专利名称：埃博霉素b的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于制药技术领域，具体的说，涉及埃博霉素B的制备方法、制剂工艺及其制备 治疗格列卫耐药的慢性髓细胞性白血病药物的用途。
背景技术：
埃博霉素为上个世纪八十年代末GBF的微生物学家发现的粘细菌纤维堆囊菌Sorangium Cellulosum产生的次级代谢产物。1987年分离出两种新的大环内酯物命名为埃博霉素A和B, 实验发现对培养的真菌病原体有抑制活性。1994年美国国家癌症学会发现埃博霉素B对肿瘤细 胞具有抑制活性，Merck实验室发现它和紫杉醇至少在微管蛋白聚合实验中有相同作用，证明 了埃博霉素对肿瘤细胞有抑制作用的事实。
进一步研究发现，埃博霉素具有比紫杉醇优越的抗肿瘤特性。①埃博霉素比紫杉醇水溶 性好,结构简单，有利于化学合成埃博霉素及结构衍生化。②埃博霉素没有紫杉醇细胞内毒素 活性。③与紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表达型的多药耐药性细胞中也维持很大的细胞毒 性。④在Richard等研究的紫杉醇敏感的人类细胞系中，埃博霉素B比埃博霉素A和紫杉醇具有 更大的抗增殖活性，而埃博霉素A往往比紫杉醇的活性更低。另外，埃博霉素对一株多药耐药 性直肠癌系和紫杉醇抗性卵巢癌系仍然具有敏感性。目前埃博霉素有几种同类物质已经进入 临床研究阶段。主要包括Epothilone B (EP0 B)， Epothilone D及BMS-247550。在对300个病 人的初步临床实验中，该化合物对结肠癌、乳腺癌、肾脏和卵巢癌，有确切的疗效。
0 OH 0
R尸Me R2=H 印othilone A RfMe R2=Me epothilone B
目前公开发表的通过发酵制备埃博霉素B方法生产成本高，尚需研究大规模和简单廉价 的发酵制备技术和分离纯化方法。
慢性髓细胞性白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)是血液系统最常见的恶性疾病之 一,在国内年发病率约为0.36/10万，占白血病的第三位。CML的分子生物学特征是存在bcr/abl
融合基因，该基因通过转录翻译产生分子量为210KDa的融合蛋白P210bCT/abl，该融合蛋白具有 异常增高的酪氨酸激酶活性，使造血干细胞发生异常转化而导致CML发生。K562细胞系来 源于急变期CML病人，P2K)b^^呈阳性，是研究CML经典的细胞模型。
目前治疗CML的前线化学药物是2001年新上市的格列卫(Glivec，或称STI571 ) [1]。 属于a—苯胺嘧啶衍生物，格列卫作用的机理是作用ATP与酪氨酸激酶结合位点，特异性抑 制ABL酪氨酸激酶。虽然应用格列卫能够使急变期CML完全缓解，但大部分病人对格列卫 的应答期较短，最终细胞对其耐药而使临床复发("。CML细胞对格列卫的耐药机理比较复杂。 由于格列卫上市不久的新药，目前还没有很好的方法克服CML对其耐药性。目前人们对CML 治疗研究是尝试延缓或阻止CML细胞对格列卫产生耐药性，其中通过筛选发现与格列卫不 同结构、不同作用机制的活性化合物，克服细胞对格列卫的耐药性，或与格列卫合并使用克 服细胞的耐药性，成为CML治疗研究的一个重要方向。
发明内容
本发明提供了一种大规模发酵生产埃博霉素B的方法。 具体的说，本发明方法包括如下步骤
(a) .种子液在发酵罐发酵培养12 96小时，加入1% 10%吸附剂，吸附代谢产物
(b) .发酵100-150小时后停止发酵，稠布过滤发酵液收获吸附剂
(c) .吸附剂用异丙醇提取后减压浓縮或用水浸润，再用乙酸乙脂萃取旋转蒸发至干，得含
埃博霉素B粗提物
(d) .提取物使用低级醇溶解后，先经过常压柱层析用低级醇与氯代烷的混合液或单用低级
醇洗脱
(e) . HPLC检测并合并含埃博霉素B的馏份，减压浓縮到一定体积后，通过液相色谱进一歩
纯化，得到纯化的埃博霉素B。
步骤a中的种子液可由冻存菌种逐级放大培养后再转入培养基中培养1 5天得到，菌种 可为商业菌种如纤维堆囊菌ATCC 15384号经紫外或诱变剂诱变菌种，或为土壤中分离得到的 其他纤维堆囊菌种。
