝，是遍及整个培养基上生成的。权利要求5所记载发明的昆虫寄生菌子实体生产方法的特征在于在涉及权利要求1或2的发明中，上述昆虫表皮的负伤，是控制在昆虫体液不溢出的程度下进行的。权利要求6所记载发明的昆虫寄生菌子实体生产方法的特征在于在权利要求1或2涉及的发明中，上述昆虫的形态是蛹。权利要求7所记载发明的昆虫寄生菌子实体生产方法的特征在于在涉及权利要求l的发明中，上述昆虫寄生菌在昆虫体内繁殖，使得昆虫硬化，把其表皮上生成了子实体原基的部分作为种菌，来生成子实体。权利要求8所记载发明的昆虫寄生菌子实体生产方法的特征在于在涉及权利要求7的发明中，将上述种菌配置于苔上，生成子实体。权利要求9所记载发明的昆虫寄生菌子实体生产方法的特征在于将上述种菌配置在pH24的酸性培养基上，生成子实体。权利要求10所记载发明的昆虫寄生菌子实体生产方法的特征在于将按照权利要求79中任何一项记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法所得到的子实体，粘贴在存放培养基的容器内上部，把从子实体掉落的子囊孢子作为种菌，来生成子实体。按照本发明，可能获得如下效果。按照权利要求l所记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，通过弄伤昆虫表皮，可以排除昆虫原本持有细菌等的影响，显著提高昆虫寄生菌的感染速度，在昆虫体内尽快而且容易进行昆虫寄生菌的繁殖，生成子实体。因此，可快速而且稳定地生产出昆虫寄生菌的子实体。按照权利要求2所记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，可有效发挥权利要求l涉及的有关冬虫夏草菌类发明的效果，提高其利用价值。按照权利要求3所记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，在权利要求1或2涉及的发明效果基础上，既可抑制昆虫体内生存的细菌类泄漏到体外而增加，又能抑制昆虫寄生菌的活性下降。按照权利要求4所记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，在涉及权利要求3的发明效果基础上，还能提高昆虫寄生菌的感染率。按照权利要求5所记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，在权利要求1或2涉及的发明效果基础上，还能促进昆虫体内昆虫寄生菌的感染。按照权利要求6所记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，既能最容易、最可靠地弄伤昆虫，又能提高权利要求1或2涉及的发明效果。按照权利要求7所记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，在权利要求l涉及的发明效果基础上，还能在昆虫体内繁殖昆虫寄生菌，使昆虫变成菌丝体，在昆虫的表皮生成子实体原基，再以其为种菌，生成子实体。按照权利要求8所记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，在权利要求7涉及的发明效果基础上，还能在适合于苔的湿度和温度下，使子实体的生成更容易进行。按照权利要求9所记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，在权利要求7涉及的发明效果基础上，既能抑制杂细菌的繁殖，还能抑制子实体的污染、蛹的腐败和容器内的污染，与此同时，还能避免使用抗生素、抗菌剂等。