专利名称：石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物及其设计方法
技术领域：
本发明涉及一对PCR引物(名称为G-dloop)，尤其是涉及一种主要用于能特异地扩增大多数石斑鱼类线粒体基因组高变异区(即控制区)的扩增引物。
背景技术：
由于动物线粒体DNA(mtDNA)具有结构简单、严格的母系遗传、几乎不发生重组、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点，使其在种类鉴别和分类地位的研究方面应用十分广泛。线粒体基因组由37个编码基因及一段主要的非编码区(控制区)组成，不同序列区域的进化速率不同。其中进化速率最快的是控制区，它适于亲缘关系较近的群体间的比较研究。
当前通过序列差异来鉴别外型上相似的鱼类是一种十分便利准确的方法，其中线粒体控制区序列差异的研究，如应用于种类鉴别和分子系统进化分析等，国内外已有一些相关报道，主要有1)rnachez L，Danzamann R D.Congruence in control～region brook charr(Salvelinusfontinalis)[J].Mol Biol Evol，1993，101002～1014.
2)Zhu D，Jamieson B G M，Hugall A，et al.Sequence evolution and phylogenetic signal incontrol～region and cytochrome b sequences of rainbow fishes(Melantotaeniidae)[J].Mol BiolEvol，1994，11672～683.
3)Alex P，Kornfied I.Evolution of the mitochondrial DNA control region in the mbuna(Cichlidae)species flock of Lake Malawi，East Africa[J].J Mol Evol，1997，4570～83.
4)郑冰蓉，等.鲤属鱼类mtDNA控制区D环区序列的变异性分析.水产学报，2002，26(4)289～294.
5)胡文革，等.新疆3种雅罗鱼线粒体DNA控制区序列的差异和系统进化关系.遗传学报，2004，31(9)970～975.
6)张燕，等.中国鲿科鱼类线粒体DNA控制区结构及其系统发育分析.水生生物学报，2003，27(5)463～467.
石斑鱼种间外部形态相似，为其种类鉴定带来极大困扰。而其遗传上也具有异常相近的亲缘关系，因此只有选择进化速度最快的线粒体基因组高变异区(即控制区或称D-LOOP环)才能最有效进行近缘种间甚至同种不同群体间的鉴别。然而石斑鱼线粒体基因组高变异区两端序列较为特化，使用已报道的其他物种线粒体基因组高变异区扩增引物，如L15926(Kocher et al.，1989)、H16498(Meyer et al.，1990)、L16518(Meyer)等均无法对其进行有效扩增。
发明内容
本发明旨在提供一对可高效扩增大多数石斑鱼类线粒体基因组高变异区的扩增引物及其设计方法。
本发明所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物(G-dloop)由两条单链寡聚核苷酸组成，其中轻链引物G-dloop(L)有22个碱基CAG AGC GCC GGT CTT GTA AACC，位于tRNA-Thr基因上，重链引物G-dloop(H)有21个碱基GTC AGG ACC AA(A/G)CCT TTG TGC，其中一个为简并碱基，位于12SrRNA基因3’起始端。
本发明所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物的设计方法其步骤为1)登陆Genebank搜索脊椎动物线粒体DNA细胞色素b基因及16S rRNA基因序列的高保守区，经同源比对，获得一对扩增引物为轻链28-For5’-CGA ACG TTG ATA TGA AAAACC ATC GTT G-3’；重链16S-brh5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’，其扩增范围包括线粒体基因组中细胞色素b基因、控制区(即高变异区)、12S rRNA基因、16S rRNA基因及它们之间的转运RNA基因和间隔区序列，扩增片段大小在4.5～5.5kb之间。
2)采用步骤1)中所述的扩增引物，通过长PCR方法扩增获得32种石斑鱼类的目的片段，片段大小在4.5～5.5kb之间，最后32种石斑鱼类均扩增获得了单一的目的DNA片段，产物大小为4.5～5.5kb，对所得的32种石斑鱼类的扩增产物进行测序。
3)使用同源比对软件Clustal X 1.83对所得序列进行比对，找出32种石斑鱼类线粒体基因组细胞色素b 5’端及12S rRNA 3’端的保守序列，并利用简并性原则，设计出石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物(G-dloop)。
