专利名称：全层视网膜组织片的体外分离制备方法
技术领域：
本发明涉及一种将全层视网膜组织从供体取材后、体外分离、制备成移植片的方法。
背景技术：
自从Royo于1959年首次报道将视网膜移植到大鼠的前房后，研究者们发现，视网膜神经上皮与色素上皮之间的视网膜下间隙和前房均是相对免疫赦免区域，移植物较少受到免疫排斥。于是人们相继进行了视网膜色素上皮细胞、视网膜感光细胞、胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞、视网膜干细胞、视网膜神经上皮层、全层视网膜(视网膜色素上皮+视网膜神经上皮)以及视网膜芯片、视网膜假体移植到宿主动物(受体)的视网膜下间隙的研究。特别是近20年来，研究者以健康的视网膜细胞或组织为供体，通过视网膜移植来尝试延缓宿主视网膜细胞的变性和替换坏死及凋亡的细胞，移植后的研究结果显示(1)宿主动物的视网膜下间隙内，供体细胞和组织能存活、分化、发育；(2)没有发现供体给宿主组织器官带来明显的危害或排斥反应；宿主视功能有一定的恢复；(3)无论是将视网膜色素上皮细胞还是视网膜色素上皮组织片的单独移植，均不能在术后形成良好的视网膜色素上皮层状结构。同样，单独的视网膜神经上皮移植，也依赖于宿主视网膜健康的视网膜色素上皮支持。于是采用干细胞或全层视网膜作为供体成为目前研究的趋势，但是干细胞的诱导分化还有待于进一步的基础研究，因此全层视网膜供体目前具有较大的应用潜力。2000年美国专利说明书US-6045791公开了一种视网膜色素上皮细胞移植的方法，采用的是将视网膜色素上皮细胞在体外培养在胶原层上，通过移植管吸入视网膜色素上皮细胞，但这样就只有视网膜色素上皮细胞，缺少视网膜的另外9层细胞。
然而，将全层视网膜(色素上皮+神经上皮)移植到宿主视网膜下腔面临的困难是在体外要分离得到结构层次完好的全层视网膜很困难。眼球后部的组织结构中，从外到内依次为巩膜、脉络膜、视网膜和玻璃体，其中视网膜是光线的接受和转化部位，视网膜包括视网膜色素上皮层和视网膜神经上皮层，视网膜神经上皮层又分为9层视锥视杆层、外界膜、外核层、外丛状层、内核层、内丛状层、神经节细胞层、神经纤维层、内界膜。所以全层视网膜组织片共有10层精细结构，而这10层的总厚度仅为200-300微米，并且视网膜色素上皮层和其毗邻的脉络膜通过紧密连接粘连紧密。所以在分离过程中很容易发生组织片的卷曲、皱褶以及结构紊乱；同时视网膜对缺血缺氧及理化环境变化非常敏感，分离过程中微环境的变化、机械损伤、时间的延长，都可能对视网膜的结构和功能带来不可逆的创伤。研究者们尝试过两种方法来分离视网膜粘连的脉络膜机械分离和Dispase酶消化法。单纯机械分离视网膜和其毗邻的脉络膜很容易使视网膜发生卷曲、反折以及视网膜内部色素上皮和神经上皮的分离等；而Dispase酶又可能对视网膜光感受器细胞产生毒性。故目前尚无一种有效的分离方法。
准分子激光是一种新型冷激光，通过分子断键作用进行微米数量级的精确切削，在切削过程中没有热创伤、精度高、速度快、易于控制。而采用精确的准分子激光切削脉络膜，得到结构层次完好的全层视网膜组织片，目前尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一套使用方便、精确的全视网膜组织片的体外分离制备方法，它能得到结构层次完好的全层视网膜片。
为实现上述目的，本发明的采用的方案是即一种全层视网膜组织片的体外分离制备方法，方法包括以下步骤1、明胶片的制备将明胶粉中加入无菌生理盐水，加热煮沸溶化后，在圆柱状模型中冷却，然后用振动切片机切削成明胶薄片，4℃度环境中保存备用。
2、全层视网膜片的保存将供体的附有脉络膜的全层视网膜，平铺于明胶片表面，脉络膜面向上，在4小时以内浸入保存液中备用。
