专利名称：一种大肠杆菌自裂解方法及其专用载体与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及大肠杆菌自裂解方法及其专用载体与应用，特别是涉及一种大肠杆菌自裂解方法及其专用载体与该方法在高通量筛选胞内酶中的应用。
背景技术：
分子定向进化技术(Molecular Directed Evolution)是由美国工程院院士、加州理工学院(California Institute of Technology)化工系教授Frances Arnold于90年代初期开发出来的(Frances H.Arnold，Combinatorial and computationalchallenges for biocatalyst design.Nature.2001，409253-257)。该技术是基因工程、蛋白质结构和计算技术互补发展和渗透的结果，标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造蛋白质(酶)，甚至设计出自然界中原本不存在的全新蛋白质(酶)。
分子定向进化技术，简单地说就是模拟达尔文的自然进化原理，在实验室的试管中将编码某一蛋白质(酶)的基因用随机突变(random mutagenesis)和随机杂交、重组的方法以产生大量的突变，构建突变库，然后根据特定功能指标对这些蛋白质(酶)的变种逐一进行筛选(screening)或者进行“适者生存”式的选择(selection)，从而得到在特定性能上的优良变种。与自然进化不同，分子定向进化技术是在人为引发条件下发生，并通过选择突变后的分子群来保留某一方向的进化而排除其它方向突变，整个进化过程完全是被事先特定的，即是定向的。
分子定向进化技术(Frances H.Arnold，Combinatorial and computationalchallenges for biocatalyst design.Nature.2001，409253-257；Frances H.Arnold.When blind is betterProtein design by evolution.NatureBiotechnology.1998，16617-618；Hyun Joo，Zhanglin Lin，and Frances H.Arnold，Laboratory evolution of peroxide-mediated cytochrome P450 hydroxylation，Nature.1999，399670-673)属于对蛋白质(酶)分子的一种“自下而上”(bottom-up)的非理性设计(irrational design)，避开了对蛋白质(酶)分子结构及其结构与功能相关性认知的要求，简单的通过模拟达尔文自然进化原理，在分子水平上对蛋白质(酶)进行随机改变，并以多步渐进的方式，从众多的基因变种库中通过筛选(或选择)得到性能改良的变种，使蛋白质在自然界需要几百万年才能完成的进化过程缩短至几年甚至几个月，大大拓宽了蛋白质(酶)工程的研究领域和应用范围，因此也说明定向进化技术具有很强的可操作性。
由于大肠杆菌(Escherichia coli)遗传背景清楚，易培养，生长快速，且具有大量可供选择的克隆载体和表达载体，因此在分子定向进化过程中选用大肠杆菌作为外源蛋白表达系统极为常见。但由于酶最初是在表达载体内部得以标定的，而酶的底物/产物都是在表达载体体外的，且多数很难透过载体细胞进入细胞，这给进化过程中的依据目标蛋白(酶)的活性而开展的高通量筛选工作带来了巨大困难，因此开发能够将具有生物活性的重组蛋白(目标蛋白)释放到菌体外或者培养基中的简易方法，将对高通量筛选具有重要意义。
目前，释放重组蛋白到菌体外的方法主要是通过破碎细胞(Anton P.J.Middelberg，Process-scale disruption of microorganisms，BiotechnologyAdvances.1995，13491-551)，包括机械方法如French press裂解、超声破碎裂解(ultrasonication)、振动磨碎(vibration mills)裂解等，和非机械方法如化学试剂裂解、碱裂解以及酶降解等方法。机械方法很难在高通量筛选中实现，而非机械方法通常需要添加化学试剂或酶，从而给后续的酶的测定带来干扰问题，并增加了高通量筛选的工序和成本(如大量一次性耗材的使用)。