吸附剂优选弱极性大孔吸附树脂，如AB-8、 DA201等。
发酵所用培养基包括淀粉1 35g/L,糖l 10g/L，黄豆粉2 30g/L,酵母提取物2 30 g/L;还可加入无机盐或调节pH值的酸、碱，例如加入CaCl2.2H20 lg/L, MgS04.7H20 lg/L， Fe-EDTA8mg/L。所述糖可选用单糖或二糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖等。
歩骤b中，发酵过程中可补加葡萄糖或复合料(淀粉、黄豆粉等)，提高埃博霉素B的产
步骤c中，用异丙醇提取时优选的与吸附剂的体积/重量比为2 3: 1，分次提取2 3次，
浓缩至原体积的1/10 1/5
步骤d中，柱层析填料可选用硅胶或葡聚糖凝胶LH-20，低级醇可选用甲醇或乙醇，氯代
烷可选用二氯甲烷或氯仿。
步骤e中优选的采用反相C-18制备型液相色谱进行纯化。
本方法制备得到的埃博霉素B经结构确证，与文献报道一致(表l)
表1.埃博霉素B的'H-NMR和'3C-NMR_
_5 H(mult. / in Hz)_ S c(咖lt.)_
文献值(CDCl3)样品值(CD3OD) 文献值(CDCh) 样品值(CDC1》
本发明所提供的埃博霉素B制备方法具有如下优点-
1) 适用性强，适合于多种工业菌种
2) 实现了设备、试剂的国产化，成本低廉
3) 操作简便，易于大规模生产
另一方面，本发明还提供了一种埃博霉素B的药物组合物，含有埃博霉素B和聚乙二醇。 该组合物可制成注射剂或冻干粉，例如由埃博霉素B溶解于合适分子量大小的聚乙二醇制备得 到。其规格可根据使用剂量调整，优选为每支2. 5mg 25mg。临用时用生理盐水稀释或溶解成
1
2s 2b
3
3-OH
4
5
6
7
7-OH
8
9a
9b
10a
10b
11a
lib
12
13 14a 14b
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
170. 6 (s)170. 5
39. 3 (t)39.2
72.9(d)72.9
53. 2 (s)53. 1
220. 7 (s)220. 6
42.9(d)42.9
74, 1 (d)74. 1
36.5(d)36.4
30.8(t)30.8
22. 4 (t)22. 8
32. 4 (t)32. 1
61. 7(d)61. 3
61. 4 (s)61. 7
32. l(t)32. 4
77. 3 (d)77.0
137. 6 (s)137. 5
119. 7(d)119. 7
151. 9(s)151.8
116. 1(d)116. 1
165. 2 (s)165. 1
19. 2 (q)19. 1
19. 7(q)19. 7
21. 5 (q)21.4
13. 6 (q)13.7
17. l(q)17. 1
22. 8 (q)22.4
15. 9 (q)15.8
2.54(dd,月4. 1,9. 6) 2.35(dd,,14. 1，3. 0)
4. 21(m)
4. 19 (bs)
2.49(>15, 10. 2) 2. 43(>15，3.6) 4. 22
3. 29 (dq) 3. 76(ddd) 2. 64(bd)
3.29 3. 65
1.69 1.55 1.55 1.57 1. 55 1.69 1.55
2.80(dd, ,7.7,4. 6)
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适当浓度后静脉注射或静脉滴注。
发明人还发现，埃博霉素B对格列卫耐药的K562细胞生长具有抑制作用，该化合物可用 于治疗格列卫耐药的慢性髓细胞性白血病。
图LC18反相色谱色谱柱分离得到埃博霉素A和B 图2.纯化的埃博霉素B纯度分析色谱图
图3. EpoA和EpoB对格列卫耐药的K562细胞抑制生长活性曲线图
具体实施例方式
为了进一步说明本发明的实施方式和用途，参照以下实施例进行说明。实施例是为了解 释而不是以任何方式限制本发明的范围，本领域技术人员在权利要求的范围内所做出的某些 改变和调整也应认为属于本发明的范围。
实施例一 种子液培养