按照权利要求10所记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，在权利要求79的任何一项所涉及的发明效果基础上，还能利用子囊孢子的种菌作为下一世代生产的种菌，与此同时，可抑制昆虫寄生菌的昆虫病原性下降和繁殖力下降，进行子实体的连续性生产。具体实施方式以下详细说明本发明的最佳实施例。本实施例的昆虫寄生菌(昆虫病原菌)子实体(蘑菇)的生产方法，是将昆虫表皮弄伤(负伤)，在负伤部接种昆虫寄生菌，让昆虫寄生菌在昆虫体内繁殖，生成昆虫寄生菌的子实体。子实体主要呈棒状，在其头部和顶端附近有一个结果部，该结果部为抱着子囊孢子的袋状器官，即子囊果集结部。子实体的形态，有棍棒型、椭圆体(热水袋)型、掏耳勺型等类型。子实体的长度，以从几毫米到几厘米者居多，但也有十几厘米的。子实体的颜色，有橘黄色、白色、黄色、茶色等。作为客体的昆虫寄生菌，是在被接种到宿主(寄主、主体)昆虫时，能生成其子实体的寄生菌。能作为这种昆虫寄生菌的，可以列举属于剌束梗孢(Akanthomyces)属、球束梗孢(Gibellula)属、虫草(Cordyc印s)属、束梗孢(Stilbellaceae)属，多头束霉(Tilachlidium)属、弯颈霉(Tolypocladium)属、锥壳(Torrubiella)属、野村菌(Nomuraea)属、羽束梗孢(Paraisaria)属、层束梗孢(Hymenostilbe)属、被毛孢(Hirsutella)属、拟青霉(Paecilomyces)属、白僵菌(Beauveria)属、绿僵菌(Metarhizium)属等的菌类。因此，冬虫夏草菌类是相当于子囊菌门、麦角菌目、麦角菌科的一属(冬虫夏草属)的菌类，更具体地说，是属于麦角菌科的虫草(Cordyc印s)属，球束梗孢(Gibellula)属、锥壳(Torrubiella)属以及被毛孢(Hirsutella)属的菌类。作为冬虫夏草菌类，更具体来说，例如可以列举虫草(Cordyc印s)属的蛹虫草(Cordycepsmilitaris)、高雄山虫草(Cordycepstakaomontaiia)等。对于上述昆虫没有特别限制，但一般采用鳞翅目的昆虫和甲虫目的昆虫等。作为鳞翅目的昆虫，可以列举斜纹夜蛾(spodopteralitura)、烟草蛾、蚕蛾、小菜蛾、黄地老虎、蝙蝠蛾等。作为甲虫目的昆虫，可以列举亮绿丽金龟、天牛、叩头虫等。在此，所谓昆虫也包括幼虫、蛹、成虫等成长过程的任一形态(生态)的概念。作为弄伤昆虫表皮的方法，可以利用针，或者金属、玻璃、陶瓷等坚硬而锐利的刃具或者激光来进行。通过在昆虫负伤的部分(以下称负伤部)接种昆虫寄生菌，可以促进昆虫寄生菌的感染，使寄生菌在昆虫体内的繁殖更容易进行，而生成子实体。在此情况下，负伤应该只是弄伤昆虫的表皮，而别伤到昆虫体内。也就是说，不要弄伤到昆虫表皮破裂的程度，最好是以体液不溢出为度，不用说，更别让昆虫死去。在弄伤昆虫的情况下，具体来说，一般采取用针开孔的方法(开孔负伤法)、刃具切割法或激光照射法等。但是，即使用热烙铁灼伤也不能促进从该部分感染。例如，使用昆虫寄生菌的蛹虫草，在22t:的条件下，在PDA培养基上，单纯培养蛹虫草，使之蔓延，对非休眠态的斜纹夜蛾蛹，用尖锐小镊子弄伤过的100只个体，予以静置。其结果，7天之后所有蛹的动作都停止，12天之后，有90只个体硬化。通常，昆虫的皮肤上有一种防御寄生菌的机构，所以寄生菌很难感染，但是，如果在昆虫表皮生成了轻度负伤部，并在此接种了昆虫寄生菌，那么感染速度就会明显加快，昆虫体内寄生菌的繁殖就可能快速而且容易进行。昆虫在从前蛹蜕皮为蛹的时期，表皮变薄，在土茧中，有一个昆虫寄生菌明显容易感染的时期。