以大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主的噬菌体，能够在一定的外在条件下(如温度、化学物质、紫外等)裂解细胞，使细胞内积累的产物释放。该方法具有破壁效率高、可控、操作方便等优点，为高通量筛选提供了一个可能的手段。大肠杆菌(Escherichia coli)的Lambda噬菌体是目前研究最清楚、应用最广泛的噬菌体之一。Lambda噬菌体中导致细胞裂解的基因包括S、R和Rz三个基因，其中R基因编码的是一种可溶于水的转糖基酶(transglycosylase)，可以引起肽键的水解，分解细胞壁的肽聚糖(Corchero J.L.，Rafael C.etc，Cell lysis in Escherichia colicultures stimulates growth and biosynthesis of recombinant proteins insurviving cells，Microbiol.Res.2001，15613-18)。Rz基因的产物可能是一种肽链内切酶(endopepidase)，它可以切割肽聚糖和寡糖之间和/或者肽聚糖与细胞壁外膜之间的连接(Ry Young，Bacteriophage lysisMechanism and regulation，Microbiological Reviews.1992，56430-381)。R和Rz基因产物的功能都是降解细胞壁，而S基因(Ronald R.，Gregory N.，Charles S.，Jeffery S.，Ry Young，Dominancein Lambda S mutations and evidence for translational control. J.Mol.Biol.1988，19995-105；Chung Y.C.，Kiebang N.，Ry Young，S gene Expression andthe timing of lysis by bacteriophage，J.Bacteriol.1995，1773283-3294)产物的作用是改变细胞质膜的通透性，在细胞质膜上形成多孔的结构，以使R和Rz基因的产物穿过细胞质膜，并作用于细胞壁，使细胞壁破碎，释放胞内物质。
SOS修复系统(Lewis L.K.，Harlow G.R.，Gregg-Jolly L.A.，Mount DW.，Identification of high affinity binding sites for LexA which define new DNAdamage-inducible genes in Escherichia coli.J.Mol.Biol.1994，241507-23；Celina Janion，Some aspects of the SOS response system-A criticai survey，Acta Biochimica Polonica.2001，48599-610)，是当DNA受到损伤(如紫外照射)或者DNA复制受到阻碍产生单链DNA时，就会引起一系列的SOS修复基因的大量表达，而这些基因的大量表达依赖于RecA蛋白在紫外作用下激活，水解阻遏蛋白LexA，促使阻遏蛋白下游的修复基因大量表达。其原理如图1所示，其中LexA与修复基因上游的结合区域称为SOS box，该段编码基因位于修复基因的启动子-35到-10区域内。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高通量筛选胞内酶的大肠杆菌自裂解载体。
本发明所提供的大肠杆菌自裂解载体，是自5’至3’端顺次连接有紫外启动子，噬菌体裂解基因和大肠杆菌终止子的大肠杆菌表达载体。
所述紫外启动子可为任意一种紫外诱导启动子，优选为recA启动子或umuDC启动子；所述recA启动子具有序列表中序列1的核苷酸序列，umuDC启动子具有序列表中序列2的核苷酸序列。
所述噬菌体裂解基因可为任意一种噬菌体裂解基因，优选为Lambda噬菌体的裂解基因SRRz，具有序列表中序列3的核苷酸序列。
所述大肠杆菌终止子也可为任意一种大肠杆菌终止子，优选为rrnB终止子，具有序列表中序列4的核苷酸序列。
用于构建所述载体的出发载体可为任意一种大肠杆菌表达载体，如pUC18、pUC19或pET30a等。
以pUC18为出发载体，构建的大肠杆菌自裂解载体为pUC18-recA-SRRz-rrnB或pUC18-umuDC-SRRz-rrnB。
含有所述大肠杆菌自裂解载体的重组大肠杆菌也属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种大肠杆菌的自裂解方法。
本发明所提供的大肠杆菌的自裂解方法，是将上述大肠杆菌自裂解载体导入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，再将重组大肠杆菌在紫外线下照射，大肠杆菌细胞裂解。
所述紫外线诱导强度为3000-5000J/cm2s，照射时间为30s-4min。
上述大肠杆菌自裂解方法适用于任何一种大肠杆菌。
本发明的第三个目的是提供一种胞内酶的表达筛选方法。
本发明所提供的胞内酶的表达筛选方法，包括以下步骤1)将外源基因插入到上述大肠杆菌自裂解载体中，得到胞内酶表达筛选载体；2)将步骤1)构建的含有外源基因的胞内酶表达筛选载体导入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；3)发酵重组大肠杆菌，加入诱导剂对胞内酶进行表达，然后将重组大肠杆菌在紫外线下照射，大肠杆菌细胞裂解，胞内酶释放到发酵液中；4)对发酵液中的胞内酶进行筛选，得到目的蛋白。
在上述表达筛选方法中，步骤2)中的大肠杆菌可为任意适于蛋白表达的大肠杆菌菌株，如E.coli BL21、BL21(DE3)、HB101、XL1-Blue或DH5-α等。
