专利名称：一种枯草芽孢杆菌的胞外抗菌蛋白质及其分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌的胞外抗菌蛋白质及其分离纯化方法。
背景技术：
任何一种生物在自然界都不可能是孤立的存在，各种生物能够生存，都得益于其自身防御机制。植物、微生物等能够合成一些小分子抗生物质，如酚类(Phenols)、黑色素(Melanins)、丹宁酸(Tannins)或植物凝集素类(Phytoalexins)等物质。其次还能合成抗菌蛋白质，抗菌蛋白质是由基因编码的生物大分子，抗菌蛋白质从类型上可以分为是诱导型表达抗菌蛋白质和组成型表达抗菌蛋白质。抗菌蛋白质的作用主要是抵抗病原菌的入侵，提高生物体本身的抗病性，维护生命活动的延续和正常活动。抗菌蛋白质研究在最近几年取得了很大进展，随着蛋白质研究术、分离和纯化技术的深入以及生物质谱技术的飞速发展，人们对抗菌蛋白质的研究和认识不断的深入，对自然界各种生物的自身防御体系有了进一步的认识。人们已大量从动物、植物、和微生物中分离和纯化到多种抗菌蛋白质，几乎每天都有新的发现，目前人们已经发现了数以百计的抗菌蛋白质和抗菌肽。
枯草芽孢杆菌是一种有益的土壤细菌。枯草芽孢杆菌具有发达的分泌系统和较强的适应性，抗逆性。在农业生产中广泛应用。枯草芽孢杆菌对多种病原菌具有拮抗性能，生产中用于防治多种植物病害。在防治芒果的软腐病、辣椒炭疽病、苹果轮纹病、水稻纹枯病、水稻白叶枯病和一些镰刀菌引起的病害中均有应用。
枯草芽孢杆菌分泌的抗菌物质种类较多，主要有两种，低分子量抗菌素和抗菌蛋白质。目前已鉴定的枯草芽孢杆菌产生的抗生素有数十种，主要是脂肽类和肽类化合物。如非核糖体途径合成的脂肽类抗生素表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturins)和fengycin，这类抗菌素分子量比较小，研究已经有近50年的历史。
抗菌蛋白质的研究在最近十多年也有开展。刘伊强，王雅平从枯草芽孢杆菌TG26中，在70％的(NH4)2SO4饱和度时分离到一个分子量14.5kD左右，等电点为5.58；该抗菌蛋白质中富含谷氨酸、酪氨酸和脯氨酸，属于一种具有活性的偏酸性蛋白，同时该蛋白在高温高压处理后仍保持大部分活性，对热稳定，对蛋白酶和胰蛋白酶部分敏感，该蛋白质对Gibberellazeae有较强的抗菌活性(参见ZL 92112764.2)；童有仁、马志超等分离了枯草芽孢杆B034拮抗蛋白质，在70％的(NH4)2SO4饱和度时获得了分子量50.3KD，等电点6.25抗菌的蛋白质，该蛋白质对水稻白叶枯病菌有拮抗作用，作者对其部分序列进行了测定；谢栋等从枯草芽孢杆菌BS-98中分离到抗菌蛋白质X98III，分子量为59kD，等电点为4.5，该蛋白质对苹果轮纹病菌(Physalospora piricola)有较强的抗菌活性；林东，刘忆舟等分离了枯草芽孢杆菌SO113分泌的抗菌蛋白质，对水稻白叶枯病菌具有很好的抑制作用；研究表明Bacillus subtilis SO113至少能分泌2种抗菌蛋白(在pH6.0时至少一种带负电，另一种带正电)，且这些抗菌蛋白都是由染色体编码的。
有许多学者研究了枯草芽孢杆菌的抗菌物质，但主要集中于对粗提物的理化性质的研究，未明确确定抗菌物质的组成，活性成分。上述抗菌物质的研究多数集中于小分子抗菌素的研究，研究抗菌蛋白质的也未明确揭示抗菌蛋白质的组成、也未利用生物质谱技术对抗菌蛋白质进行鉴定，抗菌蛋白质的生物功能并不清楚，也未见克隆抗菌蛋白质的功能基因的报道。
