专利名称：粘细菌专有质粒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株橙色粘球菌，一种来源于所述粘细菌的专有质粒，含有上述质粒片段的重组载体或重组质粒，被上述质粒及衍生物或重组载体或重组质粒转化或接合的微生物及这些微生物的应用，以及该质粒及衍生物、重组载体和重组质粒的应用。
背景技术：
粘细菌(myxobacteria)是一类革兰氏阴性的单细胞杆状细菌，属于变形细菌门的δ分支，主要存在于各地土壤、草食动物粪肥、树皮和腐烂的树木中，具有复杂的多细胞行为和形态发生过程，是一类高等的原核生物。依照其形态学特征可分为两个亚目、四个科、十三个属，即Angiococcus、Myxococcus、Corallococcus、Anaeromyxobacter、Archangium、Cystobacter、Melittangium、Stigmatella、Haploangium、Chondromyces、Polyangium、Sorangium、Nannocystis。虽然粘细菌在系统分类上属于细菌，但其分化发育过程中涉及的细胞之间的信号传导模式更接近真核生物。针对粘细菌多细胞形态发生分子调控的研究，将对认识原核生物的细胞分化发育、理解生命的进化过程、真核生物的细胞行为和分化发育的分子调控等均具有重要意义。同时粘细菌还可以合成许多复杂的次级代谢产物，其中很多具有抗真菌、抗细菌和抗肿瘤活性，如soraphen、epothilones等生物活性分子。目前，已从粘细菌中发现了100种以上的基本结构和600多种化学结构的衍生物，约占微生物来源总数的3.5％，按已发现生物活性物质的数量，粘细菌仅排在放线菌和芽孢杆菌之后，是一类重要的药源菌。因此粘细菌极具科学研究价值和应用开发前景。
虽然通过几十年的研究，在粘细菌中陆续建立了一系列遗传操作系统，来更好的认识和了解该重要的资源菌，但是一直没有发现粘细菌中存在可在染色体外自主复制的质粒DNA分子。因此应用目前常用的遗传操作方法(转导、转化、接合)来将外源片段导入粘细菌，均需通过特定的位点(转座子、同源重组臂)将外源基因整合入染色体，作为宿主基因组的一部分进行复制，再将其性状或产物表现或表达出来。这样的操作无疑将转化表达的过程增加了同源重组这一过程，同时使转化效率降低。但由于在粘细菌中一直没有发现可在染色体外自主复制的质粒DNA分子，因此外源基因在粘细菌中的表达一直是个难题，这在很大程度上限制了这类重要微生物资源菌的理论研究和基因工程开发。相关的报道有，将纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So ce90来源的用于合成epothilones的epothilone PKS/NRPS/PKS基因簇电转化入黄色粘球菌(Myxococcusxanthus)DZ1中，通过同源重组臂整合入染色体的devRS区，来异源表达epothilone天然产物(Antimicrob.Agents Chemother.2002，46，2772-2778)。
虽然人们也试图将粘细菌来源的基因片段，导入一些目前遗传背景较清楚、易于基因操作的细菌中进行研究或表达，如大肠杆菌(E.coli)、天然色链霉菌(Streptomycescoelicolor)。但是菌种间的差异往往使得操作变得非常繁琐，如需添加可以为宿主细胞识别的启动子，变换成宿主易于识别利用的密码子等，需要构成一些嵌合基因。因为粘细菌高GC％含量的特性，往往使得嵌合基因不稳定，异源宿主细胞对其基因片段进行剪切重组，破坏目的基因，消除基因中的GC％差异。而且粘细菌中的启动子序列也具有高GC％的特点，往往不能被异源宿主有效识别和利用。
因此，对于粘细菌这样一类重要的资源菌，由其自身天然存在的质粒DNA分子及衍生的重组载体或重组质粒建立的一套质粒方法的遗传操作系统，将对于该菌的遗传分析和应用研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)及其突变体或变异体。
本发明所述橙色粘球菌是橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)124B02 CCTCC M206081。
本发明所述的橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)124B02是从中国吉林长春田地中分离到的，革兰氏染色阴性，杆状，可在CTT、VY-2等常用于培养粘细菌的培养基中生长，可形成子实体。16s rDNA序列分析与橙色粘球菌有99％的同源性，因此定其为橙色粘球菌。该菌株已于2006年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，保藏中心编号为CCTCC M 206081。
本发明的另一个目的是提供一种从上述橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)124B02中分离的，在染色体外可自主复制的质粒DNA分子，并将其构建成可以用于表达外源基因的重组载体或重组质粒，用来转化或接合入微生物，特别是粘细菌，从而更好的研究和开发粘细菌资源。
质粒DNA分子的拓扑学结构可以为线性或环形。分别使用抽提线性质粒和环形质粒的总DNA抽提法和碱裂解法进行操作，通过脉冲场电泳和普通琼脂糖凝胶电泳进行检测。
已经检测的粘细菌菌属包括粘球菌属(Myxococcus)，珊瑚球菌属(Corallococcus)、堆囊菌属(Sorangium)等。