所述保存液可采用市售的Ames’液、中期保存液、冻存剂、以及1号抗冻剂和2号抗冻剂，其相应的保存方法为Ames’液在4℃环境中保存4小时；中期保存液在4℃环境中保存1天；冻存剂在负80度冰箱中保存1周；1号抗冻剂和2号抗冻剂处理后在深低温程序降温仪中保存1月。
3、全层视网膜片的激光微切削除层处理采用准分子激光机，利用光学角膜磨镶模式发射激光，将全层视网膜片附着的脉络膜通过微切削除去，然后用明胶双面包埋，浸入保存液中备用。
本发明方法产生的积极效果能够精确、微创、迅速、方便地将全层视网膜组织与其紧密附着的脉络膜分离开，并且在分离制备过程中保持全层视网膜完整的层次结构和良好的组织活性。
图1为附着有脉络膜的全层视网膜片平铺于明胶片表面，脉络膜面向上。
图2为准分子激光正在利用光学角膜磨镶模式模式发射激光，微切削脉络膜。
图3为微切削后可通过RPE透见其下视网膜神经上皮层，略显白色。
图4为微切削后脉络膜完全消失，RPE(黑箭)尚存。(注RPE与视网膜神经上皮间的空隙是由于固定过程中面交明胶收缩所致)。RPE(视网膜色素上皮层，黑箭)，GEL(明胶)，ONL(视网膜外核层)，INL(视网膜内核层)苏木精伊红染色×400倍。
图5为广西巴马小型猪光损伤环境白色荧光灯(波长400-700nm，照射强度25001ux，照射时间12h/d)持续照射3月龄猪达6个月以上。
图6-A为5#猪右眼移植术后1月眼底彩照，移植区视网膜平复。
图6-B为5#猪右眼移植术后1月眼底荧光造影，移植区内无明显荧光渗漏(白箭)。
图7-A为9#猪左眼移植术后8月眼底彩照，可见移植区(白箭)和硅油界面(黑箭)。
图7-B为9#猪左眼移植术后8月眼底荧光造影，移植区内无荧光渗漏(白箭)。
图8为视网膜移植完成后，因麻药过量抢救无效死亡的猪视网膜组织切片，视网膜移植片在宿主猪视网膜下腔平行伸展，极性相同。其中A石蜡×100；B苏木精染色×100，宿主视网膜断裂系染色中明胶牵拉、皱褶所致，C苏木精染色×400注T(移植物)，H(宿主视网膜)，Gel(明胶)。
图9为11#猪左眼移植术后1月视网膜下腔可见供体视网膜平铺伸展，层次消失，细胞核密集、异染色质富集(苏木精伊红染色×400)，未见坏死或炎症细胞浸润，局部与宿主视网膜有丝状连接(黑箭)。
图10-A为10#猪右眼移植术后3月视网膜下腔可见供体平铺伸展，局部与宿主视网膜有融合(黑箭)，未见坏死或炎症细胞浸润；苏木精伊红染色×100。
图10-B为10#猪右眼移植术后3月视网膜下腔可见供体局部与宿主视网膜有融合(黑箭)。苏木精伊红染色×400。
图11-A为5#猪右眼移植术后5月，视网膜下腔可见供体平铺伸展，表面有纤维胶质样层状结构增生(黑箭头)，未见坏死或炎症细胞浸润；苏木精伊红染色×100。
图11-B为5#猪右眼移植术后5月，视网膜下腔可见供体表面有纤维胶质样层状结构增生(黑箭头)；苏木精伊红染色×400。
图11-C为5#猪右眼移植术后5月，视网膜下腔可见供体，局部可见与宿主视网膜融合(黑箭)。神经纤维层(hNFL)、内核层(hINL)、移植物(T)。GFAP-FITC标记×400。苏木精伊红染色×400。
图12为5#猪右眼移植术后5月，宿主视网膜的神经纤维层(hNFL)及内核层(hINL)可见GFAP阳性染色，提示müller细胞及胶质细胞阳性表达；移植物(T)中也同时发现GFAP阳性细胞散在分布，并且在融合部位相对较多(白箭)。
图13为9#猪左眼视网膜移植术后9月，视网膜下腔可见供体视网膜平铺伸展(黑箭)，局部可见与宿主视网膜有纤维连接(黑箭头)，未见坏死或炎症细胞浸润。苏木精伊红染色×400。
图14为2000年美国专利说明书US-6045791公开的，将视网膜色素上皮细胞移植到鼠视网膜下腔后14天的结果，可见(1)移植物中只有视网膜色素上皮细胞，缺少视网膜的另外9层细胞，(2)移植物和宿主之间没有看到有组织结构的连接，(3)移植物和宿主均结构层次紊乱。图中的RPE(视网膜色素上皮层)，IS(内节)，OS(外节)，ONL(视网膜外核层)，OPL(外丛状层)，INL(视网膜内核层)。
