专利名称：一种辅助筛选高油大豆品种的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域中一种辅助筛选高油大豆品种的方法及其专用引物。
背景技术：
大豆的大部分农艺性状是由多基因或QTL控制的数量性状，在这样一个多基因体系中，每个基因对目标性状只表现微效作用，没有明显的显性，而且表现型受环境条件影响很大。因而采用传统的育种途径对这些性状进行选择有很大的难度。分子标记辅助选择为数量性状的改良提供了新的研究思路。Paterson等(Paterson A H，Landon E S，Hewitt J D，et al.Resolution of quantitativeinto Mendelian factors by using acomplete RFLP linkage map.Nature，1988，335721-726)认为高密度分子遗传图谱的建立，使覆盖全基因组的分子标记将控制数量性状的微效多基因分解成孟德尔遗传因子，并定位到分子标记所在的染色体上，进而按照经典遗传模式进行研究。这就使得利用与QTL紧密连锁的分子标记对这些QTL进行转移以达到对这些数量性状的改良成为可能。
微卫星是以少数几个核苷酸为核心单位多次串联重复的DNA序列，是一种简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)，两侧一般是保守序列。由于它具有多态性高、共显性、容易用PCR检测和结果稳定可靠等特点，因此是一种十分理想的分子标记。
油分是大豆重要的品质性状和数量性状，利用分子标记技术寻找与高油基因连锁的分子标记一直是大豆数量性状定位研究中的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助筛选高油大豆品种的方法及其专用引物。
本发明所提供的用于辅助筛选高油大豆品种的引物，名称为Satt160，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述反向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列。
本发明所提供的辅助筛选高油大豆品种的方法，是以待测大豆的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测大豆得到450-500bp的DNA片段，则该待测大豆为候选高油大豆品种。
实验证明，以24个大豆品种品系的总DNA为模板，以用Satt160引物进行PCR扩增，扩增得到的带型与高油亲本黑农45的带型的符合率为83.33％。说明Satt160引物可用于高油大豆的辅助选择。本发明的辅助筛选高油大豆品种的方法将在高油大豆的育种中发挥重要作用，为选育高油大豆提供了一种快捷的选择方法。
图1为部分SSR引物多态性筛选结果图2为satt160引物在120个单株中的PCR扩增结果图3为6个连锁群的分子遗传图谱图4为satt160引物在24个大豆品种品系及亲本中的PCR扩增结果具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的大豆品种品系均可从商业途径获得。
实施例1、与大豆高油基因连锁的分子标记的获得1、多态性SSR引物的筛选以高蛋白大豆品系哈交99-5448-4为父本和高油大豆品种黑农45作为母本，配制杂交组合。杂种F1代种子温室种植。F2代种子在实验田种植，小区行长3米，株距10厘米，获得F2:3家系，共120个单株，作为供试分离群体。通过田间鉴定和室内鉴定对亲本和群体农艺性状进行考察。
参照Cregan(Cregan P B，Jarvik T.An integrated genetic linkage map ofthe soybean genome.Crop Sci，1999，35(5)1464-1490)的“大豆公共图谱”选择SSR引物，选择的标准之一是座位分布均匀，二是基因多样性程度高。选择基本覆盖大豆全基因组的239对SSR引物(见表1)SSR引物的序列在大豆数据库SoyBase中获得，网站地址是http//www.soybase.com/。
表1 本实验所使用的239对SSR引物
分别从供试分离群体中的120株供试单株、两个亲本植株哈交99-5448-4和黑农45上取大小约为2cm2的嫩绿叶片，置于1.5ml离心管中，向离心管中加入少量液氮，用玻璃棒或不锈钢锥子将冻干的叶片迅速捣碎(无液氮时可直接用玻璃棒将叶片捣碎)，备用。DNA提取采用SDS法(关荣霞，常汝镇，邱丽娟.用于SSR分析的大豆DNA的快速提取.大豆科学，2003，21(1)73-74)。在上述装有备用材料的1.5ml离心管中加入400μl预热的SDS提取液(含100mmol/L Tris-HCl pH8.5，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，2％SDS)，65℃水浴30min，冷却后加入等体积酚/氯仿(1∶1)，充分混匀，静置10min，1000rpm离心5min，取上清液于另一新离心管中，加入2倍体积无水乙醇6000rpm离心2min，弃上清，用70％乙醇洗DNA沉淀一次，风干，加300μl超纯水溶解。
PCR反应在PCR扩增仪ABI-9700上进行。20ul反应体系中含有50-100ng基因组DNA模板，1×PCR缓冲液、1.25mM MgCl2、0.2mM dNTP、0.2μM SSR引物和1U Tag DNA聚合酶。PCR反应程序为先95℃4min预变性；再95℃ 30s，47℃ 30s，72℃ 30s，35个循环。72℃ 10min后，于4℃保存。扩增产物用测序胶(6％聚丙烯酰胺，8mol/L尿素)分离，银染技术检测。检测结果表明所有251对SSR引物均扩增出稳定的产物，其中48对SSR引物具有多态性，多态性引物频率为25.1％(图1)，该48对SSR引物为(见表2)。
表2 48对在亲本间产生多态性的SSR引物