另外，刚蜕皮后的白蛹的皮肤与通常的蛹相比，还更容易感染昆虫寄生菌。但是，仅仅大量采集刚蜕皮后的白蛹是很难的，况且这种蛹很软，不好处理。在本实施例中，通过对通常的蛹进行划伤来接种昆虫寄生菌，可以较好地进行寄生菌繁殖。另外，一般认为，在使昆虫感染昆虫寄生菌的情况下，最好使用休眠蛹，不过，在本实施例中，因为是将通过昆虫弄伤来接种昆虫寄生菌，使之感染的，所以感染能很快发生，适用于非休眠蛹，可以大量生产子实体。用琼脂(agar)培养基或谷物培养基培养昆虫寄生菌，在该培养基上生成昆虫寄生菌的菌丝状态下，可以在其上放置把表皮弄伤了的昆虫来接种昆虫寄生菌。在此情况下，预先在培养器中培养好足够的昆虫寄生菌，将蛹静置摆放在其中。将该培养基放入恒温器内保存数天，使之感染。作为琼脂培养基，可以列举PDA培养基(PotatoDextroseAgar,马铃薯糖琼脂培养基)等。作为谷物培养基，可以列举使用稻谷、小麦、大麦等制成的培养基。因此，通过在上述培养基上生成昆虫寄生菌的菌丝(菌丛)的状态下，特别是在菌丝蔓延的状态下，放置昆虫来进行接种，可以排除昆虫原本持有细菌等的影响，使昆虫寄生菌快速感染。其结果，可以提高昆虫寄生菌的感染几率，增加成品率。使用能让昆虫寄生菌蔓延到整个培养基的琼脂培养基或谷物培养基，其目的是为了抑制生存在昆虫体内的细菌类泄漏到体外而增加，同时防止昆虫寄生菌活性的下降。但是，在培养基上配置昆虫的情况下，昆虫的体表面最好用杀菌剂洗净。另外，昆虫寄生菌在昆虫体内繁殖，使得昆虫硬化，以其表皮上形成的子实体原基作为种菌，可以生成子实体。所谓子实体原基，是指成为子实体之根源的粒状部分(芽)。如果在负伤昆虫的负伤部接种寄生菌，寄生菌会在昆虫体内繁殖，昆虫变成菌丝体，在昆虫表皮生成子实体原基。按照此法，例如10天后有50%的个体硬化，12天后有90%的个体硬化，14天后有92%的个体硬化。此后，在5天内，在蛹的表面生成橘黄色的有性世代原基。这个子实体原基，从1个蛹中生成15根，可将在其表皮生成的物质作为种菌利用。另外，这个时候生成的子实体，是生成子囊孢子的有性世代，不是生成白色分生孢子的无性世代。通过进一步将其移植到保湿培养基上，可以使昆虫寄生菌的大量培养变得稳定。如果进行隔离保管，则使得从蛞蝓(俗称鼻涕虫)和粉蜱等食菌性动物来保护种菌成为可能。另外，把硬化了的昆虫，特别是把硬化了的蛹作为种菌，将该种菌配置在苔上，可以生成子实体。也就是说，在负伤昆虫的负伤部接种昆虫寄生菌，当菌类在昆虫体内蔓延之后，将硬化了的种菌配置在苔(苔体)上，最好是配置在活着的苔上，或者灰藓上，控制在2025'C，进行昆虫寄生菌的子实体生产。灰藓的形状特别适合于埋设保持种菌。如果保持适当的湿度和温度，也可以利用除灰藓以外的物质作培养基。在灰藓上，例如，在子实体原基生成之后，在22X:、20天内生长了24cm的子实体，有90%以上的个体生成。从此结果可知，子实体的生成和繁殖，亦即生产是可能的。在此情况下，作为由种菌产生子实体的环境，良好的条件是湿度在90%以上，温度在1625T:之间。温度若是25t:，虽然子实体的生成期间会縮短，但因变得稍微有些软弱，所以如果重视质量的话，希望控制在162(TC之间。如果控制在26。C以上，则腐畋率会升高。另外，把硬化了的昆虫，特别是把硬化了的蛹作为种菌，将该种菌配置在pH24的酸性培养基上，也可以生成子实体。作为此时利用的培养基，最好是诸如蛭石(vermiculite)、泥煤苔(peatmos)、7jC苔(sphagna)等。为了将该培养基的pH调到24的酸性，常利用柠檬酸等。