枯草芽孢杆菌Bs-916是从土壤分离获得的对水稻纹枯病菌有较好拮抗作用的菌株，并于2002年9月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.0808，江苏省农业科学院曾经用枯草芽孢杆菌Bs-916(保藏号为CGMCC No.0808)与井冈霉素复配申请了专利(专利号ZL 02138379.0，证书编号199610)。近几年将枯草芽孢杆菌Bs-916大面积应用于防治水稻纹枯病取得了比较理想的效果，但对枯草芽孢杆菌Bs-916的胞外抗菌蛋白质没有深入研究，也未见有相关的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于通过对枯草芽孢杆菌的胞外抗菌蛋白质的研究，尤其是对枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的研究，揭示Bs-916的抗菌作用和抗菌机制，前期研究了Bs-916对几种植物病原菌的抗菌活性及其毒力效果，并在此基础上向社会提供一种新的枯草芽孢杆菌的胞外抗菌蛋白质及其分离纯化方法。
本发明的目的是这样实现的一种枯草芽孢杆菌的胞外抗菌蛋白质，其特征在于经SDS-PAGE检测，其分子量大约为41.9kD；经过胰蛋白酶消解后，用基质辅助激光解吸附离子化-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行鉴定，胞外抗菌蛋白质存在26个质荷比峰(m/z)，他们分别是849.390、874.44、1016.58、1108.56、1178.60、1184.65、1191.65、1207.60、1244.65、1298.56、1478.79、1513.91、1529.89、1536.63、1572.83、1588.84、1888.83、2104.06、2163.01、2265.13、2299.04、2309.04、2324.97、2511.04、2526.97和2542.99；再经过电喷雾四极杆飞行时间串联质谱(Q-TOF2)分析后获得五个肽的氨基酸序列，氨基酸序列分别为VTIVDEKGR，FSFSDVHNR，VYIADSTNFK，ELPISENLASVNMR，EAEWAYMITGK；胞外抗菌蛋白质和枯草芽孢杆菌的草酸盐脱羧酶、地衣芽孢杆菌的草酸盐脱羧酶具有显著的相关性。
在本发明中，所述的胞外抗菌蛋白质具有广谱的抗菌活性。所述的广谱抗菌活性是指对担子菌亚门、子囊菌亚门、半知菌亚门的病原菌具有抗菌活性。
在本发明中，所述的胞外抗菌蛋白质具有核糖核酸酶活性和凝集素活性。
一种如上所述的枯草芽孢杆菌的胞外抗菌蛋白质的分离纯化方法，其特征在于
a)从枯草芽孢杆菌Bs-916中分离粗蛋白质；b)将粗蛋白质用DEAE Sepharose F.F.分离后，在紫外光OD280nm处检测，有A、B、C三个吸收峰，其中B峰收集液具有抑菌活性，经SDS-PAGE检测，B峰收集液不是单一蛋白质条带。
c)将B峰收集液再经Phenyl Sepharose 6F.F.分离后，在紫外光OD 280nm检测，有D、E两个吸收峰，其中E峰收集液具有抑菌活性，经SDS-PAGE检测，E峰也不是一个蛋白质条带。
d))E峰收集液经羟基磷石灰石柱分离后，在紫外光OD 280nm检测，有F、G两个主峰，其中G峰收集液具有抑菌活性，将G峰收集液经SDS-PAGE检测，G峰收集液中只有1个蛋白质带，其分子量大约为41.9kD；G峰各管收集液中的蛋白质即为纯化获得的Bs-916的胞外抗菌蛋白质。
在本发明的分离纯化方法中所述的从枯草芽孢杆菌Bs-916中分离粗蛋白质是将枯草芽孢杆菌Bs-916移入YPG(酵母膏5g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，水1000ml)培养液中，28℃下120r/min振荡培养48h，4℃10000rpm离心10min，滤去菌体，用细菌滤器真空抽滤，获得枯草芽孢杆菌Bs-916的无菌滤液，再将硫酸铵加入至枯草芽孢杆菌Bs-916的无菌滤液中，硫酸铵的饱和度为100％，4℃下过夜后，12000rpm离心25min，去上清，沉淀物用0.067mol/L的磷酸缓冲液洗下，置于透析袋中，4℃透析48h后，获取抗菌粗蛋白质。
