专利名称：水产养殖及景观水体用复合微生态制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种水产养殖及景观水体用复合微生态制剂，属水产微生物学和生态学制品及其制造领域。
背景技术：
水产品的养殖过程中一般采用高密度和集约化的方式，使得水体中许多有害物质积累，从而直接或间接地危害水体中的养殖生物，微生态控制技术由于众多优点日益得到人们的重视，国内有很多产品出售。但是现有产品存在许多局限性微生物菌种适应温度的范围较窄；菌体太小，絮凝性状不太好，不易收集；菌种数量比较单一，对各种水质类型的适应性不强，应用范围不够宽；没有考虑其对水产养殖生物的安全性问题，粗放式固态发酵和液体发酵生产的产品存在质量性能不稳定，有效活菌数少等问题。
发明内容
本发明要解决的就是上述现有技术存在的问题，提供一种水产养殖及景观水体用复合微生态制剂。
本发明由水生假丝酵母(Candida aquatica)、球形酵母(Saccharomyces globosus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)这四种菌及各自的培养基按0.5-1.7∶0.0-1.5∶1.0-3.0∶1.0-2.5的质量比配制而成。
各菌种的种子和发酵培养基由下列物质配制而成水溶液，培养基组分范围如下(单位g/L)水生假丝酵母糖蜜5-15，蛋白胨0-1，葡萄糖5-15，氯化氨1-4，酵母膏0.1-0.5，磷酸二氢钾0.2-1.0，磷酸氢二钾0.5-1.5，硫酸镁0.3-0.8，氯化钠0.4-0.7，硫酸亚铁(0.001-0.005)×10-3，水1L。
球形酵母糖蜜6-14，蛋白胨0-2，葡萄糖7-16，氯化氨1.5-3.0，酵母膏0.2-0.7，磷酸二氢钾0.3-0.8，磷酸氢二钾0.4-1.5，硫酸镁0.35-0.7，氯化钠0.3-0.9，硫酸亚铁(0.002-0.005)×10-3，水1L。
枯草芽孢杆菌糖蜜2-13，蛋白胨1-6，葡萄糖2-8，氯化氨0.5-3.0，酵母膏0.15-0.45，磷酸二氢钾0.25-0.6，磷酸氢二钾0.6-0.9，硫酸镁0.2-1.0，氯化钠0.2-1.3，硫酸亚铁(0.001-0.004)×10-3，水1L。
施氏假单胞菌糖蜜6-17，蛋白胨1.5-4，葡萄糖3-10，氯化氨0.7-2.5，酵母膏0.21-0.7，磷酸二氢钾0.1-0.7，磷酸氢二钾0.3-1.2，硫酸镁0.4-0.9，氯化钠0.1-0.8，硫酸亚铁(0.002-0.007)×10-3，水1L。
本发明的制备方法包括如下步骤1)小摇瓶复壮将4种菌的斜面分别用接种环在无菌操作条件下，接种于含相应培养基的小摇瓶中，分别在摇床中进行纯培养；2)大摇瓶扩增将小摇瓶中培养合格的4种菌分别在无菌操作条件下转移至含相应培养基的大摇瓶中，分别在摇床中进行纯培养；3)种子罐发酵培养基的制备配制种子罐发酵培养基，进行种子罐和相关管道的蒸汽高温灭菌后冷却到所需温度；4)种子罐发酵在火焰保护下迅速通过接种阀门向4个种子罐分别接入经检验培养合格的种子液，接种量为10％-20％；5)二级发酵罐培养基制备配制二级发酵罐发酵培养基并放入，对发酵罐和相关管道进行蒸汽高温灭菌后冷却到所需温度；6)二级发酵罐大规模发酵通过降低二级发酵罐的压力和增大种子罐的压力，将经检验合格的4个种子罐的种子液移入二级发酵罐中进行增殖培养，移种量为10％-20％7)成品灌装将经检验合格的二级发酵罐的菌液按比例移入已灭菌的储罐中进行通气搅拌混匀5-12h后，然后在无菌灌装间进行灌装。
前述步骤1)和2)的培养条件为温度27-37℃，转速110-220r/min，培养时间为17-24h；要求镜检菌无污染且形态正常，每种菌活菌数不低于108/mL。