为提高转化效率，将步骤1)构建的含有外源基因的胞内酶表达筛选载体导入大肠杆菌的方法优选为电穿孔转化法，但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，例如，氯化钙转化法、氯化锂转化法、原生质体转化法等。
步骤3)根据具体所用的载体和宿主菌选择合适的诱导剂，如对于以pUC18或pET30a为出发载体构建的大肠杆菌自裂解载体，可采用异丙基β-D硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thigalactopyranoside，IPTG)作为诱导剂。步骤4)中可按照常规方法对发酵液中的胞内酶进行活性测定，经筛选得到活性高的目的蛋白。
本发明提供了一种大肠杆菌的自裂解方法及其专用载体。实验证明该载体可在紫外诱导下使Lambda噬菌体的裂解基因SRRz获得表达，从而使宿主细胞裂解，释放具有生物活性的外源目标蛋白到达培养基，以利于定向进化中后续的高通量筛选的进行；经报告蛋白β-半乳糖苷酶的酶活检测，裂解效率可达63.7％。此外，在紫外诱导条件下即可用本发明的载体进行胞内酶的高通量筛选，具有廉价、快捷的优点。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为SOS修复系统的原理2为pUC18-recA-SRRz-rrnB和pUC18-umuDC-SRRz-rrnB质粒的构建示意3为合成的recA启动子序列4为合成的umuDC启动子序列5为在紫外诱导启动子recA控制下裂解基因SRRz的表达及裂解效率检测结果图6为在紫外诱导启动子umuDC控制下裂解基因SRRz的表达及裂解效率检测结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有引物、基因序列合成及测序工作均由上海生工完成。
实施例1、大肠杆菌自裂解载体的构建现以pUC18(TaKaRa公司)为出发载体，构建胞内酶表达筛选专用载体pUC18-recA-SRRz-rrnB和pUC18-umuDC-SRRz-rrnB，质粒构建的示意图参见图2，具体方法如下一、pUC18-recA-SRRz-rrnB的构建1、构建重组载体pUC18-recA-rrnB1)合成recA启动子根据recA启动子的核苷酸序列(序列表中序列1)人工合成recA启动子序列，并在其5’端添加限制性内切酶Sap I识别位点，3’端添加限制性内切酶Xho I和EcoR I识别位点，序列构成如图3所示。
2)PCR扩增rrnB终止子序列根据rrnB终止子的核苷酸序列(序列表中序列4)设计PCR扩增引物，并在上游引物的5’端添加限制性内切酶EcoR I和Nco I识别位点，下游引物的5’端添加限制性内切酶Afl III识别位点，引物序列如下P1(正向引物) P2(反向引物) 提取E.coli DH5-α的基因组DNA并以此为模板，在引物P1和P2的引导下，PCR扩增rrnB终止子序列。
3)重组用限制性内切酶Sap I和Afl III对质粒pUC18进行双酶切；对PCR扩增的rrnB终止子用限制性内切酶EcoR I和Afl III进行双酶切；将两种双酶切产物与合成的recA启动子连接，将连接产物转化E.coli BL21感受态细胞，将转化细胞接种于LB抗性培养平板(每升培养基含有胰蛋白胨10.0g，酵母浸膏粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，pH7.0，氨苄青霉素(Ampicillin)50μg/mL)筛选阳性克隆，提质粒，得到连接有recA启动子和rrnB终止子的重组质粒，命名为pUC18-recA-rrnB。
2、PCR扩增Lambda噬菌体SRRz裂解基因根据SRRz裂解基因的核苷酸序列(序列表中序列3)设计PCR扩增引物，并在上游引物的5’端添加限制性内切酶Xho I识别位点，下游引物的5’端添加限制性内切酶Nco I识别位点，引物序列如下P3(上游引物) P4(下游引物) 提取Lambda噬菌体(Lambda DNA，Sam7)的基因组DNA并以此为模板，在引物P3和P4的引导下，PCR扩增SRRz裂解基因，并在基因两端分别添加限制性内切酶XhoI和Nco I识别位点(由于Lambda噬菌体的SRRz基因是“S”缺失的，现运用定点突变的方法去掉“S”基因中的终止密码子，从而获得具有完整功能的SRRz裂解基因)。
3、pUC18-recA-SRRz-rrnB的获得对重组质粒pUC18-recA-rrnB和PCR扩增的SRRz基因用限制性内切酶Xho I和Nco I进行双酶切，连接，再将连接产物转化E.coli BL21感受态细胞，将转化细胞接种于与步骤1相同的LB抗性培养平板筛选阳性克隆，提质粒，得到连接有recA启动子、SRRz和rrnB终止子的重组质粒，命名为pUC18-recA-SRRz-rrnB。
二、pUC18-umuDC-SRRz-rrnB的构建1、umuDC启动子的合成根据umuDC启动子的核苷酸序列(序列表中序列2)人工合成umuDC启动子序列，并在其5’端添加限制性内切酶Sap I识别位点，3’端添加限制性内切酶Xho I识别位点，序列构成如图4所示。