本发明的优点在于本发明是一种从枯草芽孢杆菌Bs-916中分离纯化获得新的胞外抗菌蛋白质，它表现出多种生物功能抗菌蛋白质表现出广谱的抗菌活性，对担子菌亚门、子囊菌亚门、半知菌亚门的多种病原菌表现出广谱的抗菌活性，特别指出，该抗菌蛋白质对Alternaria属的病原菌具有很高的毒力，目前生产上对由Alternaria属病原菌引起的早疫病害缺乏有效的防治措施；抗菌蛋白质广谱的抗菌活性对保护作物天然品质、减少农药残留具有广泛应用前景；同时，抗菌蛋白质还表现出核糖核酸酶活性和凝集素活性，具有多种生物功能。
图1是抗菌粗蛋白质经的DEAE Sepharose Fast Flow柱层析图；图2是抗菌粗蛋白质B峰收集液经Phenyl Sepharose 6F.F.柱层析图；图3是抗菌粗蛋白质E峰收集液经羟基磷石灰石柱的层析图；图4是抗菌蛋白质的SDS-PAGE电泳图；图5是抗菌蛋白质对水稻纹枯病菌的抑制作用；图6是抗菌蛋白质对水稻稻瘟病菌的抑制作用；图7是抗菌蛋白质对油菜菌核病菌的抑制作用；图8是抗菌蛋白质对甘蓝黑斑病菌的抑制作用；图9是抗菌蛋白质对白菜黑斑病菌的抑制作用；图10是抗菌蛋白质对灰霉病菌的抑制作用；图11是抗菌蛋白质的核糖核酸酶活性测定结果；图12是抗菌蛋白质的MALDI-TOF-MS的胰蛋白酶酶切肽图；图13是电喷雾四极杆飞行时间串联质谱解析的第1条肽氨基酸序列图；图14是电喷雾四极杆飞行时间串联质谱解析的第2条肽氨基酸序列图；图15是电喷雾四极杆飞行时间串联质谱解析的第3条肽氨基酸序列图；图16是电喷雾四极杆飞行时间串联质谱解析的第4条肽氨基酸序列图；图17是电喷雾四极杆飞行时间串联质谱解析的第5条肽氨基酸序列图。
具体实施例方式
实施例1将枯草芽孢杆菌Bs-916移入YPG培养液中(所述的YPG培养液为胰蛋白胨5g、葡萄糖5g、酵母膏5g)，28℃下120r/min振荡培养48h，4℃10000rpm离心10min，滤去菌体，用细菌滤器真空抽滤，获得枯草芽孢杆菌Bs-916的无菌滤液，再将硫酸铵加入至枯草芽孢杆菌Bs-916的无菌滤液中，硫酸铵的饱和度为100％，4℃下过夜后，12000rpm离心25min，去上清，沉淀物用0.067mol/L的磷酸缓冲液洗下，置于透析袋(截留分子量为8～10KD)中，4℃透析48h后，获取袋内物质，即为抗菌粗蛋白质。
取上述制备的胞外粗蛋白质，过DEAE Sepharose Fast Flow(Amersh-am生产)层析柱，柱体积25ml。DEAE Sepharose Fast Flow柱层析采用步行法层析。层析柱预先用0.1M NaCl-25mMTris-HCl(pH8.01)平衡后，上样品10ml后，分别采用0.25M，0.50M和1M NaCl-25mMTris-HCl(pH8.01)进行分步层析，分别收集，每管收集2.0ml。层析流速1ml/min，上样流速1ml/min。共检测到三个蛋白质吸收峰(A、B、C)(见图1)，检测各收集管对水稻纹枯病菌的抑菌活性，其中B峰具有抑菌活性。SDS-PAGE电泳检测具有抗菌功能收集液的蛋白质的组成。将具有抑菌活性的B峰再过Phenyl Sepharose 6F.F.层析柱，(Ame-rsham预装柱，柱体积为1ml)。Phenyl Sepharose 6F.F.采用梯度层析。先用2M(NH4)2SO4-25mMTris-HCl，平衡层析柱后，上样B峰收集液6ml，采用2M(NH4)2SO4-25mM Tris-HCl-0-25mMTris-HCl梯度洗脱，每管收集1.5ml。