长效人促红细胞生成素融合蛋白及其制备和纯化方法

专利名称：长效人促红细胞生成素融合蛋白及其制备和纯化方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种用于治疗贫血症的重组人促红细胞生成素(rhEPO)融合蛋白rhEPO-Fc，制备和纯化该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在医药中的用途。
背景技术：
红细胞生成素(EPO)是调控人红细胞形成的主要调节因子。EPO是一种糖蛋白，在胎儿体内由肾脏及肝脏产生，而在成人体内主要由肾脏产生。肾功能受到损害，如在慢性肾衰竭的病人中，红细胞生成素的产生受到妨碍，可导致贫血的产生。正常人体内血液中红细胞生成素的含量为10～18毫单位/毫升。当体内缺氧时，红细胞生成素的含量可提高到1000倍以上。红细胞生成素与靶细胞如骨髓细胞、脾细胞、胎儿肝细胞上的特定位点结合，从而促进红细胞前体细胞的增殖、分化并成熟为红细胞，增加骨髓向循环血中红细胞的释放量。由此可见，红细胞生成素是一种重要的造血生长因子，对体内红细胞的生成起着不可缺少的调控作用。
Epo为单链多肽，包括166个氨基酸，含两对二硫键(Cys7-161和Cys29-33)以及四个潜在的糖基化位点，其中有三个N-连接位点(Asn24，Asn38，Asn83)和一个O-连接位点(Ser126)。Epo的分子量为30-34kDa，其中多肽仅为18kDa。40％糖基化的Epo的主要糖链结构为N-连接的复合型多糖，在Epo的生物学活性中发挥重要作用。
靶细胞受EPO刺激后先是细胞质内Ca2+的聚集。FVA细胞在4℃受高浓度EPO刺激1分钟后，其细胞质内即有Ca2+聚集。单个红系前体细胞受EPO刺激后细胞质中Ca2+浓度升高，这是由于细胞内Ca2+的重新分布，而不是因为细胞外Ca2+进入了细胞。EPO作用于靶细胞后的另一效应是使细胞内DNA合成增加。如无EPO存在，即使增加细胞质内Ca2+浓度，也不能使红系前体细胞向红系细胞分化，说明Ca2+很可能在红系细胞的增殖和分化中起辅助作用。
此外，缺氧小鼠注射EPO后0.5-2.0小时，其脾脏中红系造血前体细胞RNA聚合酶II活性增强，3-12小时后RNA聚合酶I活性增强，非组蛋白合成增强。12-14小时后RNA酶II活性再次增强，同时DNA聚合酶α活性增强，组蛋白合成增加。48小时后，DNA合成量达最大值。
血红蛋白的合成也受EPO的影响，骨髓被抑制和刺激的大鼠骨髓细胞在体外培养中加入EPO后2小时，其球蛋白mRNA水平即出现差别。FAV细胞在体外经EPO刺激后6小时有β球蛋白mRNA生成，纯化的CFU-E经EPO作用后不到1小时有球蛋白mRNA转录。以上结果表明，球蛋白基因的转录可能是EPO对造血细胞的最早效应。
红细胞过多的大鼠，骨髓红细胞生成受到严重抑制。这种细胞有足量的合成血红蛋白的酶，但不能合成血红蛋白。经EPO刺激后有胆色素原脱氨酶出现，用于血红素合成的酶没有变化。这一限速酶的合成在EPO刺激后20～24小时出现。
此外，FAV细胞经EPO刺激后6小时，转铁蛋白结合位点开始增加，到24小时后增加1倍。骨髓抑制的大鼠骨髓细胞体外培养表明，EPO可促进骨髓细胞表达一些红细胞膜成分及一些在红系细胞分化过程中只一过性地表达的成分，说明EPO对造血细胞有多方面的作用。
目前，EPO已经广泛的应用于治疗慢性肾衰引起的贫血。此外，EPO对改善AZT治疗AIDS病人后诱导的贫血状态有明显作用。EPO还用于治疗肿瘤引起的贫血和肿瘤化疗引起的贫血、治疗早产儿贫血、治疗类风湿关节炎引起的贫血。在手术前给予EPO能增加病人自体血液回输的量，在手术前后应用EPO能刺激骨髓细胞使手术中的失血得到较快的代偿。
IgG类免疫球蛋白是人体血液中最丰富的蛋白，其半衰期可达21天。已有报道显示将IgG的Fc片段与其他蛋白融合，可显著增加该蛋白在体内的生物活性和半衰期。这种方法已经应用于一些临床上很重要的细胞因子和可溶性受体，并获得了成功，如sTNF-αR、LFA3、IL-2、INF-α等等。
EPO在体内的半衰期仅为4到11.2小时，对病人而言这就需要在一周内接受2～3次的注射。本发明的申请人选择裂解活性最弱的人IgG2的Fc片段接至Epo的C-末端，构建rhEpo-Fc融合蛋白，大大提高了EPO在体内的半衰期，同时在相同分子数基础上保持与天然Epo相似的生物学活性，并实现了融合蛋白在哺乳动物细胞CHO中的高效表达，且纯化工艺简单，利于进一步的大规模制备。

发明内容