图15为图14的局部放大。图中的RPE(视网膜色素上皮层)，IS(内节)，OS(外节)，ONL(视网膜外核层)，OPL(外丛状层)，INL(视网膜内核层)。
图16为9#光变性猪左眼视网膜移植术前mfERG三维、波描记阵列，后极部中央区视网膜(1-2环)波形振幅都较低平(圈)。左三维图，右波描记阵列。
图17为9#光变性猪左眼视网膜移植术后1月mfERG三维、波描记阵列，后极部中央区视网膜(1环)的波形规则、振幅明显升高(圈)。左三维图，右波描记阵列。
图18为9#光变性猪左眼视网膜移植术后2月mfERG三维、波描记阵列，各环与术前相比，改变不明显。左三维图，右波描记阵列。
图19为9#光变性猪左眼视网膜移植术后3月mfERG三维、波描记阵列，各环与术前相比，改变不明显。左三维图，右波描记阵列。左三维图，右波描记阵列。
图20为9#光变性猪左眼视网膜移植术后5月mfERG三维、波描记阵列，后极部中央区视网膜(1-2环)的波形振幅明显升高(圈)。左三维图，右波描记阵列。
图21为9#光变性猪左眼视网膜移植术后8月mfERG三维、波描记阵列，后极部中央区视网膜(1-2环)的波形振幅明显升高(圈)。左三维图，右波描记阵列。
具体实施例方式
本发明的上述方法可以通过实施例进一步说明，但本发明不仅仅限于以下的实施例。
实施例1明胶片的制备称取2.5克明胶粉，放入已消毒的小空瓶中，加入5毫升无菌生理盐水，配成50％的浓度。将瓶盖上插一针头后，放入水浴锅中加热煮沸。待明胶颗粒完全溶化后，稍冷却倒入直径7毫米的圆柱状模型中，完全冷却后将明胶脱模，用振动切片机切削成圆形150微米厚的明胶片，浸入4摄氏度生理盐水中备用。
实施例2全层视网膜片的保存取出供体的附有脉络膜的全层视网膜，迅速平铺于明胶片表面，脉络膜面向上，在4小时以内浸入保存液中，保存液可采用市售的Ames’液、中期保存液、冻存剂、以及1号抗冻剂和2号抗冻剂。(1)Ames’液的成分为NaCl 120(mM/L)，KCl3.6(mM/L)，MgSO41.2(mM/L)，CaCl21.2(mM/L)，NaHCO323(mM/L)，NaH2PO4 0.1(mM/L)，Na2HPO4 0.4(mM/L)，Glucose10(mM/L)。(2)中期保存液的成分为以细胞培养基DMEM作为基础液，加入0.05mmol/L地塞米松(上海新华制药厂)、2.5％硫酸软骨素(美国Sigma公司)、1％葡聚糖(分子量4×104，上海化学试剂厂)、105U/L妥布霉素、0.03％L-谷氨酰胺，用HEPES(美国Sigma公司)缓冲液调节，pH为7.2-7.4，渗透压浓度为350-410mmol/L。(3)冻存剂的成分为40％DMEM、20％DMSO、40％FCS。(4)1号抗冻剂成分为20％人血清白蛋白，5％二甲基亚砜，75％DMEM；2号抗冻剂成分为20％人血清白蛋白，7.5％二甲基亚砜，72.5％DMEM。
保存方法为Ames’液中的组织片置入4度冰箱中保存不超过4小时。中期保存液中的组织片置入4度冰箱中保存不超过1天。冻存剂中的组织片置于负80度冰箱中保存不超过1周。1号抗冻剂和2号抗冻剂的处理方法为将视网膜组织片移入装有1号抗冻剂的保存瓶中，置4℃冰箱20分钟；再移入装有2号抗冻剂的保存瓶中，置4℃冰箱20分钟。然后将装有组织片的2号保存瓶置于程序降温仪中进行程序降温起始温度为4℃，以-1.5℃/分钟从4℃降至-30℃、以-9℃/分钟降至-80℃。最后将2号保存瓶放入-196℃液氮罐内长期保存不超过1月。
使用时，Ames’液或中期保存液中的组织片取出后置于葡萄糖生理盐水溶液中漂洗即可备用。冻存剂中的组织片需进行复温将冻存管放入37℃水浴复温约1分钟，待组织片表面仅残留一层薄冰时取出，吸尽冻存剂，加细胞培养基漂洗3次后即可备用。1号抗冻剂和2号抗冻剂中的组织片也需进行复温将冻存管从液氮罐中取出，放入37℃水浴复温约1分钟，待组织片表面仅残留一层薄冰时取出，吸尽冻存液，加细胞培养基漂洗3次后备用。