通过使培养基酸性化，可抑制细菌在栽培环境内的繁殖，抑制子实体的污染，继而可抑制促进蛹、种菌腐败的杂细菌的繁殖，与此同时，还可避免抗生素、合成抗菌剂等杀菌剂等的使用。进而言之，将所得到的子实体，粘贴在存放培养基容器的内侧上部，把从子实体落下的子囊孢子作为种菌，可以生成子实体。例如，将种菌或者子实体粘贴在存放培养基容器的上盖内面，取出落下的子囊孢子，可以做成下一世代的种菌(接种源)。按照该方法，可在子实体上生成整个世代的子囊孢子。另外，把从子实体生成的子囊孢子落到培养基上，切取之后再分离，将其培养使其大量繁殖，就可做成进行下一世代子实体生产的种菌。另外，利用该方法，还能抑制现有技术中成为问题的昆虫寄生菌的昆虫病原性下降和繁殖力的下降，连续生产子实体。上述所得昆虫寄生菌(种菌)，可以在把由上述子实体得到的子囊孢子，落到添加了磨碎的寄主蛹的半合成培养基上繁殖之后，进行冷冻、冻结或冷藏，长时间保存。在此情况下，经过长时间存放，既能防止昆虫病原性的降低，又能无菌性确保昆虫寄生菌。另外，既能更容易与最新菌株比较，又能作为用于选拔的方法加以利用。例如，制取上述半合成培养基后，在放有该培养基的培养器的盖内面粘贴子实体，静置数日，就能在培养基上生成多个来源于子囊孢子的群体(colony)。选择其中繁殖良好、未被细菌污染的纯群体，进行再分离，然后在相同培养基上繁殖，冻结或冷藏，进行长期保存。将该方法用于种菌，继代培养优良形质的昆虫寄生菌，进行保管。也可以对培养基整体在低温下管理。还可以将菌丝或子实体置于杀过菌的溶剂中进行低温管理。另外，把在昆虫表皮生成了子实体原基的种菌，直接进行干燥，可以在室内等的常温、最好是2025。C下的、而且在其中放入硅胶等干燥剂使其相对湿度为1020%的干燥室中，进行长时间保存。例如，把在昆虫表皮生成了子实体原基的蛹作为种菌，将其保管在温度为2025。C、相对湿度为1020%的容器内，管理保管60天，再通过将这些种菌转移到湿度90%、温度22。C的容器内，可以生成子实体。如上所述，从在自然界采摘的冬虫夏草菌类等昆虫寄生菌的子实体，分离培养子囊孢子，可以不丧失昆虫病原性和繁殖能力，进行继代培养。另一方面，使昆虫负伤，在其负伤部接种昆虫寄生菌，使昆虫感染昆虫寄生菌，生成子实体原基，将其移植，从而可连续生产子实体。其次，再说明一下本实施例的作用。在昆虫的表皮上，特别是在蛹的表皮上，用小刀等划伤，在其负伤部接种昆虫寄生菌。通过弄伤昆虫表皮，可避免昆虫原本持有的细菌等的影响，还能提高昆虫寄生菌对昆虫的感染速度。因此，昆虫寄生菌在昆虫体内反复繁殖，在昆虫表皮生成昆虫寄生菌的子实体原基，再由该子实体原基生成子实体。按照以上详述的本实施例，可以获得如下的效果。按照本实施例中所述昆虫寄生菌子实体的生产方法，是将昆虫表皮弄伤，在其负伤部接种昆虫寄生菌，使昆虫寄生菌在昆虫体内繁殖，生成昆虫寄生菌子实体的。因此，通过将昆虫表皮弄伤，在其负伤部接种昆虫寄生菌这样简单的操作，就可以较早且容易地在昆虫体内繁殖昆虫寄生菌，生成子实体。因此，可以快速稳定地生产昆虫寄生菌的子实体，大大提高生产率。昆虫寄生菌选择冬虫夏草菌类，可在冬虫夏草菌类上有效发挥上述效果，提高其利用价值。另外，通过在琼脂培养基或在谷物培养基上培养昆虫寄生菌，在该培养基上生成昆虫寄生菌菌丝的状态下，在其上放置表皮负伤的昆虫，从而接种昆虫寄生菌，因此，可抑制在昆虫体内生存的细菌类泄漏到体外而增加，同时，还能抑制昆虫寄生菌活性的下降。.通过昆虫寄生菌在昆虫体内繁殖，使得昆虫硬化，以'其表皮上形成的子实体原基作为种菌，生成子实体。因此，昆虫寄生菌在昆虫体内繁殖，昆虫变成菌丝体，在昆虫的表皮生成子实体原基，用它做种菌，可以生成子实体。通过昆虫硬化，用昆虫做种菌，将该种菌配置在苔上，生成子实体。