本发明的一个方面提供了一种用于治疗贫血症的重组人促红细胞生成素(rhEPO)融合蛋白rhEPO-Fc，该多肽是包含SEQ ID NO6所示氨基酸序列的多肽，或其片段、同源物、类似物或衍生物。在一优选的实施方案中，rhEPO-Fc由SEQ ID NO6所示氨基酸序列构成。
本发明的另一个方面提供了一种编码重组人促红细胞生成素融合蛋白rhEPO-Fc的多核苷酸分子，其特征在于它是与SEQ ID NO6编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
优选地，本发明的多核苷酸分子包含SEQ ID NO5所示的核苷酸序列；更优选地，本发明的多核苷酸分子是SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
本发明进一步提供含有编码本发明多核苷酸的重组表达载体、由该重组表达载体转化的宿主细胞，以及由该宿主细胞所衍生的新的株系或细胞系。在一优选实施方案中，本发明提供一种包含本发明多核苷酸分子的重组真核表达载体pEPO-Fc，以及含有该重组表达载体的遗传工程宿主细胞pEPO一Fc/CHO。
本发明进一步提供制备rhEPO-Fc融合蛋白的方法，其包括在适于该融合蛋白的条件下培养用重组表达载体转化的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收和纯化该重组融合蛋白的步骤。在一个优选的实施方案中，宿主细胞经细胞培养、离心后，上清液分别用亲和层析和分子筛层析纯化。在一个优选的实施方案中，亲和层析是rProtein ASepharose FF亲和层柱，分子筛是Superdex 200prep grade柱。
本发明进一步提供含有本发明rhEPO-Fc融合蛋白作为活性成分和药学上可接受载体的药物组合物，以及该药物组合物在治疗贫血症的药物中的用途，包括慢性肾衰引起的贫血、AZT治疗AIDS病人后诱导的贫血、肿瘤引起的贫血、肿瘤化疗引起的贫血、早产儿贫血以及类风湿关节炎等原因引起的贫血。
本文中提到的rhEPO-Fc融合蛋白的“同源性”多肽是指，多肽本来具有rhEPO-Fc融合蛋白的氨基酸序列，但其中一个或多个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基保守地取代，并且所得到的多肽可用于实施本发明。保守氨基酸取代是本领域已知的。造成这样的取代的规则包含由Dayhof，M.D.(1978，国家生物医学研究基金，Washington，D.C.，第5卷，增刊3)等所述的取代规则。更具体地说，保守氨基酸取代发生在与其酸性、极性或侧链大小相关联的氨基酸家族内。一般可将遗传编码的氨基酸分为四组(1)酸性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电的极性氨基酸甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同分类为芳香氨基酸。任何特定组内的一个或多个取代，例如用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、或用谷氨酸取代天冬氨酸、或用丝氨酸取代苏氨酸，或任何其他氨基酸残基结构上相关的氨基酸残基，例如有相似酸性、极性、侧链大小的，或在其某些组合方面有相似性的氨基酸残基取代，一般对多肽的功能或免疫原性不会有太大影响。
在本发明中，“SEQ ID NO6所示氨基酸序列的类似物”被定义为，与SEQ ID NO6相比较，具有一个或几个氨基酸取代，删除，转换或增加的分子。“SEQ ID NO6所示氨基酸序列的衍生物”被定义为如下一种分子，它具有SEQ ID NO6或SEQ ID NO6类似物氨基酸序列，但是另外还具有化学修饰的一个或几个氨基酸侧链基团，α-碳原子，末端氨基，或者末端羧酸基。化学修饰包括增加部分化学结构，生成新键，和除去部分化学结构。对氨基酸侧链基团的修饰包括赖氨酸ε-氨基的酰基化，精氨酸，组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化，以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰氨基。末端氨基的修饰包括脱氨基，N-低级烷基修饰，N-二低级烷基修饰和N-酰基修饰。对末端羧基的修饰包括酰胺修饰，低级烷基酰胺修饰，二烷基酰胺修饰和低级烷基酯修饰。低级烷基是C1-C4烷基。并且，还可以用蛋白质化学的普通技术人员熟知的保护基，保护一个或几个侧链基团或末端基团。还可以使氨基酸的α-碳原子单甲基化或二甲基化。
本文所用的术语“多核苷酸分子”是指单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。