实施例3全层视网膜片的激光微切削除层处理将附着有脉络膜的全层视网膜片平铺于明胶片表面，脉络膜面向上(图1)。吸净脉络膜表面的残余液体，采用美国鹰视酷眼系统的193nm的准分子激光机，其脉冲频率400Hz、跟踪频率400Hz、激光光斑0.95毫米、脉冲能量1.6mJ、延迟时间4-8ms，采用小光斑飞点扫描，将瞄准光聚焦于脉络膜前表面正中央，利用光学角膜磨镶模式模式发射激光(图2)，至肉眼下切削区域可透见映衬其下的白色为止(图3)。光学角膜磨镶模式模式切削深度50～85微米。将激光微切削脉络膜后的组织行明胶双面包埋，37度水浴融化2分钟制成全层视网膜组织片，浸入保存液中备用。保存液可采用市售的Ames’液。
实施例4全层视网膜片激光微切削除层处理后的显微结构观察为观察激光微切削除层处理后的组织片的显微结构，验证激光切削的深度，将激光微切削后的组织片连同明胶片一起浸泡于4％多聚甲醛中固定2-3天，石蜡包埋，切片5微米厚，常规行苏木精伊红染色，光学显微镜下观察，可见脉络膜已经完全去除，得到明胶双面包埋的完整结构的全层视网膜片(图4)。
实施例5全层视网膜片的在动物体内的结构和功能观察为验证准分子激光切削后的组织片的活性，我们用白色荧光灯(波长400-700nm，照射强度25001ux，照射时间12h/d)持续照射3月龄广西巴马小型猪达6个月以上，慢性诱导小型猪视网膜变性(图5)。然后将明胶包埋的全层视网膜组织片置入4度冰箱冷却5分钟后，再将组织片切成2×4毫米大小的矩形条，浸入Ames’液，在超净台的紫外灯下消毒30分钟，经自制的视网膜植入器对小型猪的11只眼球行视网膜移植，通过玻璃体切割+视网膜切开植入全层视网膜移植片，术后1-8月行活体眼底照相、眼底荧光造影、组织学切片观察结构，行多焦视网膜电图检查视功能。
在长达8月的随访中，活体眼底照相和眼底荧光造影并未观察到有移植物被包裹、溶解，宿主黄斑水肿、视网膜炎症等排斥反应的迹象(图6，7)。组织学切片证实移植成功8眼，移植成功率72.73％，宿主均未见坏死或炎症细胞浸润。有1只猪视网膜移植完成后，因麻药过量抢救无效死亡，立即取眼球固定，组织学观察发现供体视网膜色素上皮-视网膜神经上皮层全层移植片被明胶包夹，在宿主猪视网膜下腔平行伸展，结构完整，与宿主视网膜极性相同(图8)。
术后1月取猪眼球行冰冻切片，组织学HE染色，猪视网膜下腔可见供体视网膜平铺伸展，层次消失，细胞核密集、异染色质富集，未见坏死或炎症细胞浸润，局部与宿主视网膜有丝状连接(图9)。
术后3月猪视网膜下腔可见供体视网膜平铺伸展，层次不清，细胞核较密集，未见坏死或炎症细胞浸润，局部与宿主视网膜有融合(图10)。
术后5月，猪视网膜下腔可见供体视网膜平铺伸展，层次不清，表面有纤维胶质样层状结构增生，局部可见与宿主视网膜融合，未见坏死或炎症细胞浸润(图11)。
在上述术后5月的宿主视网膜下腔中，在宿主视网膜的神经纤维层及内核层可见GFAP阳性染色，提示müller细胞及胶质细胞阳性表达；移植物中也同时发现GFAP阳性细胞散在分布，并且在融合部位相对较多(图12)。
术后9月，猪视网膜下腔可见供体视网膜平铺伸展，层次不清，表面有纤维胶质样层状结构增生，局部可见与宿主视网膜有纤维连接，未见坏死或炎症细胞浸润(图13)。
与2000年美国专利说明书US-6045791公开的视网膜色素上皮细胞移植后14天的结果(图14-15)相比，可见视网膜色素上皮细胞移植后(1)移植物中只有视网膜色素上皮细胞，缺少视网膜的另外9层细胞，(2)移植物和宿主之间没有看到有组织结构的连接，(3)移植物和宿主均结构层次紊乱。