前述步骤1)和步骤2)中培养基的用量分别为30mL和500mL，步骤1)中的小摇瓶的容量为150mL，步骤2)中的大摇瓶的容量为2500mL。
前述步骤3)和步骤5)中蒸汽高温灭菌的温度条件为，条件121℃，持续20-30min后停止，对发酵罐保压至0.02-0.18MPa之间和降温至27-37℃之间。
前述于步骤4)的发酵条件为温度27-37℃，搅拌机转速110-220r/min，培养时间为17-24h，通气量4m3/h，罐压0.02-0.18MPa，pH值为3.0-7.0；要求镜检菌无污染且形态正常，每种菌活菌数不低于108/mL。
前述步骤6)中的发酵条件温度27-37℃，搅拌机转速110-220r/min，培养时间为17-24h，通气量4m3/h，罐压保持范围是0.02-0.18MPa。要求镜检菌无污染且形态正常，每种菌活菌数不低于108/mL。
经步骤7)制得的成品中每种菌活菌数不低于108/mL。
由于本发明所含的4种菌均为活菌，因此其还会分泌产生的一些其它有益因子，如酶，氨基酸，生物素，维生素等，这4种菌及其分泌的有益因子能分解对养殖动物有害的物质，作为浮游生物和养殖动物的养料，促进其生长，可以提高养殖动物的免疫力，预防疾病等。因此，本发明可以降解并转化水产养殖及景观水体的富营养化物质，净化水质，并且具有抑制水体中的蓝绿藻的功能，可用于各种海、淡水养殖(虾、蟹、鱼、贝类)动物育苗池和养成池以及一些富营养化水体等。本发明克服了现有产品的许多缺点，具有适应温度范围广，菌种数量丰富，菌种类型多，对各种水质类型的适应性较强，应用范围宽，考虑了对水产养殖生物的安全性问题，并且采用密闭液体深层发酵工艺和整个过程的无菌生产方法等保证了产品的质量和性能，大大提高了有效活菌数高，实际高达108/mL以上等。
具体实施例方式
实施例1复合微生态制剂发酵培养基的制备4菌种的发酵培养基按照下列要求配制(单位g/L)水生假丝酵母糖蜜10，葡萄糖10，氯化氨1，酵母膏0.2，磷酸二氢钾0.6，磷酸氢二钾0.7，硫酸镁0.4，氯化钠0.5，硫酸亚铁4×10-3，水1L。
球形酵母糖蜜10，葡萄糖10，氯化氨1.5，酵母膏0.3，磷酸二氢钾0.5，磷酸氢二钾0.7，硫酸镁0.5，氯化钠0.5，硫酸亚铁5×10-3，水1L。
枯草芽孢杆菌糖蜜10，蛋白胨2，葡萄糖5，氯化氨1，酵母膏0.35，磷酸二氢钾0.4，磷酸氢二钾0.7，硫酸镁0.5，氯化钠0.5，硫酸亚铁4.5×10-3，水1L。
施氏假单胞菌糖蜜10，蛋白胨2，葡萄糖5，氯化氨0.8，酵母膏0.4，磷酸二氢钾0.3，磷酸氢二钾0.5，硫酸镁0.5，氯化钠0.5，硫酸亚铁5.5×10-3，水1L。
按照上述比例分别称量100L的原料，混合好后在发酵罐中进行高温灭菌，冷却到适合温度，在接种量10％，pH7.0，通气量4m3/h，培养温度30℃，培养时间24h的条件下分别在4个100L发酵罐中进行发酵，发酵结束时，通过平板稀释法检测枯草芽孢杆菌、施氏假单胞菌、水生假丝酵母和球形酵母的生物量分别为1×109个/mL、3×109个/mL、9×108个/mL和2×108个/mL。
实施例2复合微生态制剂种子培养基的制备4菌种的大摇瓶种子培养基按照下列要求配制(单位g/L)水生假丝酵母糖蜜10，葡萄糖10，氯化氨1，酵母膏0.2，磷酸二氢钾0.6，磷酸氢二钾0.7，硫酸镁0.4，氯化钠0.5，硫酸亚铁4×10-3，水1L。
球形酵母糖蜜10，葡萄糖10，氯化氨1.5，酵母膏0.3，磷酸二氢钾0.5，磷酸氢二钾0.7，硫酸镁0.5，氯化钠0.5，硫酸亚铁5×10-3，水1L。