本发明所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物的应用主要有种类鉴定、地理种群鉴别和种质资源评估等方面。
本发明所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物(G-dloop)对32种石斑鱼(32种石斑鱼是实验组历时3年，于我国东南沿海海岸线采集所得32种石斑鱼样本，基本涵盖了分布于我国近海的石斑鱼类群)进行PCR扩增，均能获得片段大小在1000～1200bp之间的特异性扩增产物，经测序及与Genbank上同源序列的比较，证实为包含线粒体基因组高变异区全序列的扩增产物。从而为我国石斑鱼类的种类鉴定、地理种群鉴别和种质资源的评估提供了一个有力的工具。使用引物G-dloop的PCR扩增，最突出的优点在于可以快速地对某些难于鉴别的近缘种进行准确鉴定，此外，还可以在我国石斑鱼类的地理种群鉴别和种质资源及群体遗传多样性评估发挥重要作用。
具体实施例方式
本发明所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物(G-dloop)由两条单链寡聚核苷酸组成，其中轻链引物G-dloop(L)有22个碱基CAG AGC GCC GGT CTT GTA AACC，位于tRNA-Thr基因上，重链引物G-dloop(H)有21个碱基GTC AGG ACC AA(A/G)CCT TTG TGC，其中一个为简并碱基，位于12SrRNA基因3’起始端。
上述引物对32种石斑鱼进行PCR扩增，均能获得片段大小在1000～1200bp之间的特异性扩增产物，经测序及与Genbank上同源序列的比较，证实为包含线粒体基因组高变异区全序列的扩增产物。从而为我国石斑鱼类的种类鉴定、地理种群鉴别和种质资源的评估提供了一个有力的工具，通过使用引物G-dloop的PCR扩增，使得在分子水平上快速准确高效地对我国石斑鱼类的种类鉴定、地理种群鉴别和种质资源评估成为现实。
本发明所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物采用以下方法设计1)登陆Genebank，(网址为http//www.ncbi.nlm.nih.gov，全称是National Center forBiotechnology Information，该网站收录有当今世界上所有已公开的基因序列)搜索脊椎动物线粒体DNA细胞色素b基因及16S rRNA基因序列的高保守区，经同源比对，获得一对扩增引物为轻链28-For5’-CGA ACG TTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G-3’；重链16S-brh5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’，其扩增范围包括线粒体基因组中细胞色素b基因、控制区(即高变异区)、12S rRNA基因、16S rRNA基因及它们之间的转运RNA基因和间隔区序列，扩增片段大小在4.5～5.5kb之间。
上述扩增引物其主要用处在于扩增出包括所需的目的(即高变异区)序列及其前后基因序列，为高变异区引物的设计奠定基础。
2)采用步骤1)中所述的扩增引物，通过长PCR方法扩增获得32种石斑鱼类的目的片段，片段大小在4.5～5.5kb之间，部分扩增特异性较差的种类通过降落PCR法提高其特异性，最后32种石斑鱼类均扩增获得了单一的目的DNA片段，产物大小为4.5～5.5kb，对所得的32种石斑鱼类的扩增产物进行测序。所涉及的32种石斑鱼类为1宝石石斑鱼、2布氏石斑鱼、3双棘石斑鱼、4长棘石斑鱼、5赤点石斑鱼、6玳瑁石斑鱼、7电纹石斑鱼、8鲑点石斑鱼、9黑边石斑鱼、10六带石斑鱼、11吻斑石斑鱼、12小点石斑鱼、13斜带石斑鱼、14点带石斑鱼、15网纹石斑鱼、16镶点石斑鱼、17云纹石斑鱼、18纵带石斑鱼、19褐点石斑鱼、20褐石斑、21青石斑、22驼背鲈、23宽额鲈、24侧牙鲈、25波纹鳃棘鲈、26横带九棘鲈、27红九棘鲈、28台湾九棘鲈、29斑点九棘鲈、30豹纹鳃棘鲈、31横斑鳃棘鲈、32鳜鱼。
长PCR方法即通过调整PCR反应条件最终获得较长的PCR产物。所述的调整反应条件是指降低变性温度、延长延伸时间(变性温度从53℃可降到48℃，延伸时间可延长至3.5min)及使用双酶系统。所述的部分扩增特异性较差即扩增产物量少，并有其他非目的片段的PCR产物存在，表现为扩增出非单一的条带。所述的降落PCR法即在PCR反应最初几个循环退火温度从一个较高温度逐渐下降，可有效抑制非特异性产物的扩增。
3)使用同源比对软件Clustal X 1.83对所得序列进行比对，找出32种石斑鱼类线粒体基因组细胞色素b的保守序列，并利用简并性原则，设计出石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物(G-dloop)。