多焦视网膜电图是无创、定量和直观评价视网膜功能的方法。在术前(图18)及视网膜移植术后1月(图19)、2月(图20)、3月(图21)、5月(图22)、8月(图23)随访检查9#光变性猪的多焦视网膜电图的三维密度、波描记阵列。从图中可以看出光照6个月后，9#变性猪的多焦视网膜电图波描记阵列中，后极部中央区视网膜(1-2环)每个刺激单元的波形振幅都较低平，证明白色荧光灯持续照射3月龄猪达6个月以上，可慢性诱导小型猪视网膜变性。术后1月时，虽然波形有些不规则，但后极部中央区特别是1环的波形规则、振幅明显升高；术后2-3月时，各环与术前改变不明显；而术后5、8月时，后极部中央区视网膜(1-2环)的波形振幅明显升高。
取7只光变性猪眼，按视网膜移植术后存活月份分组行多焦视网膜电图检测，和其自身术前(n＝7)及正常猪眼(5眼)进行比较。取多焦视网膜电图主波P1波作为观察对象，发现光变性猪眼移植术后视网膜功能的变化趋势是1环在术后1月时P1波振幅密度非常显著升高、而后下降、3、5、8月时又高于术前，但均低于正常猪眼；2环在术后5、8月P1波振幅显著升高；1、2环P1波潜伏期均无显著变化；4、6环P1波潜伏期在术后2、3、5月显著延长。由此提示光变性猪眼视网膜移植术后早期(术后1月)中央1环视网膜功能非常显著升高，后期(术后5、8月)1、2环视网膜功能有改善，3-6环视网膜功能无明显改善。
以上结果还受到移植过程中移植器械、理化环境等诸多因素的影响，但是72.73％的移植成功率和术后视功能的提高已经能够充分说明这种将全层视网膜组织从供体取材、分离、制备成移植片的方法，是安全有效的、能够保持全层视网膜片的层次结构和功能活性，并且使用方便、操作精确。
当然，本分离制备方法不局限于制备全层视网膜片，也可使用准分子激光微量、精确切削视网膜的各层，得到相应的组织片，也属于本发明的保护范围。
此外，本发明不仅适用于视网膜组织片，对于其他类似的组织片，只要采取了上述准分子激光切削方法和明胶包埋方法，也属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种全层视网膜组织片的体外分离制备方法，其特征是方法包括以下步骤1)、明胶片的制备将明胶粉中加入无菌生理盐水，加热煮沸溶化后，在圆柱状模型中冷却，然后用振动切片机切削成明胶薄片，4℃度环境中保存备用；2)、全层视网膜片的保存将供体的附有脉络膜的全层视网膜，平铺于明胶片表面，脉络膜面向上，在4小时以内浸入保存液中备用；3)、全层视网膜片的激光微切削除层处理采用准分子激光机，利用光学角膜磨镶模式发射激光，将全层视网膜片附着的脉络膜通过微切削除去，然后用明胶双面包埋，浸入保存液中备用。
2.根据权利要求1所述的一种全层视网膜组织片的体外分离制备方其特征是所述保存液可采用市售的Ames’液、中期保存液、冻存剂、以及1号抗冻剂和2号抗冻剂，其相应的保存方法为Ames’液在4℃环境中保存4小时；中期保存液在4℃环境中保存1天；冻存剂在负80度冰箱中保存1周；1号抗冻剂和2号抗冻剂处理后在深低温程序降温仪中保存1月。
全文摘要
本发明涉及一种全层视网膜组织片的体外分离制备方法，方法包括1.明胶片的制备，将明胶粉中加入无菌生理盐水，加热煮沸溶化后，在圆柱状模型中冷却，然后用振动切片机切削成明胶薄片，保存备用；2.全层视网膜片的保存将供体的附有脉络膜的全层视网膜，平铺于明胶片表面，脉络膜面向上，在保存液中备用；3.全层视网膜片的激光微切削除层处理采用准分子激光机，利用光学角膜磨镶模式发射激光，将全层视网膜片附着的脉络膜通过微切削除去，然后用明胶双面包埋，浸入保存液中备用。本发明能精确、微创、迅速、方便地将全层视网膜组织与其紧密附着的脉络膜分离开，并且在分离制备过程中保持全层视网膜完整的层次结构和良好的组织活性。
文档编号C12N5/02GK1961846SQ20061009527
公开日2007年5月16日 申请日期2006年12月8日 优先权日2006年12月8日
发明者阴正勤, 陈少军, 李世迎, 余涛, 刘勇 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院