因此，可在取决于苔的适当湿度和温度下，容易生成子实体。通过昆虫硬化，用昆虫做种菌，将该种菌配置在pH24的酸性培养基上，生成子实体。因此，可抑制杂细菌的繁殖，还可抑制子实体的污染、蛹的腐败和容器内的污染，与此同时，还可避免使用抗生素和抗菌剂等。另外，通过将所得子实体粘贴在存放培养基容器内的上部，用从子实体落下的子囊孢子做种菌，生成子实体。因此，可以用子囊孢子的种菌作为下一世代生产的种菌，同时，可抑制昆虫寄生菌的昆虫病原性的降低和繁殖力的下降，进行子实体的连续生产。生产出来的昆虫寄生菌子实体，具有免疫作用、镇静作用、滋养强壮等作用，所以能较好地用于医药品，保健食品，化妆品等领域。以下，列举参考例和试验例，进一步具体说明上述实施例。参考例l，昆虫世代的比较将昆虫寄生菌置于PDA培养基内，在25"C下繁殖10天，使其蔓延，将斜纹夜蛾幼虫的3龄(年龄)、4龄、5龄，前蛹及蛹各10只，在那里静置2天，接种蛹虫草。接种后饲养管理35天，考察蛹虫草有无感染，死亡虫的只数以及有无生成子实体等。对于没有进行上述处理的情况，也进行了试验(无处理)。其结果列于表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从表l所示结果可知，前蛹中有9只感染，3龄幼虫有2只、4龄幼虫有1只感染。这样虽然可认定在前蛹和部分幼虫中有被感染的，但在其他世代中，即便是蛹的感染也在10%以下。另外，这些个体即使感染，也只是菌丝的发育，而没有子实体的生成。从这些结果可知，对于前蛹来说，接种的方法最合理。可是，要想大量获得仅仅这一个时期的蛹是很难的。可见，为了防止羽化，进行稳定的生产，应该在还是蛹的时代就进行负伤接种。试验例l，接种方法比较用PDA培养基培养蛹虫草，由此配制了菌丝浓度为l(f个/ml的菌丝悬浮液(培养菌丝液)。然后，用该培养菌丝液给斜纹夜蛾蛹进行喷雾接种(寄生菌喷雾接种)。另外，用注射器，在斜纹夜蛾蛹体内，从背面注射培养菌丝液O.2ml(寄生菌菌丝液注射)，进行接种。同时，在用PDA培养基培养的蛹虫草上，将斜纹夜蛾蛹静置2天并接种(无伤静置)。同时，对斜纹夜蛾蛹的一部分，用尖刀划上小伤后，放在培养菌丝内静置2天，在负伤部接种(负伤静置l)。同时，改变对蛹负伤的程度，弄伤至体液溢出的程度为止，再同样静置，在负伤部接种(负伤静置2)。如此接种之后，取这些蛹于22t:下，管理了50天。另外，供试蛹数分别取样150只。同时，对未做上述处理的斜纹夜蛾蛹，也进行了同样试验(无处理)。然后，对蛹虫草有无感染、到子实体生成为止的天数、子实体的个数、操作性、多个接种(蛹虫草对整个斜纹夜蛾蛹做的接种)进行测定或评价，其结果示于表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>从表2所示结果可知，喷雾接种了蛹虫草菌丝液的蛹全部都羽化，变态为成虫，感染没有成立。注射了蛹虫草的蛹，3闩后停止了动作，IO闩后硬化，30闩后整个都生成无性世代的白色菌丝束。但是，这种注射法，在注射需要时间、劳动力，感染时间短，昆虫病原性强的菌株的情况下，蛹的死亡变得过快，要想得到繁殖整齐等的实用性，必须进行浓度调整。同时，在PDA培养基内静置了2天的斜纹夜蛾蛹，全都变为成虫了。另外，在无处理的情况下(斜纹夜蛾蛹保持不变)，当然看不到昆虫寄生菌的感染。另一方面，将蛹的一部分弄伤，在菌子中静置2天，就看到在47天期间，蛹的动作就停止，而且未羽化就死亡，感染成立。将该蛹静置于25。C的恒温室内，17曰后就发现在昆虫的表皮生成了子实体，35日后全都生成橘黄色的子实体。