同源比对软件Clustal X 1.83可在生物软件网http//www.bio-soft.net/下载。Clustal X 1.83是用来对核酸与蛋白序列进行多序列同缘比对的软件。由于高变异区序列正好位于细胞色素b基因和12S rRNA基因之间，因此用于设计引物的两段保守序列分别位于高变异区的两端，在细胞色素b 5’端及12S rRNA 3’端。简并性原则是指一种氨基酸可由2种以上密码子编码，因此某个碱基(特别是第三密码子位置)的替换并不影响编码氨基酸，因此对引物中存在高变异的位点使用两个以上的不同碱基，可克服部分模板由于发生碱基替换而导致引物的不匹配。
以下就本发明所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物的应用作进一步的说明。其应用主要有种类鉴定、地理种群鉴别和种质资源评估等方面。
(1)种类鉴定方面的应用①对32种石斑鱼进行PCR扩增，得到的扩增产物片段大小在1000～1450bp，种间序列歧异度在6.1％～23.5％。
②对近缘种斜带石斑鱼与点带石斑鱼序列进行PCR扩增，得到的扩增产物片段大小在1000～1200bp，两者之间的种间序列歧异度为8.3％。
③对近缘种云纹石斑鱼与褐石斑鱼序列进行PCR扩增，得到的扩增产物片段大小在1200bp左右，两者之间的种间序列歧异度为6.1％。
(2)地理种群鉴别方面的应用
对赤点石斑鱼7个地理种群序列进行PCR扩增，得到的扩增产物片段大小在1350bp左右，不同地理种群间序列歧异度在2.3％～4.7％。
(3)种质资源评估方面的应用对斜带石斑鱼3个人工繁育群体序列进行PCR扩增，得到的扩增产物片段大小在1050～1070bp，3个种群之间的序列歧异度在1.4％～2.5％，单倍型多样性为0.728，核苷酸多样性为0.0105，群体间的分化系数为0.0766，说明这三个群体的多样性水平都较高，群体间存在明显的基因交流。
以下给出石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物的应用实例。
(1)对32种石斑鱼进行PCR扩增，反应条件为94℃变性5min，进入30个循环94℃变性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最后72℃延伸7min。得到的扩增产物片段大小在1000～1200bp，胶回收纯化并测序，序列通过Genetyx软件(可在http//www.sdc.co.jp下载)进行同源比较，种间序列歧异度在6.1％～23.5％。
所述的Genetyx软件即可进行两个序列间的同源比较并对序列进行分析的软件。
(2)对近缘种斜带石斑鱼与点带石斑鱼序列进行PCR扩增，反应条件为94℃变性5min，进入30个循环94℃变性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最后72℃延伸7min。得到的扩增产物片段大小在1000～1200bp，胶回收纯化并测序，序列进行同源比较，其种间序列歧异度为8.3％。
(3)对近缘种云纹石斑鱼与褐石斑鱼序列进行PCR扩增，反应条件为94℃变性5min，进入30个循环94℃变性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最后72℃延伸7min。得到的扩增产物片段大小在1200bp左右，胶回收纯化并测序，序列进行同源比较，其种间序列歧异度为6.1％。
(4)对赤点石斑鱼7个地理种群序列进行PCR扩增，反应条件为94℃变性5min，进入30个循环94℃变性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最后72℃延伸7min。得到的扩增产物片段大小在1350bp左右，胶回收纯化并测序，序列进行同源比较，不同地理种群间序列歧异度在2.3％～4.7％。
(5)对斜带石斑鱼3个人工繁育群体序列进行PCR扩增，反应条件为94℃变性5min，进入30个循环94℃变性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最后72℃延伸7min。得到的扩增产物片段大小在1050～1070bp，胶回收纯化并测序，序列进行同源比较，群体间序列歧异度在1.4％～2.5％。
以下给出本发明中所涉及的序列1.石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物(G-dloop)轻链引物G-dloop(L)有22个碱基CAG AGC GCC GGT CTT GTA AAC C，位于tRNA-Thr基因上，重链引物G-dloop(H)有21个碱基GTC AGG ACC AA(A/G)CCT TTGTGC，其中一个为简并碱基，位于12SrRNA基因3’起始端。
2.长PCR扩增引物为轻链28-For5’-CGA ACG TTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G-3’；重链16S-brh5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’，其扩增范围包括线粒体基因组中细胞色素b基因、控制区(即高变异区)、12S rRNA基因、16S rRNA基因及它们之间的转运RNA基因和间隔区序列，扩增片段大小在4.5～5.5kb之间。
权利要求