生产和操作本文公开的多核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的重组技术完成(参见Maniatis等，1989，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，分子生物学当前技术，Greene PublishingAssociates & Wiley Interscience，NY；Sambrook等，1989，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等(编)，1995，PCR策略，AcademicPress，Inc.，San Diego；和Erlich(编)，1992，PCR技术，牛津大学出版社，New York)。
本发明提供了包含编码rhEPO-Fc融合蛋白的一种多核苷酸分子，在进一步的优选实施方案中，本发明的编码rhEPO-Fc融合蛋白的多核苷酸分子包含选自下列成员的核苷酸序列(1)包含SEQ ID NO5的核苷酸序列；(2)与SEQ ID NO5所示核苷酸序列至少70％相同、优选至少80％相同、更优选至少90％相同、最优选至少95％相同的核苷酸序列；(3)在中等严谨杂交条件下(即在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中于65℃与结合于滤膜的DNA杂交，并在0.2xSSC/0.1％SDS中于42℃洗涤的条件；参见Ausubel等(编)，1989，分子生物学当前技术，第1卷，Green Publishing Associntes，Inc.，and John Wiley & Sons，Inc.，NY，P.2.10.3)、优选高度严谨杂交条件(即在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中于65℃与结合于滤膜的DNA杂交，并在0.1xSSC/0.1％SDS中于68℃洗涤条件；参阅Ausubel等，1989，上述文献)下与具有SEQ ID NO5或其互补序列的多核苷酸分子能杂交的核苷酸序列；或者(4)与SEQ ID NO6编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
可用于表达本发明的rhEPO-Fc融合蛋白序列的各种表达载体是本领域已知的，其中包括含有特定编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA和粘粒DNA表达载体。可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型原核表达载体质粒包括pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(Biorad Laboratories，Richmond，CA)、pPL和pKK223(Pharmacia，Piscataway，NJ)、pQE50(Qiagen，Chatsworth，CA)和pGEM-T EASY(Promega，Madison，WI)等。可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型真核表达载体包括蜕皮激素诱导型哺乳动物表达系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)、基于巨细胞病毒启动子-增强子的系统(Promega，Madison，WI；Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen)，和基于杆状病毒的表达系统(Promega)等。
可用于实施本发明的宿主细胞可以是真核或原核细胞。这样的宿主细胞包括但不只限于微生物，例如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA载体转化的细菌，或者用重组载体转化的酵母，或者是动物细胞，如用重组病毒载体如杆状病毒感染的昆虫细胞，或用重组病毒载体如腺病毒或痘苗病毒感染的哺乳动物细胞等。例如，可使用大肠杆菌菌株，如DH5α菌株。真核宿主细胞包括酵母细胞，但也可有效地利用小鼠、仓鼠、牛、猴或人细胞系等哺乳动物细胞。可用于表达本发明的重组蛋白质的真核宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NIH/3T3等。