析流速1ml/min，上样流速1ml/min。共获得二个吸收峰(D、E)(见图2)，检测各收集液对水稻纹枯病菌的抑菌活性，其中E峰收集液具有抑菌活性。SDS-PAGE电泳检测具有抗菌的蛋白质的组成E峰不是单一的蛋白质条带。将经Phenyl Sepharose 6F.F.层析柱层析后具有抑菌活性的F峰收集液用羟基磷石灰石柱层析，柱体积为1ml，采用梯度法洗脱。采用20mM磷酸缓冲液平衡缓冲体系，上样后用20mM磷酸缓冲液洗脱不能吸附的蛋白质，再用20mM-0.6M磷酸缓冲液梯度洗脱20个柱体积，流速为1ml/min，上样流速为1ml/min。分管收集，每管收集1.5ml，测定有蛋白质吸收峰的各管收集液对水稻纹枯病菌的抑菌活性。共获得二个峰(F、G)(见图3)，其中G峰具有抑菌活性，SDS-PAGE电泳检测具有抗菌的蛋白质的组成，发现G峰为单一的蛋白质条带，(见图4，图中1为标准分子量的蛋白质，2为本抗菌蛋白质)。
SDS-PAGE电泳采用垂直板电泳，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。层析系统为AKTA Explore低压层析系统(Amersham AKTAExplore system)。
实施例2抗菌蛋白质抑菌谱测定采用滤纸片法。病原菌分别为水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisease)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、甘蓝黑斑病菌(Alternaria oleracea)、白菜黑斑病菌病菌(A.brassicae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)。将上述病原菌培养于PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml)上，待长出新鲜菌落后，用打孔器将上述病原菌制成6.5mm的菌丝块，将新鲜菌丝块分别移入PDA培养基平板中央，待菌丝生长后，在距离菌丝快25mm处对角线放置无菌滤纸片(直径65mm)，一侧加入分离的抗菌蛋白质，另一侧加入0.067M磷酸缓冲液作为对照。每处理重复3次。待菌丝生长至对照处时观察抗菌蛋白质对不同病原菌的抑菌活性。发现抗菌蛋白质对担子菌亚门，如水稻纹枯病菌(见图5)、对子囊菌亚门，如水稻稻瘟病菌(见图6)，油菜菌核病菌病原菌(见图7)等病菌；对半知菌亚门，如白菜黑斑病菌(见图9)、甘蓝黑斑病菌(见图8)、灰霉病菌(见图10)等具有较强的抑菌抗菌活性。
测定了抗菌蛋白质对水稻纹枯病菌、甘蓝黑斑病菌、白菜黑板病菌、灰霉病菌的EC50。将抗菌蛋白质分成3个剂量分别加入到8ml 45℃的PDA培养基中，迅速倒入无菌平板。对照加入缓冲液。将上述病原菌分别移入到PDA平板的中央，待对照张满平板后，量取菌落直径，计算抗菌蛋白质对病原菌的抑制率，计算抗菌蛋白质对不同病原菌的EC50。
抗菌蛋白质对几种病原菌的毒力测定结果表明，抗菌蛋白质对水稻纹枯病的EC50为2.740μM；灰霉病菌的EC50为4.011μM；对白菜黑斑病菌的EC50为0.055μM；对甘蓝黑斑病菌的EC50为0.087μM。结果显示枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质尤其对Alternaria属的病原菌具有较高的毒力，对甘蓝黑斑病菌、白菜黑板病菌的EC50分别为水稻纹枯病菌的1/49.8和1/31.5(见表1)。
表1是抗菌蛋白质对几种病原菌的抑制中量(EC50)