2、多态性SSR标记的分离分析将这48对多态性引物逐一在F2分离群体(120个单株)中进行展开，所得扩增产物经电泳后进行银染检测，统计银染的带型并记录数据。经x2检验，其中有41个SSR标记在群体中呈1∶2∶1的分离比例，占85.42％，符合共显性标记的遗传特征，该41个SSR标记中的satt160引物在120个单株中的PCR扩增结果如图2所示；有7个SSR标记呈现偏分离，5个SSR标记偏向黑农45，2个SSR标记偏向哈交00-5448-4，偏分离引物的比例为14.58％，与Keim等(Keim，P.，B.W.Diers，T.C.Olson，and R.C.Shoemaker.1990.RFLP mapping in soybeanAssociationbetween marker loci and variation in quantitative traits.Genetics126735-742.)报道的13.3％相近，但低于张德水等(张德水，董伟，惠东威，陈受宜，庄炳昌.用栽培大豆与野生大豆间的杂种F2群体构建基因组分子标记连锁图谱框架图.科学通报，1997，42(2)1326-1330)报道的25.0％和吴晓雷等(吴晓雷，王永军，贺超英，陈受宜，盖钧镒，王学臣.大豆重要农艺性状的QTL分析.遗传学报，2001a，28(10)947-955)报道的21.7％。各标记的杂合率在39.58％～59.90％之间，平均49.74％，基本符合F2群体的遗传特征。分离群体中标记的偏分离现象普遍存在，与已有的报道相比，本研究群体的偏分离标记比例较小，这与吴晓雷等(吴晓雷，王永军，贺超英，陈受宜，盖钧镒，王学臣.大豆重要农艺性状的QTL分析.遗传学报，2001a，28(10)947-955)的结果相似，他们也认为从不同类型的分子标记位点的偏分离情况来看，SSR位点偏分离比例最低。
3、SSR遗传图谱的构建利用筛选的48个多态性SSR标记，在分离群体中，对个体进行SSR座位进行等位变异统计，与父本带型相同的等位变异记录为“A”，与母本带型相同的等位变异记录为“B”，杂合带型记录为“H”，数据缺失记录为“-”。应用软件MAPMAKER/EXPV3.0(Lander等，1987)进行图谱的构建。利用“Group”命令进行标记间的连锁分析和分组(LOD＝3.0)，连锁标记数小于8个的使用“Compare”命令进行排序，标记数大于等于8个的要重复使用Ripple命令进行排序。利用QTL Cartographer1.1软件进行复合区间作图，LR值11.5(LOD值2.5)为阈值对QTL进行定位和效应估算。结果得到一张包括6个连锁群的分子遗传图谱(图3)，图谱上的SSR标记数为18个，没有连锁的SSR标记为30个，整个图谱覆盖的基因组长度为306cM，平均长度为17cM，符合QTL定位的要求。而且与公共图谱(Cregan P B，Jarvik T.An integrated genetic linkage map of the soybean genome.CropSci，1999，35(5)1464-1490)进行比较，结果表明6个连锁群完全可以与公共图谱中的连锁群对应上。图3中，连锁群(LG)中的数字表示相邻的两个SSR标记或QTL和相邻的SSR标记之间的遗传距离。
利用Mapmaker QTL1.1进行QTL定位，在连锁群F上定位了一个控制大豆油分含量的QTL，此QTL位于satt160-satt193这个区间内，与satt160的遗传距离是26.0cM，其遗传贡献率为23.2％。
其中，Satt160的引物序列为正向引物TCC CAC ACA GTT TTC ATA TAA TATA，反向引物CAT CAA AAG TTT ATA ACG TGT AGA T。
实施例2、利用satt160引物辅助筛选高油大豆品种实验材料包括父本高蛋白大豆品系哈交99-5448-4、母本高油大豆品种黑农45和表1中的24个材料。
表3 用于分子标记辅助选择的大豆品种品系
上述大豆材料的种子取单粒磨成豆粉，分别置于1.5ml离心管中，4℃保存，按照实施例1的方法提取基因组DNA。
用父本高蛋白大豆品系哈交99-5448-4、母本高油大豆品种黑农45和表3中的24个材料的分子标记辅助选择，具体方法如下利用引物satt160，按照实施例1的方法对这26个品种品系的DNA进行PCR扩增，电泳检测，结果如图4所示，表明有12个材料(黑农44、黑农45(与P2同)、Hobbit、合丰25、合丰43、垦农4、垦农18、辽豆14、M14、嫩丰17、中32、5186)具有高油亲本黑农45所扩增出来的DNA片段，检测符合率达到了50％，其中所检测到的高油品种中只有二个材料(合丰25、5186)不是高油品种品系，在检测到的高油品种中的符合率达到了83.33％，说明与satt160这个标记连锁的高油基因同时在这10份材料中能够找到，从而达到了利用分子标记进行辅助选择的目的。图4中，P1为哈交99-5448-4，P2为黑农45，1至24对应表3中的品种。
序列表<160>2<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1tcccacacag ttttcatata atata 25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2catcaaaagt ttataacgtg tagat 2权利要求
1.用于辅助筛选高油大豆品种引物，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述反向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列。
2.一种辅助筛选高油大豆品种的方法，以待测大豆的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测大豆得到450-500bp的DNA片段，则该待测大豆为候选高油大豆品种。
全文摘要
本发明公开了一种辅助筛选高油大豆品种的方法及其专用引物。该辅助筛选高油大豆品种的方法，以待测大豆的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测大豆得到450－500bp的DNA片段，则该待测大豆为候选高油大豆品种。
文档编号C12Q1/68GK1876842SQ200610076250
公开日2006年12月13日 申请日期2006年4月21日 优先权日2006年4月21日
发明者刘丽君, 杨喆, 吴俊江, 高明杰, 蒲国锋, 张雷 申请人:黑龙江省农业科学院大豆研究所