含有本发明多肽的药物组合物可用于多种治疗目的，本发明的药物组合物不仅用于治疗慢性肾衰引起的贫血，还可以用于治疗AZT治疗AIDS病人后诱导的贫血、肿瘤引起的贫血和肿瘤化疗引起的贫血、早产儿贫血、类风湿关节炎引起的贫血以及在手术前给予增加病人自体血液回输的量，在手术前后应用刺激骨髓细胞使手术中的失血得到较快的代偿。
本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、静脉内给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的多肽药物组合物制成各种合适的剂型，其中包含至少一种有效剂量的本发明的多肽和至少一种药学上可接受的药用载体。
适当剂型的实例为片剂，胶囊，糖衣片剂，粒剂，口服溶液和糖浆，用于皮肤表面的油膏和药贴，气雾胶，鼻喷剂，以及可用于注射的无菌溶液等。
含有本发明多肽的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉末以用于胃肠外给药。在使用前可加入适当溶剂或其它可药用的载体将粉末重新配制。液体配方一般是缓冲液、等渗溶液和水溶液。
剂型中还可含有其它常规组分，如防腐剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲液、调节渗透压的盐、乳化剂、增甜剂、着色剂、调味剂等等。本发明药物组合物中使用的稳定剂优选柠檬酸钠、甘氨酸、甘露醇、神经节糖苷等。含有本发明药物组合物的注射水针或冻干粉针更优选的配方包括，rhEPO-Fc 25-500μg，NaCl 4mg，磷酸盐3.02mg，甘氨酸5.0-20mg或甘露醇10-30mg，注射用水0.5ml。
若有特殊治疗要求，本发明的药物组合物还可包含其他活性药理成分，这种相伴使用有利于治疗。
本发明药物组合物中多肽的用量可以在一个较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些已知的因素，诸如根据疾病的种类、病情严重程度、病人体重、剂型、给药途径等因素很容易的加以确定。
本发明的优点1.在分子数相同时与天然EPO相比，具有类似的生物活性。
2.在动物的药代试验中显示出显著延长的半衰期。
3.选择IgG2的Fc片段作为融合片段，避免副作用的产生。
4.表达量高，稳定性好，易于放大生产，成本低廉。
本发明的工程细胞连续传代103代后，仍能稳定分泌表达rhEPO-Fc融合蛋白。通过滚瓶培养方式进行培养，用ELISA方法检测培养上清中的表达量，统计30余次的数据，表达量均在40～65mg/L/3d。每次细胞培养的规模都在30～40L左右。滚瓶培养方式的一个特点，就是便于在一定规模下放大生产，通常可方便地放大到350～400L。在纯化方面，由于融合蛋白在细胞培养上清中含量高，而纯化工艺中的rProteinA Sepharose FF亲和层析步骤具有很高的纯化效率，每毫升凝胶可结合50mg左右的融合蛋白，更易于放大生产。EPO-Fc融合蛋白的临床使用剂量很小，为微克级剂量。预计每个剂量小于100μg。因此，其生产成本更为低廉。
附图简要说明

图1.显示重组质粒pEPO-Fc的构建过程。
图2.显示Epo的RT-PCR结果(1％Agarose电泳)，其中泳道M为DNA分子量标准(Roche DNA M.W.Marker VIII)，泳道C为阴性对照，泳道1和2为RT-PCR产物。
图3.显示IgG2Fc的RT-PCR结果(1％Agarose电泳)，其中泳道M为DNA分子量标准(Roche DNA M.W.Marker VIII)，泳道1和2为RT-PCR产物。
图4.显示重组质粒pUC18-Epo的酶切鉴定结果(1％Agarose电泳)，其中泳道M为分子量标准，3、4、6和9分别代表3、4、6和9号克隆。
图5.显示重组质粒pUC18-Epo-Fc的酶切鉴定结果(1％Agarose电泳)，其中泳道M为分子量标准，1、5、6、7、8、9和12分别代表1、5、6、7、8、9和12号克隆。
图6.显示重组质粒pEpo-Fc的酶切鉴定结果(1％Agarose电泳)。
图7.显示不同克隆的基因组DNA的PCR扩增结果(1％Agarose电泳)，其中泳道C1为阳性对照(以pEpo-Fc为模板)，泳道1为B4-3克隆，泳道2为A1-6克隆，泳道3为C1-5克隆，泳道4为A6-5克隆，泳道C2为阴性对照。
图8.显示不同克隆的总RNA的RT-PCR扩增结果(1％Agarose电泳)，其中泳道M为DNA分子量标准(1kb DNA ladder)，泳道C1为阴性对照，泳道C2为阳性对照(以pEpo-Fc为模板)，泳道1为B4-3克隆，泳道2为A1-6克隆，泳道3为C1-5克隆。
图9.显示纯化后蛋白的电泳图谱(12％SDS-PAGE)，其中泳道M为蛋白质分子量标准(Promega)，泳道S为纯化后的样品。