取冻存菌种，转入50ml培养基，培养基成分为马铃薯淀粉8g/L、葡萄糖2 g/L、黄豆 粉2 g/L、酵母提取物2 g/L等。培养24小时后，转入多个500 ml I号培养基，种子液培 养72h，转入发酵罐发酵。
实施例二发酵，提取粗提物
1) 100升发酵罐中加入65L培养基，培养基成分为马铃薯淀粉lg/L、葡萄糖IO g/L、 黄豆粉30g/L、酵母提取物15g/L等。12rC灭菌20min。无菌条件下转种，发酵过程中设置 通气量25L/min，压力0. 4Mpa，转速100r/min，温度32'C， pH7.4。培养12h后，加入总体 积1%的AB-8大孔吸附树脂。培养100h后收获。
稠布过滤发酵液，得到吸附剂AB-8，用2倍体积的异丙醇提取2次，每次1小时。合 并异丙醇溶液，减压蒸馏浓縮至1A0，再用乙酸乙脂萃取浓缩后的异丙醇3次，得到埃博霉 素B粗提物。
2) 250L发酵罐中加入160升培养基，培养基成分为马铃薯淀粉15g/L、果糖4 g/L、黄 豆粉25g/L、酵母提取物2g/L等。12rC灭菌30min。转入菌种，发酵条件同前，培养48h后， 加入总体积5%的AB-8大孔吸附树脂。培养100h后，补加入葡萄糖溶液。继续发酵至120h 后，收获。
稠布过滤发酵液，得到吸附剂AB-8。用3倍体积的异丙醇提取3次，每次0. 5小时。合 并异丙醇溶液，减压蒸馏浓縮至1/5，再用乙酸乙脂萃取浓缩后的异丙醇3次，得到埃博霉 素B粗提物。
3) 250L发酵罐中加入160升培养基，培养基成分为马铃薯淀粉20g/L、蔗糖1 g/L、黄
豆粉15g/L、酵母提取物30g/L等。12rC灭菌20min。转入菌种，发酵条件同前，培养96h 后，加入总体积10%的AB-8大孔吸附树脂。培养120h后，补加入培养液。继续发酵至150h 后，收获。
稠布过滤发酵液，得到吸附剂AB-8。用水浸润后，再加入3倍体积的乙酸乙脂萃取两次， 每次1小时，过滤出乙酸乙脂，旋转蒸发至干，得到含埃博霉素B粗提物。
4) 100L发酵罐中加入70升培养基，培养基成分为马铃薯淀粉35g/L、葡萄糖8 g/L、 黄豆粉2g/L、酵母提取物20g/L等。12rC灭菌20min。转入菌种，发酵条件同前，培养72h 后，加入总体积8%的AB-8大孔吸附树脂。培养150h后收获。
稠布过滤发酵液，得到吸附剂AB-8。用水浸润后，再加入4倍体积的乙酸乙脂萃取三次， 每次0.5小时，过滤出乙酸乙脂，旋转蒸发至干，得到含埃博霉素B粗提物。
实施例三埃博霉素B的分离纯化
含埃博霉素B的粗提物经两步分离纯化得到纯度高于95%的埃博霉素B。 第一步葡聚糖凝胶LH-20柱层析
提取物使用甲醇溶解后，离心取上清液，加至葡聚糖凝胶S印hadexLH-20柱顶。流动相 甲醇，流动相流速为10cm/h。经HPLC高效液相色谱分析(填料Kromasil C18 5um，尺寸 4.6mmX150mra。流动相甲醇水=7:3。检测波长UV230nm)。合并含埃博霉素B馏分，进行 下一步纯化。
第二步C18反相色谱分离
经S印hadex LH-20分离后的馏分，通过C18反相色谱色谱柱进一步纯化。流动相甲 醇水=70:30，检测波长UV230。如附图1所示。经纯化的埃博霉素B纯度分析如附图2。 纯化的埃博霉素B的1HNMR和13CNMR如表1，与文献报道一致。
实施例四埃博霉素B对格列卫耐药K562细胞的抑制作用
格列卫耐药K562细胞是从K562细胞不断用格列卫作用下诱导而成，耐药倍数为75倍。 向格列卫耐药K562细胞培养液(10%小牛血清PRMI-1640培养液)中加入不同剂量的埃 博霉素B, 37'C， 5%(:02培养箱中培育72小时后，加入20nl MTT (四甲基偶氮唑盐)溶液， 继续孵育4小时，吸去细胞悬液，加入120ul DMSO溶解沉淀物，酶标仪570nm下测定其光 密度值。每一样品浓度为三孔，阳性对照为长春新碱(n=3)。埃博霉素AB对格列卫耐药K562 细胞的抑制作用如附图3。
实施例五埃博霉素B制剂
埃博霉素B用聚乙二醇400溶解后配制成5mg/ml溶液，无菌过滤后分装，制成注射液。 用时用生理盐水稀释后静脉注射或静脉滴注。
埃博霉素B用聚乙二醇600溶解后配制成10mg/ml溶液，无菌过滤后分装，冻干制成每 瓶装量10mg的冻干制剂。用时用注射用水或生理盐水稀释后静脉注射或静脉滴注。