改变对蛹弄伤的程度，在使体液溢出程度的情况下，虽然所有个体都很容易被寄生菌感染了，但早期死亡，由菌丝蔓延的个体，或者腐败的个体非常突出。同时，在泄漏到培养基内的体液中，也有了细菌繁殖、对寄生菌的繁殖产生影响的培养基。从这些结果可知，在培养器内培养昆虫寄生菌，在其中静置削伤体表皮的蛹，使之感染的方法，对于要感染大量的蛹并加以管理的情况来说，是最恰当的方法。用此方法生成的子实体，都是有性世代。试验例2，培养天数的比较在PDA培养基内，让蛹虫草在25"C下繁殖2天，4天，6天，8天和10天，然后，分别将10只斜纹夜蛾蛹在22i:下静置4天，使其接种。接种后饲养管理35天，对蛹虫草有无感染、子实体生成的天数以及有无杂菌繁殖等进行了考察。另外，全部的蛹都弄伤了体表皮。对没有进行上述处理的情况，也做了试验(无处理)。其结果示于表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>从表3结果可知，在培养了10天蛹虫草的培养基里，感染率最高，子实体的生成也多。而在培养了2天和4天的培养基中，感染率低，还出现了羽化个体。并且，子实体的生成天数也增多了。从这些结果可知，如果让菌丝在培养基内充分蔓延，进行接种，则不仅杂菌的繁殖没有了，而且感染也加快，子实体的生成也加快。试验例3，培养基的比较在试验例3中，将生成有子实体原基的蛹，在保湿状态下静置，使子实体生成。由于在通常的室内不生成子实体，所以为了促进生成，选用灰藓、山间地的沼泽泥土中、保湿器、蛭石(vermiculite)、泥煤苔(peatmoss)、水苔作为培养基。在后3种培养基中，为了抑制细菌的发生，添加了柠檬酸，使pH降低到3.0。在容量为l升的容器(T叩perware(株)制的聚乙烯食品容器(T叩perware))内，倒入上述材料O.7升，再添加蒸馏水0.1升，使其保湿，将生成有子实体原基的蛹，各埋设了20只。20天后，考察了子实体的生成率(％)及腐败个数。其结果列于表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表4结果可见，不管哪种培养基，都有子实体生成。尤其是在灰藓中生成率高。就连埋设在山间土壤中的情况下也同样生成了。虽然在保湿容器中也生成了子实体，但是为了提高子实体的生成率还是需要做遮光处理。子实体的颜色是橘黄色。另外，在使用蛭石、泥煤苔和水苔的情况下，当直接使用时，细菌就繁殖，从而产生腐败个体。但是，当把pH调整到3的时候，细菌的污染和腐败都消失了。而且子实体的生成率也提高到90%左右。试验例4，继体培养当将子实体粘贴在装有PDA培养基的医疗用玻璃器皿(schale)的盖内面使其静置时，昆虫寄生菌的子囊孢子掉落在培养基上，对新鲜子囊孢子进行再分离就变得有可能。应用这个方法，进行了以下的试验。试验的培养基，使用了PDA培养基以及添加了斜纹夜蛾蛹磨碎液的PDA培养基。将生成了子实体的蛹，用胶带粘贴在培养器的盖内面，在25t:的恒温室内放置3天。把在培养基表面生成的菌丝群体，移植到其他培养基里，通过再分离后培养10天，弄伤蛹之后接种，考察了子实体的生成天数、昆虫病原性有无降低、冻结或冷藏的保存性能。昆虫病原性的有无降低，用子实体的生成天数判断。子实体的有无生成，用显微镜观察确定。关于保存性能，分别考察了l个月、4个月、6个月、12个月以及24个月后菌的繁殖速度。其结果列于表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>从表5的结果可知，如果用PDA培养基培养蛹虫草，对蛹接种的话，在19天内就生成子实体，即使冻结保存12个月、冷藏保存4个月，在培养基上都有显著的子实体繁殖。