图10.显示rhEPO-Fc与天然rhEPO半效量比较(细胞依赖株检测法)。
实施例实施例一Epo目的基因及人IgG2Fc片段基因的获得我们采用RT-PCR方法从正常人血液提取的总RNA中扩增Epo的cDNA片段。根据Epo基因序列设计的引物为5’引物5’CTC CAA GCT TGC TAG CAT GGG GGT GCA CGA ATG TCC TG 3’(SEQID NO7)3’引物5’GCG GAT CCT CTG TCC CCT GTC CTG CAG GCC TC 3’(SEQ ID NO8)为了能将PCR产物直接插入克隆载体，我们在5’引物中引入了Hind III和NheI酶切位点，在3’引物中引入了BamH I酶切位点。
RT-PCR反应条件如下RT-PCR反应混合物在50℃变性30分钟后，按下列条件进行反应逆转录反应94℃变性30秒；55℃退火30秒；68℃延伸45秒，反应10个循环。
PCR反应94℃变性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸45秒，反应25个循环。然后68℃再延伸12分钟。
反应完成后，1％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物。如图2所示，我们得到了预计大小的DNA片段(约590bp)。经测序，扩增的Epo cDNA片段的核苷酸序列为SEQ IDNO1，其氨基酸序列为SEQ ID NO2。
同时，我们设计如下引物扩增IgG2Fc片段cDNA5’引物5’CGG GAT CCG AGC GCA AAT GTT GTG TCG AGT GC 3’(SEQ ID NO9)3’引物5’GGA ATT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AGG 3’(SEQ ID NO10)为了能将PCR产物插入克隆载体，我们在5’引物中引入了BamH I位点，在3’引物中引入了EcoR I位点。
以正常人淋巴细胞总RNA为模板，RT-PCR扩增IgG2Fc片段，反应条件如下RT-PCR反应混合物在50℃变性30分钟后，按下列条件进行反应逆转录反应94℃变性30秒；55℃退火30秒；68℃延伸1分钟，反应10个循环。
PCR反应94℃变性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸1分钟，反应25个循环。然后68℃再延伸12分钟。
反应完成后，1％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物。如图3所示，我们得到了预计大小的DNA片段(约700bp)。经测序，扩增的IgG2Fc cDNA片段的核苷酸序列为SEQ ID NO3，其氨基酸序列为SEQ ID NO4。
实施例二重组质粒的构建如上所述，我们在用于扩增Epo cDNA的5’引物中引入了Hind III酶切位点，在3’引物中引入了BamH I酶切位点，这样可将Epo的cDNA片段直接插入克隆载体pUC18的多克隆位点Hind III/BamH I中，IgG2Fc片段插入到pUC18的多克隆位点BamH I/EcoRI中，即可得到Epo-Fc融合片段。测序鉴定后，再用Nhe I和EcoR I回切插入表达载体pcDNA3.1的多克隆位点Nhe I/EcoR I中，即可得到真核表达质粒pEpo-Fc。其构建过程详见图1。
1.重组质粒pUC18-Epo的构建将在实施例1中扩增的Epo cDNA片段插入pUC18(市售)的Hind III/BamH I位点，将连接产物pUC18-Epo转化大肠杆菌JM109，随机挑选12个克隆进行筛选。重组质粒pUC18-Epo的酶切鉴定结果见图4。3、4、6号克隆均用BamH I/Hind III回切出目的片段，选3号克隆进行测序鉴定，并用于下一步的构建。
2.重组质粒pUC18-Epo-Fc的构建以pUC18-Epo 3号克隆为基础，将在实施例1中扩增的IgG2Fc cDNA片段插入BamH I/EcoR I位点。将连接产物pUC18-Epo-Fc转化大肠杆菌JM109，随机挑选12个克隆进行筛选。重组质粒pUC18-Epo-Fc的酶切鉴定结果见图5。1、5号克隆均用BamHI/EcoR I回切出目的片段，选1号克隆送去测序鉴定。
3.插入基因片段——Epo及IgG2Fc的序列测定选择重组质粒pUC18-Epo-Fc的1号克隆用PE公司的377全自动测序仪进行测序，经测序，插入的融合蛋白Epo-Fc片段的核苷酸序列为SEQ ID NO5，其氨基酸序列为SEQ ID NO6。测序结果表明我们所得到的重组质粒中的目的基因与发表的Epo基因与IgG2Fc基因序列一致。