实施例3凝集素活性的测定方法离心获得兔子红细胞，用PBS缓冲液(pH 7.2)将兔子红细胞配制成2％的悬浮液。抗菌蛋白质进行双倍数稀释，在20℃下，每浓度分别取50μl和2％的兔子红细胞PBS悬浮液50μl在U型盘(U-Plates)中混合均匀，在测定不同浓度下，用无蛋白质的磷酸缓冲液作为对照。20℃下静置大约1小时后，等到对照红细胞全部沉淀后，观察处理中的红细胞凝集状况。凝集素的单位(The hemagglutination titer)的定义最高稀释倍数下仍然呈现凝集素活性，这个浓度就是该蛋白质的一个凝集素单位(one titer)，蛋白质的凝集素活性是以每毫克的有多少个凝集素活性单位来表示的。应用上述方法测定，结果表明该蛋白质具有凝集素活性。
核糖核酶酸活性的测定采用酵母tRNA的方法测定抗菌蛋白质的核糖核酸酶活性。酵母tRNA按照200μg溶于150μl 100mM MES(pH 6.0)，取150μl和抗菌蛋白质混合，至于37℃下1小时进行反应。反应结束时加入3.4％的高氯乙酸350μl中止反应，冰浴15分钟后，4℃下离心(15000g，15min)。测定上清液OD260。结果表明，该抗菌蛋白质具有核糖核酸酶活性(见图11)。
实施例4抗菌蛋白质的基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾四极杆飞行时间串联质谱(Q-TOF)分析由中国军事医学院生物测试中心测定，质谱数据检索利用网络资源(www.matrixscience.com)。鉴定结果表明抗菌蛋白质的MALDI-TOF-MS数据获得26个质荷比峰(m/z)(见图12)，他们分别是849.390、874.44、1016.58、1108.56、1178.60、1184.65、1191.65、1207.60、1244.65、1298.56、1478.79、1513.91、1529.89、1536.63、1572.83、1588.84、1888.83、2104.06、2163.01、2265.13、2299.04、2309.04、2324.97、2511.04、2526.97和2542.99。在Matrix Science数据库中鉴定，共发现有20个(类)蛋白质质谱数据有匹配，但相关性并不显著。
电喷雾四极杆飞行时间串联质谱(Q-TOF)结果表明，枯草芽孢杆菌B-916胞外抗菌蛋白质共获得5条肽的氨基酸序列，它们分别为VTIVDEKGR(图13)，FSFSDVHNR(图14)，VYIADSTNFK(图15)，ELPISENLASVNMR(图16)，EAEWAYMITGK(图17)。在Matrix Science数据库中鉴定，发现有2个蛋白质具有相关性。分别为枯草芽孢杆菌的脱羧酶和地衣芽孢杆菌的脱羧酶具有同源性。但对这两个蛋白质的抗菌性能及其核糖核酸酶活性、凝集素活性未见报道。
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌的胞外抗菌蛋白质，其特征在于经SDS-PAGE检测，其分子量大约为41.9kD；经过胰蛋白酶消解后，用基质辅助激光解吸附离子化-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行鉴定，胞外抗菌蛋白质存在26个质荷比峰m/z，他们分别是849.390、874.44、1016.58、1108.56、1178.60、1184.65、1191.65、1207.60、1244.65、1298.56、1478.79、1513.91、1529.89、1536.63、1572.83、1588.84、1888.83、2104.06、2163.01、2265.13、2299.04、2309.04、2324.97、2511.04、2526.97和2542.99；再经过电喷雾四极杆飞行时间串联质谱(Q-TOF2)分析后获得五个肽的氨基酸序列，氨基酸序列分别为VTIVDEKGR，FSFSDVHNR，VYIADSTNFK，ELPISENLASVNMR，EAEWAYMITGK；胞外抗菌蛋白质和枯草芽孢杆菌的草酸盐脱羧酶、地衣芽孢杆菌的草酸盐脱羧酶具有显著的相关性。