虽然经四次继代培养，保存性也没有变化，但发现子实体的生成天数为26曰，且昆虫病原性也有下降。在添加了蛹磨碎液的PDA培养基的情况下，子实体生成天数为17天，且尚未见昆虫病原性的下降。如果取菌丝在添加了蛹磨碎液的TOA培养基上培养，给负伤的蛹接种的话，则可以确认，所生成的子实体变为有性世代子实体，成功生成了初次子囊孢子，并生成了来自子囊孢子继体培养的子实体。在担心昆虫病原性下降的情况下，将从子实体分离出来的昆虫寄生菌置于添加了蛹磨碎液的半合成培养基上进行培养和保存的方法是稳定可靠的。试验例5，干燥保存法将生成子实体原基之前已硬化的蛹干燥数天，再于2025。C下，保存在能密闭的500ml玻璃容器内。在玻璃容器内，放入200g硅胶作为干燥剂，使内部保持干燥状态(干燥处理区)。另一方面，作为比较，在同样的玻璃容器内，放入湿的棉球以提高湿度，保存与上述相同的蛹(保湿处理区)。另外，作为对照，在干燥或不加湿的玻璃容器内也保存同样的蛹(无处理区)。然后考察子实体的生成，并按以下基准进行评价，其结果列于表6。◎:子实体以较高生成率生成。O:子实体以较低生成率生成。X:未见生成子实体。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>从表6所示结果可知，在干燥玻璃瓶内保存的硬化蛹，即使保存2个月后，一旦使之为加湿状态也生成子实体，但是在保湿处理区和无处理区，蛹上菌丝的繁殖加快，成为过繁盛状态，未见子实体的生成。在干燥处理区处理3个月之后，子实体的生成率稍微下降，5个月后则见不到子实体的生成了。由此可知，在让寄生菌感染一次之后，不生成子实体就保存的情况下，以在干燥条件下放置的方法为佳。这一事实表明，子实体生成蛹的生产是可能调节的。显然，如果控制在低温，就可以保存更长时间。试验例68，基于昆虫种类和昆虫寄生菌种类的差异作为昆虫，选用烟草蛾蛹(试验例6)和蚕蛾蛹(试验例7)进行了实施。作为昆虫寄生菌，选用蛹虫草，采用PDA培养基和谷物(稻谷)培养基，对该蛹虫草在25'C下培养10天，在菌子蔓延的培养容器内，将20只烟草蛾蛹弄伤后静置，接种蛹虫草，与此同时，尔后取出，保持在恒温于22'C的蛭石培养基中。接下来，采用PDA培养基和谷物(米)培养基，在25。C下，培养蛹虫草10天，在菌子蔓延的培养容器内，将20只蚕蛾蛹弄伤后静置，接种蛹虫草，与此同时，尔后取出，保持在恒温于22'C的蛭石培养基中。考察了在这种状态下子实体原基生成时期、子实体生成时期以及腐败蛹个数。其结果列于表7和表8之中。另外，还将生成了用同样方法生成的子实体原基的种菌(硬化后生成了子实体原基的蛹)30个体，放于湿度在1020%、装有干燥硅胶的容器内静置5天，然后放入调节成酸性的泥煤苔培养基中，考察子实体生成的有无(试验例8)。其结果列于表9。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表8<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表9<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>从表7所示结果可知，在烟草蛾的情况下，用PDA培养基，从13天后生成子实体原基；用谷物培养基，是从10日后生成子实体原基。同时可见，子实体分别从20天和19天之后生成。而且，谷物培养基的腐败蛹个数，比PDA培养基的少。再从表8结果看，蚕蛾也有同样的趋势。从这些结果可知，与PDA培养基比较起来，因为采用谷物培养基的菌丝繁殖好，所以蛹虫草菌的繁殖良好，感染得快，子实体的生成加快，效率更高。