4.真核表达载体pEpo-Fc的构建将Epo-IgG2Fc片段从pUC18-Epo-Fc的1号克隆切下来，插入到pcDNA3.1(市售)的Nhe I/EcoR I位点，得到重组质粒pEpo-Fc。将pEpo-Fc转化大肠杆菌JM109，随机挑选12个克隆进行筛选。重组质粒pEpo-Fc的酶切鉴定结果见图6。2、3、4、5、9、10、12号克隆均用Nhe I/EcoR I回切出目的片段，选10号克隆进行下一步的CHO稳定表达株的筛选。
实施例三CHO稳定表达株(CHO-EF细胞)筛选及鉴定取10μg大量制备的实施例2中的pEpo-Fc质粒，利用脂质体Lipofectin转染CHO细胞。两天后按1∶5的比例传代，加入0.4mg/ml的G418筛选，10天可见克隆形成。随机消化144个边缘明显分开、细胞状态良好的单克隆接种于6个24孔板培养(第一轮筛选)。
取三天后的培养上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，从中选出表达阳性的39个克隆分别接种于2个24孔板(第二轮筛选)及1个6孔板(用于保种)，培养4天后，取上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，从中选取表达较高的6个克隆A1-6、C1-5、B4-3、B5-5、A6-4、A6-5进一步用有限稀释法进行筛选。
分别接种96孔板(5细胞/孔/200μl)(第三轮筛选)，待细胞长满后(大约13天后)，取培养上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，B4-3、A6-4、C1-5均为均一的克隆，分别挑取表达较高的6个克隆接种24孔板，各平行接2孔。待细胞长满后，其中一孔用于保种，另一孔接种6孔板。待6孔板内的细胞长满后，抽提基因组DNA和总RNA，用PCR鉴定整合入基因组的插入片段的存在情况，用RT-PCR鉴定插入片段的转录(即表达)情况。结果如图7和8所示，B4-3、A6-4、C1-5均为正确的克隆。
分别取B4-3(C3)、A6-4(B4)、C1-5(D8)接种96孔板(1细胞/孔/200μl)(第四轮筛选)，待细胞长满后(大约15天后)，取培养上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，三个克隆均为均一的克隆，将其中表达最高的分别扩增、保种，进行下一步表达和纯化。pEpo-Fc转化CHO细胞后，将稳定表达的细胞命名为CHO-EF细胞。
实施例四制备rhEPO-Fc融合蛋白大规模培养CHO-EF细胞，经离心后上清液用1M的NaOH调节pH至7.3，用以10mMPB(pH7.3)平衡的rProtein A-Sepharose F.F.(Parmacia)亲和层析柱进行吸附，再用同样的缓冲液洗涤亲和柱至280nm的OD值小于0.01。用0.05～0.1M的柠檬酸缓冲液将融合蛋白洗下，收集洗脱峰并立即用200mM Na2HPO4调节pH至7.0。样品浓缩后，上分子筛Superdex 200prep grade柱预先用20mMPBS(含150mMNaCl，pH7.2)缓冲液平衡，将浓缩后的样品上样纯化。纯化后的蛋白电泳图谱见图9，纯度可达到98％以上。
实施例五制备以rhEPO-Fc为活性组份的注射剂/冻干剂配方rhEPO-Fc100mgNaCl8gNa2HPO4·12H2O 5.16gNaH2PO4·2H2O 0.874g甘氨酸 15g甘露醇 30g注射用水1000mlpH值7.2无菌过滤后分装成0.5ml/支的注射水针剂或冻干，制成冻干粉针。
实施例六rhEPO-Fc在猕猴体内的药代动力学本研究采用ELISA试剂盒测定猕猴血清中rhEPO-Fc浓度，并得出相应的药代动力学参数。同时还进行方法学确证，包括方法回收率、精密度、准确度和灵敏度等。
1、分组和剂量该试验共分2组，分别是阳性EPO对照组、rhEPO-Fc剂量组，每组3只猕猴。具体分组安排如下(1)EPO对照组—皮下给药(等摩尔剂量)，即2.5ug/kg(2)rhEPO-Fc中剂量单次给药组-皮下单次给药10ug/kg2、采血点设计rhEPO-Fc组于皮下给药后4h、8h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、168h、216h采血测定血清中rhEPO-Fc的浓度；阳性EPO对照组于皮下给药后15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、8h、12h、24h采血测定血清中rhEPO-Fc的浓度。