本发明所述的粘细菌专有质粒是来源于橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)124B02的质粒pMX1，一种环形双链质粒DNA分子，其具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，由18,634个核苷酸组成。
本发明所述质粒pMX1包含如图1所示的限制性酶谱。
上述质粒pMX1的基因编码阅读框(open reading frame，orf)见下表。
其中，pMX1.13及pMX1.14所在的SEQ ID NO.1的10953-13980 DNA序列片段存在质粒自主复制必需的功能区。这两个基因编码阅读框架与质粒DNA分子自主复制的相关性目前还未见报道。
因此凡是包含SEQ ID NO.1和/或其互补链的全部或部分核酸序列，及与之基本相似的核酸序列的质粒DNA分子或其衍生物，以及包含SEQ ID NO.1和/或其互补链的核苷酸序列中连续的20个碱基对的部分序列相同的连续20个碱基对核苷酸部分的质粒DNA分子或其衍生物均受本发明保护。
当然，由质粒pMX1转化或接合所得的微生物，含有质粒pMX1的重组载体及其转化或接合所得的微生物，含有pMX1的重组质粒及其转化或接合所得的微生物，均受本发明保护。其中，所述微生物优选是指粘球菌或/和大肠杆菌。
经实验检测，包含SEQ ID NO.1所述核苷酸序列中的10953-13980 DNA序列片段的质粒DNA分子电转化入黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)DZ1中，可以在染色体外自主复制，并通过碱裂解的方法可以提取得到环状质粒DNA分子。因此SEQ ID NO.1中的10953-13980 DNA序列片段含有粘细菌中质粒DNA分子自主复制必需的功能区。
由于质粒pMX1提供了在粘细菌中质粒自主复制所必需的功能区，因此，在保证其提供的复制必需功能区完整的条件下，向其中引入外源的其他功能DNA片段，就可构成可转化或接合入粘细菌的重组载体或重组质粒。可以在保证该复制必需功能区完整的情况下，引入在各种粘细菌中有效的抗性选择基因，就可构成适用于粘细菌转化或接合等遗传操作的质粒系统。另外还可以在此基础上引入其他细菌的质粒复制区，如大肠杆菌或链霉菌的质粒复制区，及适于在这些细菌中筛选的标记基因，如抗性或lacZ筛选标记基因，就可以构成多种适用于不同菌株与粘细菌中操作的穿梭载体，从而方便重组质粒的扩增，及在粘细菌中进行遗传分析和应用研究。
因此本发明所述的由粘细菌来源的专有质粒及其衍生物，携带有此专有质粒自主复制必需功能区的重组载体或重组质粒及其转化或接合所得的微生物及这些微生物的应用均受本发明保护。
本发明所述粘细菌专有质粒及其衍生物，以及携带有此专有质粒自主复制必需功能区的重组载体或重组质粒在生物界，优选是粘细菌领域的遗传分析和基因工程应用研究也应受到本发明的保护。
本发明提供的一株橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)124B02，已于2006年8月26日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，保藏地址湖北省武汉市武汉大学，邮政编码430072，其保藏编号为CCTCC M 206081。
图1为本发明所述质粒pMX1的酶切位点图谱。
图2为穿梭载体pZJY7结构图谱。
具体实施例方式
实施例1.橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)124B02 CCTCC M 206081的分离培养配制粘细菌富集培养基WCX[CaCl20.15％，琼脂 1.5％，放线菌酮 0.5％(灭菌后加入)，KOH调至pH7.0，用蒸馏水配制]。在凝固的WCX平板上涂抹活的大肠杆菌菌体作为粘细菌的底物。将从中国吉林长春田地采集的土样均匀地撒在菌体上。显微操作挑取粘球菌的子实体，纯化，获得纯菌株124B02。
实施例2.从粘细菌中提取环状质粒将要检测的粘细菌接种在3ml CTT[Casitone 1％，MgSO48mM，Tris·HCl(pH7.6)10mM，potassium phosphate(pH7.6)1mM，pH7.6]或VY-2(Baker yeast 0.5％，VB120.5mg/L，CaCl20.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH7.2)的液体培养基中，并于30℃振摇200rpm培养，生长60-72h。离心收集菌体，加500ul TE25S[蔗糖10.3％，Tris·HCl(pH8.0)25mM，EDTA(pH8.0)25mM]和溶菌酶(终浓度2mg/ml)，悬浮菌体，37℃温浴1h，不时颠倒混匀，加入250ul碱裂解液(NaOH 0.3M，SDS 2％)，颠倒混匀4-6次，55℃温浴30min，加入250ul水饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)颠倒混匀，离心取上清液，加入等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提蛋白，离心取上清，重复使用等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提蛋白，直至界面无明显的蛋白层。