参考文献
1. Altmann KH. Recent developments in the chemical biology of epothilones. Curr Pharm Des. 2005;11(13):1595-613.
2. Bollag DM.Epothilones: novel microtubule-stabilising agents.Expert Opin Investig Drags. 1997 Jul;6(7):867-73.
3. Gerth K， Bedorf N， Hofle G et al.，Epothilons A and B: antiflmgal and cytotoxic compounds from Sorangium cellulosum (Myxobacteria). Production, physico-chemical and biological properties. J Antibiot (Tokyo). 1996 Jun;49(6):560-3.
4. Mukai M, Che XF, Furukawa T, Sumizawa Tet al.，Reversal of the resistance to STI571 in human chronic myelogenous leukemia K562 cells.Cancer Sci. 2003 Jun;94(6):557-63.
权利要求
1.一种大规模发酵生产埃博霉素B的方法，其特征在于包括如下步骤(a)种子液在发酵罐发酵培养12～96小时，加入1％～10％吸附剂，吸附代谢产物；(b)发酵100-150小时后停止发酵，稠布过滤发酵液收获吸附剂；(c)吸附剂用异丙醇提取后减压浓缩或用水浸润，再用乙酸乙脂萃取旋转蒸发至干，得埃博霉素B粗提物；(d)提取物用低级醇溶解后，经过常压柱层析用低级醇与氯代烷的混合液或单用低级醇洗脱；(e)HPLC检测并合并含埃博霉素B的馏份，减压浓缩到一定体积后，通过液相色谱进一步纯化，得到纯化的埃博霉素B。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中发酵所用培养基包括淀粉1 35 g/L, 糖l 10g/L，黄豆粉2 30g/L，酵母提取物2 30 g/L。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于培养基中糖选自葡萄糖、果糖或蔗糖。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中吸附剂选自弱极性大孔吸附树脂。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b的发酵过程中可补加葡萄糖或复合料。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c中，用异丙醇提取时与吸附剂的体积/ 重量比为2 3: 1，分次提取2 3次，浓缩至原体积的1/10 1/5。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d中，柱层析填料选自硅胶或葡聚糖凝胶 LH-20，低级醇选自甲醇或乙醇，氯代烷选自二氯甲烷或氯仿。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e中液相色谱为反相C-18制备型液相色谱。
9. 一种埃博霉素B的药物组合物，其特征在于含有埃博霉素B和聚乙二醇，剂型为注射 剂、冻干粉剂或其他制剂。10.
埃博霉素B在制备治疗格列卫耐药的慢性髓细胞性白血病药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及埃博霉素B的制备方法。具体的说，本发明提供了一种采用100升～500升发酵罐大规模发酵和大量分离制备埃博霉素B的技术方法。本发明还涉及埃博霉素B的制剂及在制备治疗格列卫耐药的慢性髓细胞性白血病药物中的应用。
文档编号C12R1/01GK101104864SQ20061009103
公开日2008年1月16日 申请日期2006年7月12日 优先权日2006年7月12日
发明者张庆林, 易志恒, 李学林, 赫 王, 王石齐, 肖凤君 申请人:湖南迪诺制药有限公司;中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所