同时，每组还要进行血液学指标的检测，检测时间点为48h、120h、216h、312h、384h、480h、552h和648h，检测的血液学具体指标是网织细胞计数(RTC)、RBC和HB。
3、药代动力学结果皮下给予阳性EPO后，2h达到最大浓度，浓度为30.4±1.8ng/ml；AUC0-24221.6±45.7ng.Equ.h·mL-1；MRT为6.9±0.4h；CL为10.2±2.0mL·h-1·kg-1；Vss为70.4±10.1mL·kg-1；消除半衰期为7.4±0.3h。
皮下给予rhEPO-Fc后，达峰时间为8h，达峰浓度为76.6±2.4ng/ml；AUC0-216为2715.1±289.0ng.Equ.h·mL-1；MRT为42.7±1.0h；CL为3.7±0.4mL·h-1·kg-1；Vss为156.9±15.6mL·kg-1；消除半衰期为33.2±4.5h。
实施例七重组人长效促红细胞生成素(rhEPO-Fc)药效学一、rhEPO-Fc给药剂量设定在本试验中我们将试验药rhEPO-Fc与阳性对照药EPO进行比较。根据文献报道并结合临床给药方案，选用一个有效剂量，阳性EPO暂定500U/kg.day，每周给药三次，连续用药四周。rhEPO-Fc的剂量范围设定阳性药EPO组的等摩尔量15μg/kg。作为长效制剂，rhEPO-Fc的给药周期和频率定为每周一次，连续给药四周。本实验的检测时间点为每周检测一次、给药前和末次给药后一周，进行生化和血液学指标的动态检测，以进行时效关系的判定。
二、大鼠治疗前后体重变化和体态变化试验大鼠自每日给予腺嘌呤灌胃给药后，前七天由于药物作用还未体现，所以体重增加很大，后七天受腺嘌呤的作用影响，体重增加很少甚至降低。给药第七天开始，大鼠饮水量、尿量均增加，同时伴有困盹、萎靡，活力下降；体毛逐渐干枯、僵变，部分还出现脱毛现象。给药rhEPO-Fc十天后，大鼠精神状态、活动能力明显改善，体毛开始光滑润泽，体重明显增加很快。
三、肾衰模型前后大鼠血液、生化学指标变化在给药腺嘌呤7天后，所有大鼠血肌酐(Cr)和血清尿素氮(BUN)都逐渐上升，而RBC、Hb、Hct和网织红细胞计数(RTC)等逐渐下降。20天模型建成后，与试验前相比，Cr、BUN值有显著增加，RBC、Hb值呈显著下降，Hct值也降低，RTC值降低到接近0。表明腺嘌呤已经使肾功能损坏，造成贫血。
四、rhEPO-Fc对大鼠肾功能的影响肾衰模型建立后，rhEPO-Fc治疗前大鼠的肌酐和血清尿素氮值见表1，治疗后的见表2和表3。用rhEPO-Fc治疗后，给药组大鼠的Cr和BUN逐渐回落，但仍然明显高于正常大鼠对照组，表明肾脏功能仍然处于衰退状态，rhEPO-Fc不能纠正肾衰表现。
五、对肾衰大鼠贫血的治疗作用经阳性对照EPO和rhEPO-Fc治疗后，红细胞、血红蛋白和红细胞压积与治疗前相比，均有不同程度的提高，rhEPO-Fc与对照药治疗效果一致。
表1用药前各组的血液学和生化学指标(n＝10)

表2用药15天后血液学和生化学指标(n＝10)

表3用药30天后血液学和生化学指标(n＝10)

实施例八rhEPO-Fc融合蛋白与EPO体外活性比较收集UT-7细胞，用完全培养基洗涤1次，计数，调整密度至1.5×105/ml，将rhEPO-Fc和EPO稀释至约2μM，在96孔培养板中4倍稀释10个浓度梯度，每个稀释度保留体积100μl，然后接种100μl细胞悬液至各个稀释度，培养48小时后，加入5mg/ml MTT(噻唑蓝)20μl，继续培养4.5小时，小心去除150μl上清后补加相同体积的DMSO(二甲基亚砜)，充分裂解混匀，酶标仪测定OD490/655。其半效量(EC50)基本一致(见图10)。
应当理解的是，通过上述具体的实施例，更容易理解本发明。上述实施例只是举例描述，但是不打算将本发明限制于具体的实施方式。在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明作出各种修改和改良，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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序列表<110>北京博康健基因科技有限公司<120>长效人促红细胞生成素融合蛋白及其制备和纯化方法<160>10<170>Patent In Version 3.0<210>1<211>582<212>DNA<213>人<400>1atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctgcga 420gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582<210>2<211>166<212>PRT<213>人