离心取上清液，加入1/10体积的3M NaAc和等体积的异丙醇沉淀DNA0.5-1h，离心弃上清液，70％乙醇洗涤沉淀，真空干燥。将DNA溶于20ul TE[Tris·HCl(pH8.0)10mM，EDTA(pH8.0)1mM]，普通琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例3.从粘细菌中提取线状质粒将要检测的粘细菌接种在3ml CTT或VY-2的液体培养基中，并于30℃振摇200rpm培养，生长60-72h。离心收集菌体，加500ul TE25S和溶菌酶(终浓度2mg/ml)，悬浮菌体，37℃温浴1h，不时颠倒混匀，加入SDS(终浓度1％)和protein K(终浓度50ug/ml)，37℃温浴1h，加入等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提蛋白，离心取上清，重复使用等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提蛋白，直至界面无明显的蛋白层。离心取上清液，加入1/10体积的3M NaAc和等体积的异丙醇沉淀DNA 0.5-1h，离心弃上清液，70％乙醇洗涤沉淀，真空干燥。将DNA溶于20ul TE，脉冲场电泳检测。
实施例4.pMX1的亚克隆测序使用实施例2的方法，从橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)124B02中分离得到了环状双链质粒pMX1。大量制备菌体，提取质粒，切胶回收，Xba I酶切pMX1，将酶切片段混合物连接到已用Xba I和Alkaline Phosphatase(CIAP)处理的pSP72载体，转化E.coli DH 5α，得到亚克隆，挑选所含质粒片段不同大小的亚克隆进行测序。
实施例5.pMX1质粒自主复制必需功能区的鉴定构建质粒pZJY1。在质粒pSP72的Hind III位点插入一个来自质粒ColE I的卡那霉素抗性基因(aminoglycoside-3’-O-phosphotransferase gene)，得到pZJY1。将实施例4中得到的亚克隆使用不同的限制性内切酶进行酶切，得到SEQ ID NO.1中不同区域的DNA片段，将其连入pZJY1，转化E.coli DH 5α，得到含有pMX1不同区域DNA片段的转化子，提取质粒，电转化黄色粘球菌(M.xanthus)DZ1，观察转化结果，纯化转化子，按照实施例2的方法提取质粒，电泳检测。可检测到质粒的转化子，其质粒中必然含有pMX1质粒自主复制必需功能区。经过一系列试验发现，位于SEQ ID NO.1的10953-13980 DNA序列处的DNA片段含有pMX1质粒自主复制必需功能区。
实施例6.大肠杆菌-粘球菌穿梭载体pZJY7的构建将一段位于SEQ ID NO.1的10953-13980 DNA序列处的Sal I片段插入质粒pZJY1的Sal I位点，得到穿梭载体pZJY7(见图2)。该质粒带有pMX1的质粒自主复制必需功能区pMX1 ori(SEQ ID NO.1的10953-13980 DNA序列)，可以在M.xanthus DZ1中以自主复制质粒的方式存在；带有pSP72的质粒复制功能区pSP72 ori，可以在E.coli中大量复制扩增；带有卡那霉素抗性基因(aminoglycoside-3’-O-phosphotransferasegene)，作为M.xanthus DZ1中的抗性选择标记基因；带有氨苄青霉素抗性基因(β-lactamase)，作为E.coli中的抗性选择标记基因；带有可用于插入外源基因的XbaI-BamH I-Kpn I-Sac I-EcoR I-Cla I-EcoR V多克隆位点。因此pZJY7是一个有效的大肠杆菌-粘球菌穿梭载体，可转化大肠杆菌和粘球菌，并在其中克隆表达外源基因。
序列表<110>山东大学，中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所<120>粘细菌专有质粒及其应用<141>2006-8-22<160>1<210>1<211>18634<212>DNA<213>橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)<221>来源于橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)124B02 CCTCC M 206081的质粒pMX1之DNA<222>(1)…(18634)<400>1ctagagggcg ctcccgtcga gggggtgccc tcttgtcgtt ttggggtggg cctcgagcgc 60gggcgccagg tggagctggt ggagctgctc gagcacctgg tcggccagga ggacctggtg 120gaggccctcg cgggccgggc ctcgagcgcg ggcgccaggt ggagctggtg gagctgctcg 180agcacctggt cggccaggag gacctggtgg aggccctcgc gggccgggcc tcgagcacgg 240gcgcctggtg gagctgctcg agcacctggt cggccaggag gacctggtgg aggtcctcgc 300gggccgggcc tcgagcgcgg gcgccaggtg gagctggtgg agctgctcga gcacctggtc 