1.石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物，其特征在于由两条单链寡聚核苷酸组成，其中轻链引物G-dloop(L)有22个碱基CAG AGC GCC GGT CTT GTA AAC C，位于tRNA-Thr基因上，重链引物G-dloop(H)有21个碱基GTC AGG ACC AA(A/G)CCT TTGTGC，其中一个为简并碱基，位于12SrRNA基因3’起始端。
2.如权利要求1所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物的设计方法，其特征在于其步骤为1)登陆Genebank搜索脊椎动物线粒体DNA细胞色素b基因及16S rRNA基因序列的高保守区，经同源比对，获得一对通用引物为轻链28-For5’-CGA ACG TTG ATA TGA AAAACC ATC GTT G-3’；重链16S-brh5’-CCG GTC TGAACT CAG ATC ACG T-3’，其扩增范围包括线粒体基因组中细胞色素b基因、控制区或高变异区、12S rRNA基因、16S rRNA基因及它们之间的转运RNA基因和间隔区序列，扩增片段大小为4.5～5.5kb；2)采用步骤1)中所述的通用引物，通过长PCR方法扩增获得32种石斑鱼类的目的片段，片段大小为4.5～5.5kb，最后32种石斑鱼类均扩增获得了单一的目的DNA片段，产物大小为4.5～5.5kb，对所得的32种石斑鱼类的扩增产物进行测序；3)使用同源比对软件Clustal X 1.83对所得序列进行比对，找出32种石斑鱼类线粒体基因组细胞色素b 5’端及12S rRNA 3’端的保守序列，并利用简并性原则，设计出石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物。
3.如权利要求1所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物的设计方法，其特征在于在步骤2)中，所述的长PCR方法即通过调整PCR反应条件最终获得较长的PCR产物。
4.如权利要求1所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物的设计方法，其特征在于在步骤2)中，所述的调整反应条件是指降低变性温度、延长反应时间及使用双酶系统，所述的延长反应时间是做梯度dT＝0.3℃，时间梯度dt＝10s。
5.如权利要求1所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物的设计方法，其特征在于在步骤2)中，所述的部分扩增特异性较差即扩增产物量少，并有其他非目的片段的PCR产物存在，表现为扩增出非单一的条带。
6.如权利要求1所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物的设计方法，其特征在于在步骤2)中，所述的降落PCR法即在PCR反应最初几个循环退火温度从一个较高温度逐渐下降，可有效抑制非特异性产物的扩增。
7.如权利要求1所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物的设计方法，其特征在于在步骤3)中，所述的同源比对软件Clustal X 1.83在生物软件网http//www.bio-soft.net/下载。
8.如权利要求1所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物的设计方法，其特征在于在步骤3)中，所述的保守序列的高变异区位置介于细胞色素b与12S rRNA之间。
9.如权利要求1所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物的设计方法，其特征在于在步骤3)中，所述的简并性原则是指一种氨基酸由至少2种密码子编码。
10.如权利要求1所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物在种类鉴定、地理种群鉴别和种质资源评估方面的应用。
全文摘要
石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物及其设计方法，涉及一对PCR引物(名称为G－dloop)，提供一对可高效扩增大多数石斑鱼类线粒体基因组高变异区的扩增引物及其设计方法。扩增引物由两条单链寡聚核苷酸组成。登陆Genebank搜索脊椎动物线粒体DNA细胞色素b基因及16S rRNA基因序列的高保守区，经同源比对，获得一对扩增引物，通过长PCR方法扩增获32种石斑鱼类的目的片段并进行测序。使用同源比对软件Clustal X 1.83对所得序列进行比对，找出32种石斑鱼类线粒体基因组细胞色素b5’端及12S rRNA 3’端的保守序列，并利用简并性原则，设计出石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物。
文档编号C12Q1/68GK1900318SQ20061009393
公开日2007年1月24日 申请日期2006年6月23日 优先权日2006年6月23日
发明者丁少雄, 杜佳莹, 王军, 苏永全 申请人:厦门大学