枯草芽孢杆菌糖蜜10，蛋白胨2，葡萄糖5，氯化氨1，酵母膏0.35，磷酸二氢钾0.4，磷酸氢二钾0.7，硫酸镁0.5，氯化钠0.5，硫酸亚铁4.5×10-3，水1L。
施氏假单胞菌糖蜜10，蛋白胨2，葡萄糖5，氯化氨0.8，酵母膏0.4，磷酸二氢钾0.3，磷酸氢二钾0.5，硫酸镁0.5，氯化钠0.5，硫酸亚铁5.5×10-3，水1L。
按照上述比例分别称量500mL的原料，混合好后在大摇瓶中进行高温灭菌，冷却到适合温度，将小摇瓶中经镜检培养合格的4种菌分别在无菌操作条件下按接种量15％的比例转移至2500mL的大摇瓶中，在摇床中进行培养，条件为培养温度30℃，通气量是100％，培养时间为24h，摇床转速170r/min，培养结束时，通过平板稀释法检测枯草芽孢杆菌、施氏假单胞菌、水生假丝酵母和球形酵母的生物量分别为2×109个/mL、3×109个/mL、5×108个/mL和3×108个/mL。
实施例3复合微生态制剂生产发酵工艺参数研究在不同的接种量、通气量、初始pH值、培养温度和培养时间下对4株不同的微生物进行培养发酵，对发酵产物进行菌落计数，以筛选最佳的发酵条件。分别在发酵后的6h、9h、12h、15h、18h和24h对发酵基质的动态变化、发酵产物的产量的变化进行分析，以了解实时的发酵情况。在上述试验的基础上确立分批发酵和连续发酵两种不同生产工艺的具体工艺条件和要求，提出不同需求下的生产方式，试验结果详见表1和表2。
表1 不同发酵条件下微生物的生长情况
由表1可知，枯草芽孢杆菌和施氏假单胞菌发酵最适的起始pH为7.0，接种量为10％，培养温度为30℃，培养时间为18-24h，通气量为100％；水生假丝酵母和球形酵母发酵最适的起始pH为5.6，接种量为10％，培养温度为30℃，培养时间为12-18h，通气量为100％。在各菌种的最适培养条件下，4菌种分别在发酵后的6h、9h、12h、15h、18h和24h对发酵基质和发酵产物的产量的变化进行分析结果详见表3。
表2 不同发酵时间的发酵动态
由表2可见，在培养的过程中，pH的降低与底物的消耗和菌量的增长有直接的关系，pH的急剧降低时正是菌量开始对数增长的阶段，碳源和氮源也开始被大量的消耗。在上述试验的基础上确立分批发酵和连续发酵两种不同的生产工艺。分批发酵为生产至9-12h补料，补料后3-6h出料。连续发酵为生产至12-15h出料70％，补充70％培养基后按原有模式继续培养，如此循环往复连续培养3天作为一周期。
实施例4复合微生态制剂的制备1)小摇瓶复壮将4种菌的斜面分别用接种环在无菌操作条件下，接种于含30mL种子培养基的150mL的小摇瓶中，在摇床中进行纯培养，条件为培养温度30℃，培养时间24h，摇床转速150r/min，镜检菌无污染且形态正常，每种菌活菌数不低于108/mL；2)大摇瓶扩增将小摇瓶中经镜检培养合格的4种菌分别在无菌操作条件下转移至含500mL种子培养基的2500mL的大摇瓶中，在摇床中进行纯培养，条件为培养温度30℃，培养时间24h，摇床转速170r/min，镜检菌无污染且形态正常，每种菌活菌数不低于108/mL；3)种子罐培养基制备分别配制枯草芽孢杆菌、施氏假单胞菌、水生假丝酵母和球形酵母的发酵培养基均为80L，然后加入到4个种子发酵罐中，进行种子罐和相关管道的蒸汽高温灭菌，条件是125(±5)℃，时间是30min，灭菌后用循环冷却水冷却到30℃左右，发酵罐保压至0.1MPa；4)种子罐发酵在火焰保护下迅速通过接种阀门向4个种子罐分别接入经检验培养合格的种子液，接种量为15％，发酵培养条件为通气量4m3/h，培养温度30(±1)℃，培养时间24h，发酵罐保压至0.1MPa，搅拌机转速150r/min，罐压0.10MPa，pH值为正常发酵状态值3.5左右；镜检菌无污染且形态正常，每种菌活菌数不低于108/mL。