360ggccaggagg acctggtgga ggtcctcgcg ggccgggcct cgagcacggg cgcctggtgg 420agctgctcga gcacctggtc ggccaggagg acctggtgga ggccctcgcg ggccgggcct 480cgagcacggg cgcctggtgg agctgctcga gcacctggtc ggccaggagg acctggtgga 540ggtcctcgcg ggccgagcct cgagcgcggg cacctgcgcg aaatgcgcgc ggctgcgcga 600aatgcccgag accccctcgg agcgaccatt acgcctagct ctcttttcgg cgcggttttg 660agaccttgca tctcgttgat gacggcggtg cggacgtcag tgcctcaacc gctcccctcc 720gaggacggga ccgcgcgccc atagaggccg gggcgacgcc gcgccgccgt caccaacacc 780acctttacgc cgaggcgagg cgatgcacga cgagcttgga ggacaggttg cgcagcgtga 840cgacgccccc aagtcccggc gtgcgaaacg cgggcgcccc gcgagcaacc cggcgcgctg 900gaagcgcacc tatcgcgaga tgctgttccg cgctggcgac agcacccgcg aaatcgcggc 960ggcgaatgca tgggcgaggg aacacggggt cgagctgaat ccgctggccg tgctcgcgga 1020ggaaggcgcg aagtcgtttg ctgcgcgggg tggtgcgcct gccgaggcgt ccgcgcctgc 1080cgaggcgtcc gagagcgcct gggatgccga agccgcgagg gctgaagctg cggcgactgg 1140tgcggatgct gcccccgtcg agggttccgc gccttccagt gcgccggccg agggttccgc 1200gccggctgag ggcgccccgt ccgccgagta cgtgacgcca gcggacccga gcgcgttccc 1260ggacatggct ccgggtggcg gtgcgcccga ggcgaaagcc gagccggcgg ggccgcgctt 1320
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权利要求
1.一株橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)124B02 CCTCC M 206081。
2.一种来源于橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)124B02的质粒pMX1，其具有SEQ IDNO.1的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的质粒pMX1，其特征是，所述的质粒DNA分子及其衍生物至少含有SEQ ID NO.1和/或其互补链的全部或部分核酸序列，及与之基本相似的核酸序列。
4.如权利要求3所述的质粒pMX1，其特征是，所述的质粒DNA分子及其衍生物至少含有SEQ ID NO.1和/或其互补链的核苷酸序列中连续的20个碱基对的部分序列相同的连续20个碱基对核苷酸部分。
5.如权利要求2～4之一所述的质粒pMX1，其特征是，所述质粒自主复制必需的功能区是SEQ ID NO.1所述核苷酸序列中10953-13980的DNA序列。
6.含权利要求2所述质粒pMX1且能在粘细菌中自主复制的重组载体。
7.如权利要求6所述的重组载体，其特征是，其含有权利要求2所述的质粒DNA或其部分功能DNA片段，含有至少一种可以在粘细菌和/或其他细菌体内能够自主复制的DNA序列，并且至少有一个选择标记。
8.含权利要求6所述重组载体携带外源功能DNA片段构成的重组质粒。
9.由权利要求2所述质粒pMX1或权利要求6所述重组载体或权利要求8所述重组质粒转化或接合所得的微生物。
10.如权利要求9所述的微生物，其特征是，所述微生物是粘球菌或/和大肠杆菌。
全文摘要
本发明公开了一株橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)124B02菌株(CCTCC M206081)。同时还公开了一种来源于橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)124B02的质粒pMX1，其具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。由质粒pMX1提供并构建的重组载体或重组质粒，可转化或接合粘细菌，尤其是粘球菌，用于粘细菌资源遗传分析和基因工程应用研究。
文档编号C12N1/21GK1944631SQ20061006878
公开日2007年4月11日 申请日期2006年9月12日 优先权日2006年9月12日
发明者李越中, 覃重军, 赵静宜, 沈美娟, 夏志洁, 钟莉 申请人:山东大学, 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所