2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌的胞外抗菌蛋白质，其特征在于所述的胞外抗菌蛋白质具有广谱的抗菌活性。
3.根据权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌的胞外抗菌蛋白质，其特征在于所述的广谱抗菌活性是指对担子菌亚门、子囊菌亚门、半知菌亚门的病原菌具有抗菌活性。
4.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌的胞外抗菌蛋白质，其特征在于所述的胞外抗菌蛋白质具有核糖核酸酶活性和凝集素活性。
5.一种如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌的胞外抗菌蛋白质的分离纯化方法，其特征在于a)从枯草芽孢杆菌Bs-916中分离粗蛋白质；b)将粗蛋白质用DEAE Sepharose F.F.分离后，在紫外光OD 280nm处检测，有A、B、C三个吸收峰，其中B峰收集液具有抑菌活性，经SDS-PAGE检测，B峰收集液不是单一蛋白质；c)将B峰收集液再经Phenyl Sepharose 6F.F.分离后，在紫外光OD 280nm检测，有D、E两个吸收峰，其中E峰收集液具有抑菌活性，经SDS-PAGE检测，E峰也不是一个蛋白质条带；d)E峰收集液经羟基磷石灰石柱分离后，在紫外光OD 280nm检测，有F、G两个主峰，其中G峰收集液具有抑菌活性，将G峰收集液经SDS-PAGE检测，G峰收集液中只有1个蛋白质条带，其分子量大约为41.9kD；G峰各管收集液中的蛋白质即为纯化获得的Bs-916的胞外抗菌蛋白质。
6.根据权利要求5所述的一种枯草芽孢杆菌的胞外抗菌蛋白质的分离纯化方法，其特征在于所述的从枯草芽孢杆菌Bs-916中分离粗蛋白质是将枯草芽孢杆菌Bs-916移入YPG培养液中，28℃下120r/min振荡培养48h，4℃10000rpm离心10min，滤去菌体，用细菌滤器真空抽滤，获得枯草芽孢杆菌Bs-916的无菌滤液，再将硫酸铵加入至枯草芽孢杆菌Bs-916的无菌滤液中，硫酸铵的饱和度为100％，4℃下过夜后，12000rpm离心25min，去上清，沉淀物用0.067mol/IL的磷酸缓冲液洗下，置于透析袋中，4℃透析48h后，获取抗菌粗蛋白质。
全文摘要
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌的胞外抗菌蛋白质及其分离纯化方法。胞外抗菌蛋白质的分子量约为41.9kD；经过胰蛋白酶消解后，质谱鉴定存在26个质荷比峰(m/z)；由电喷雾四极杆飞行时间串联质谱获得五个肽的氨基酸序列VTIVDEKGR，FSFSDVHNR，VYIADSTNFK，ELPISENLASVNMR，EAEWAYMITGK；其分离纯化方法是从枯草芽孢杆菌Bs－916中分离粗蛋白质后，用DEAE Sepharose F.F.分离，将其中的B峰收集液再经Phenyl Sepharose 6 F.F.分离，将其中的E峰收集液经羟基磷石灰石柱分离，获得的G峰收集液即为纯化的胞外抗菌蛋白质。该蛋白质具有广谱的抗菌活性、核糖核酸酶活性和凝集素活性。
文档编号C12N9/88GK1974597SQ20061009784
公开日2007年6月6日 申请日期2006年11月15日 优先权日2006年11月15日
发明者刘永锋, 陈志谊 申请人:江苏省农业科学院