2、pUC18-umuDC-SRRz-rrnB的获得对重组质粒pUC18-recA-rrnB和PCR扩增的umuDC启动子用限制性内切酶Sap I和Xho I进行双酶切，连接，再将连接产物转化E.coli BL21感受态细胞，将转化细胞接种于与步骤一相同的LB抗性培养平板筛选阳性克隆，提质粒，得到连接有umuDC启动子、SRRz和rrnB终止子的重组质粒，命名为pUC18-umuDC-SRRz-rrnB。
实施例2、以β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)作为报告蛋白的SRRz裂解基因的效果检验挑选实施例1中分别携带有大肠杆菌自裂解质粒载体pUC18-recA-SRRz-rrnB和pUC18-umuDC-SRRz-rrnB的阳性克隆，分别接种于LB液体培养基中，在30℃、250rpm下摇瓶培养至OD600值为0.4-0.5时，用终浓度1mM的IPTG诱导报告蛋白β-半乳糖苷酶的表达，诱导培养1小时至OD600值为0.8-1.0，再在紫外线(UV)强度为3840J/cm2s下(6mL菌液/培养皿)诱导40s，然后在相同条件下继续培养2，4，6小时及过夜(18-20小时)培养后收获细胞，测定细胞内、外的β-半乳糖苷酶酶活(Miller J.H.，Experiments in Molecular Genetics，352-355，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1972))，同时计算各个时间点的裂解效率。每个样品平行做3次，同时设立对照组(未经紫外线照射)。
其中，胞内酶(β-半乳糖苷酶)的提取方法包括以下步骤1)于紫外诱导后培养0，2，4以及过夜(18-20小时)后，分别收获0.5mL的菌液，13000rpm离心5min，取上清测胞外酶活性(活性测定方法可参考Sambrook J.，Russell，D.W.Molecular cloningA laboratory Manual，3rded.Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(2001))；2)加入0.5mL细菌裂解缓冲液(50mM pH 7.2 Tris-Cl，5％甘油，50mM NaCl)重悬细胞；3)将重悬细胞液置于液氮中冷冻1min，取出放置在25℃水浴中融化，如此反复冻融3次；4)于1.5mL EP管中超声破碎；5)向悬液中加入溶菌酶至终浓度为0.2mg/mL，于脱色摇床上室温平缓摇动(100rpm)1小时；6)13,000rpm离心4min，取上清进行酶活性测定，所测酶活即为胞内酶活。
β-半乳糖苷酶活性的检测方法(酶标仪)和裂解效率计算方法如下β-半乳糖苷酶的活性是通过显色底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(oNPG，购自Sigma公司)来测定的，产物在420nm处有最大吸收峰，因此通过测定420nm处的吸光度A420，运用如下公式酶活＝1000×稀释因子×A420/(t×V×OD600)，其中t表示在28℃下的反应时间，V表示收获细胞的体积，即可计算出胞内、胞外酶活(MillerJ.H.，Experiments in Molecular Genetics，352-355，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York(1972))。然后对所提取的胞内、胞外β-半乳糖苷酶在96孔板中用酶标仪SpectroMAX 190测定酶动力学，以获得A420/t。其中，为确保所测得的吸光度在线性范围内，先用逐级稀释的方法获得线性稀释倍数。在96孔板中，每孔的反应体系为125μl酶液(必要时需要稀释，pH7.6的磷酸盐缓冲液)加上50μl 4g/L oNPG。30min的动力学测定，2min的时间间隔，得到吸光度A420随时间的变化率，即可计算出酶活。
菌体的裂解效率可按该式计算裂解效率＝胞外酶活/胞内、胞外总酶活。
结果在紫外诱导启动子recA的控制下，Lambda噬菌体裂解基因SRRz获得表达，并使菌体有效裂解。紫外诱导40s后，重组菌体部分裂解，有一些胞内物质释放到培养基中，而且菌体的浓度(OD600)随着培养时间的增加逐渐下降(见图5中的图a)。此时，通过报告蛋白-β-半乳糖苷酶的活性测定，算出裂解效率为63.7％(见图5中的图b)，而这对重组蛋白的高通量筛选已经足够，但是随着菌体的进一步生长，如紫外诱导后4小时，6小时以及过夜培养(18-20)小时后，残余的未裂解的菌体又生长起来，计算胞外、胞内酶活及裂解效率，结果均有不同程度降低，特别是培养18-20小时后，裂解效率仅为27.4％。对照组在没有紫外诱导的条件下，菌体没有裂解，SRRz几乎没有本底表达，表明recA启动子严格受紫外调控。
在紫外诱导启动子umuDC的控制下，裂解过程及裂解效率和在recA调控下的状况非常相近，所不同的是umuDC调控的菌体本底裂解水平略高于后者(recA调控下)(见图6中的图a和图b)。
上述检测结果表明用本发明的大肠杆菌自裂解载体可获得较好的菌体裂解效果，可用于重组蛋白的高通量筛选。