此外，从表9所示结果可知，在干燥处理的情况下，既未产生腐败，子实体生成效率也高。从这些结果可知，本发明中的昆虫寄生菌的子实体的生产方法，烟草蛾蛹和蚕蛾蛹都可以利用。另外，上述实施例也可以做如下变更。可以增加在昆虫表皮形成负伤部的数量，而对这些负伤部分别接种昆虫寄生菌。在进行昆虫寄生菌子实体生产的时候，在1020'C的温度范围内，进行温度调节，可调整昆虫寄生菌的繁殖。在培养基中还可添加矿物质类、维生素类、氨基酸类等营养成分。权利要求1.一种昆虫寄生菌子实体的生产方法，其特征在于通过弄伤昆虫表皮，在负伤部接种昆虫寄生菌，使昆虫寄生菌在昆虫体内繁殖，来生成昆虫寄生菌的子实体。2、根据权利要求l记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，其特征在于上述昆虫寄生菌是冬虫夏草菌类。3、根据权利要求1或2记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，其特征在于把上述昆虫寄生菌置于琼脂培养基或谷物培养基上培养，在让昆虫寄生菌的菌丝在该培养基上生成的状态下，在其上放置表皮负了伤的昆虫，接种昆虫寄生菌。4、根据权利要求3记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，其特征在于上述昆虫寄生菌的菌丝，是遍及整个培养基上生成的。5、根据权利要求1或2记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，其特征在于上述昆虫表皮的负伤，是控制在昆虫体液不溢出的程度下进行的。6、根据权利要求1或2记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，其特征在于上述昆虫的形态是蛹。7、根据权利要求l记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，其特征在于上述昆虫寄生菌在昆虫体内繁殖，使得昆虫硬化，把其表皮上生成了子实体原基的部分作为种菌，来生成子实体。8、根据权利要求7记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，其特征在于将上述种菌配置于苔上，生成子实体。9、根据权利要求7记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法，其特征在于将上述种菌配置在pH24的酸性培养基上，生成子实体。10、一种昆虫寄生菌子实体的生产方法，其特征在于将按照权利要求79中任何一项记载的昆虫寄生菌子实体的生产方法所得到的子实体，粘贴在存放培养基的容器内上部，把从子实体掉落的子囊孢子作为种菌，来生成子实体。全文摘要本发明提供一种能快速稳定生产昆虫寄生菌子实体的昆虫寄生菌子实体的生产方法。按照该昆虫寄生菌子实体的生产方法，通过弄伤昆虫表皮，在负伤部接种昆虫寄生菌，使昆虫寄生菌在昆虫体内繁殖，从而生成昆虫寄生菌的子实体。作为昆虫寄生菌，例如可采用冬虫夏草菌类；作为昆虫，采用斜纹夜蛾等鳞翅目的昆虫。最好是把上述昆虫寄生菌置于琼脂培养基或谷物培养基上培养，在让昆虫寄生菌的菌丝在该培养基上生成的状态下，在其上放置表皮负了伤的昆虫，接种昆虫寄生菌。此外，也可以让昆虫寄生菌在昆虫体内繁殖，使得昆虫硬化，把其表皮上生成了子实体原基的部分作为种菌，来生成子实体。文档编号C12N1/14GK101210223SQ200610063639公开日2008年7月2日申请日期2006年12月27日优先权日2006年12月27日发明者田口义广,近藤幸盛申请人:近藤幸盛