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<400>10cgggatccga gcgcaaatgt tgtgtcgagt gc 3权利要求
1.一种重组人促红细胞生成素(rhEPO)-Fc融合蛋白，其特征在于该融合蛋白是包含SEQ ID NO6所示氨基酸序列的多肽，或其片段、同源物、类似物或衍生物。
2.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于该融合蛋白是由SEQ ID NO6所示氨基酸序列构成的多肽。
3.一种编码权利要求1或2融合蛋白的多核苷酸分子，其特征在于它是选自下列核苷酸序列中的一种(1)包含SEQ ID NO5的核苷酸序列；(2)与SEQ ID NO5所示核苷酸序列至少70％相同的核苷酸序列；(3)在严谨杂交条件下能与SEQ ID NO5或其互补序列的多核苷酸分子杂交的核苷酸序列；(4)编码与SEQ ID NO6相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
4.根据权利要求4的多核苷酸分子，其中所述的多核苷酸分子是SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
5.含有权利要求3或4的多核苷酸分子的重组表达载体。
6.根据权利要求5的重组表达载体，其中该重组表达载体是真核表达载体。
7.根据权利要求6的重组表达载体，其中该真核表达载体是pEpo-Fc。
8.含有权利要求5-7中任一项所述重组表达载体的宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是CHO细胞。
10.制备权利要求1或2所述融合蛋白的方法，其特征在于该方法包括在适于表达该融合蛋白的条件下培养权利要求8或9的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收和纯化该融合蛋白的步骤。
11.纯化权利要求1或2所述融合蛋白的方法，其特征在于权利要求8或9的宿主细胞经细胞培养、离心后，上清液分别用亲和层析和分子筛层析纯化。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于亲和层析中使用的是rProtein ASepharose FF亲和层柱。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于分子筛层析中使用的是Superdex 200prep grade柱。
14.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物含有作为活性成分的权利要求1或2的融合蛋白以及药学上可接受的载体。
15.根据权利要求14的药物组合物，其中该药物组合物是适于通过静脉内、皮下、肌肉、鞘内、鼻腔粘膜、口腔粘膜等途径给药的剂型。
16.权利要求1或2所述的融合蛋白在制备治疗贫血症的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述贫血症是慢性肾衰引起的贫血症、AZT治疗AIDS病人后诱导的贫血、肿瘤引起的贫血、肿瘤化疗引起的贫血、早产儿贫血以及类风湿关节炎引起的贫血等。
全文摘要
本发明公开了一种利用基因工程方法生产的重组人促红细胞生成素(rhEPO)－Fc融合蛋白，编码该融合蛋白的多核苷酸以及制备和纯化该融合蛋白的方法，其中该融合蛋白由人促红细胞生成素和人IgG2的Fc片段组成。该融合蛋白可在哺乳动物细胞中高效表达，且纯化工艺简单，利于进一步的大规模制备。本发明所获得的rhEPO－Fc融合蛋白与天然EPO比较，具有血清半衰期更长的特点，同时在相同分子数基础上仍保持与天然EPO相似的生物活性。可用于治疗各种原因引起的贫血症，包括慢性肾衰引起的贫血、AZT治疗AIDS病人后诱导的贫血、肿瘤引起的贫血、肿瘤化疗引起的贫血、早产儿贫血以及类风湿关节炎引起的贫血等。
文档编号C12N15/62GK1872881SQ200610072229
公开日2006年12月6日 申请日期2006年4月14日 优先权日2006年4月14日
发明者刘劲玮, 韩为跃, 何凯, 刘德林, 杨立明, 阳勇 申请人:北京博康健基因科技有限公司