序列表<160>4<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gctacttgat actgtatgag catacagtat aattg35<210>2<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gcttattgac atgctggcaa gaacagacta ctgtatataa aaacagtata50<210>3<211>1549<212>DNA<213>Lambda噬菌体<400>3
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<400>4aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt60ttgtcggtga acgctctccg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga120agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta180agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt cctgtcgtca240tatcta 24权利要求
1.大肠杆菌自裂解载体，是自5’至3’端顺次连接有紫外启动子，噬菌体裂解基因和大肠杆菌终止子的大肠杆菌表达载体。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述紫外启动子为recA启动子或umuDC启动子；所述recA启动子具有序列表中序列1的核苷酸序列，umuDC启动子具有序列表中序列2的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述噬菌体裂解基因为Lambda噬菌体的裂解基因SRRz，具有序列表中序列3的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述终止子为rrnB终止子，具有序列表中序列4的核苷酸序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的载体，其特征在于用于构建所述载体的出发载体为pUC18、pUC19或pET30a。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于所述大肠杆菌自裂解载体为pUC18-recA-SRRz-rrnB或pUC18-umuDC-SRRz-rrnB。
7.含有权利要求1所述载体的重组大肠杆菌。
8.一种大肠杆菌自裂解方法，是将权利要求1所述的大肠杆菌自裂解载体导入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，再将重组大肠杆菌在紫外线下照射，大肠杆菌细胞裂解。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述紫外线强度为3000-5000J/cm2s，照射时间为40s-4min。
10.权利要求8所述的大肠杆菌自裂解方法在胞内酶表达筛选中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于所述胞内酶的表达筛选方法，包括以下步骤1)将外源基因插入到权利要求1所述的大肠杆菌自裂解载体中，得到胞内酶表达筛选载体；2)将步骤1)构建的含有外源基因的胞内酶表达筛选载体导入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；3)发酵重组大肠杆菌，加入诱导剂对胞内酶进行表达，然后将重组大肠杆菌在紫外线下照射，大肠杆菌细胞裂解，胞内酶释放到发酵液中；4)对发酵液中的胞内酶进行筛选，得到目的蛋白。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于所述步骤2)中的大肠杆菌为E.coli BL21、BL21(DE3)、HB101、XL1-Blue或DH5-α。
全文摘要
本发明公开了一种大肠杆菌自裂解方法及其专用载体与应用。该载体是自5’至3’端顺次连接有紫外启动子，噬菌体裂解基因和大肠杆菌终止子的大肠杆菌表达载体。该大肠杆菌自裂解方法是将所述大肠杆菌自裂解载体导入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，将重组大肠杆菌在紫外线下照射，大肠杆菌细胞裂解。实验证明该载体可在紫外诱导下使Lambda噬菌体的裂解基因SRRz获得表达，从而使宿主细胞裂解，释放具有生物活性的外源目标蛋白到达培养基，以利于定向进化中后续的高通量筛选的进行；此外，在紫外诱导条件下即可用本发明的载体进行胞内酶的高通量筛选，具有廉价、快捷的优点。
文档编号C12N9/00GK1880461SQ20061007895
公开日2006年12月20日 申请日期2006年4月28日 优先权日2006年4月28日
发明者林章凛, 李爽, 徐丽华 申请人:清华大学