5)二级发酵罐培养基制备分别配制枯草芽孢杆菌、施氏假单胞菌、水生假丝酵母和球形酵母的发酵培养基800L，800L和1600L，1600L，对4个二级发酵罐和相关管道进行蒸汽高温灭菌，条件是125(±5)℃，时间是30min，灭菌后用循环冷却水冷却到30℃左右，发酵罐保压至0.1MPa；6)二级发酵罐大规模发酵通过降低4个二级发酵罐的压力和增大4个种子罐的压力，将经检验合格的4个种子罐的种子液移入相应的二级发酵罐中进行增殖培养，发酵培养条件为通气量4m3/h，培养温度30(±1)℃，培养时间24h，发酵罐保压至0.1MPa，搅拌机转速170r/min，罐压0.10MPa，pH值为正常发酵状态值3.5左右；镜检菌无污染且形态正常，每种菌活菌数不低于108/mL。
7)成品灌装将经检验合格的二级发酵罐的菌液按比例移入已灭菌的储罐中进行通气搅拌混匀10h后，然后在无菌灌装间进行灌装。
实施例5复合微生态制剂的组合及其对养殖池塘饵料微生物的影响将水生假丝酵母、球形酵母、枯草芽孢杆菌、施氏假单胞菌按0.8∶1.2∶2.3∶1.5组合成复合微生态制剂后对养殖池塘饵料生物进行优化试验，结果表明，在藻类的结构组成上，试验塘在7月份之后，即由原来的34种和35种逐步演变为42种，其优势种主要为硅藻、绿藻、裸藻和部分蓝藻，其中试验2号塘主要为硅藻和绿藻。而对照塘自始至终蓝藻为明显的优势种，7～9月正值高温季节，蓝藻水华种群更为突出和严重。藻类种群即由原来的34种演变为21种。从藻类结构的组成表明，复合微生态制剂对有害的蓝藻水华种群的抑制作用明显，对藻类结构具有调节功能，其结果使试验塘的蓝藻由优势转化为劣势种，并由藻类组成的单一性转变为多样性。浮游动物也具有相同的规律，即试验塘主要为原生动物和大型水蚤，而对照塘主要为轮虫。根据Shannon生物多样性指数评价水质环境，复合微生态制剂对池塘饵料生物的组成和数量不但具有优化功能，而且对缓解池塘水质有机污染起着重要作用。从池塘藻类生物量的测定结果来看，复合微生态制剂对蓝藻生物量具有明显的控制作用，而对其它藻类生物量又具有促进生长繁殖，提高生物量的作用。试验塘对蓝藻的控制率试验1号塘为75％，试验2号塘为86％，对其它藻类生物量的增长率为100～200％，这对增加适口性饵料生物，提高生产力、增加产量，具有非常重要的作用。从浮游动物生物量的测定结果也显示出同样的规律。
实施例6复合微生态制剂在不同养殖生态中的应用将水生假丝酵母、球形酵母、枯草芽孢杆菌、施氏假单胞菌按0.5∶1.5∶2.0∶1.5组合成复合微生态制剂后应用不同的养殖水体中，实验结果如下(1)复合微生态制剂无论是对室内的小水体，还是对室外大面积的养殖水体，其均具有较强的水质净化功能。复合微生态制剂可稳定pH值.提高水体的溶氧量，降低水体中氨氮.亚硝酸盐.硫化物和COD等的含量，维持水体良性的生态平衡。
(2)复合微生态制剂细胞个体较小、营养丰富、易于消化，应用于罗氏沼虾育苗，作为蚤状幼体开口饵料和后期幼体的过渡饵料，可促进幼体变态发育，增强幼体的活动能力，提高幼体的成活率，不仅能增加单位水体的出苗量(出苗量比对照组提高55.9％)，而且能使虾苗个体规格更整齐，是对虾育苗期较佳的营养添加剂。
(3)采用复合微生态制剂40～60mL/40m3的剂量全池泼洒，南美白对虾幼虾的成活率可不同程度地提高、相对增长率和幼虾的丰满面度系数，同时还可优化养殖水体的水质，稳定水体的pH值和使DO含量提高30％，降低水中氨氮、亚硝酸盐和COD，为水产生物的生存提供一个健康有利的生态环境，对养殖水体的病害防治和保持水域的生态平衡起着重要的作用。采用全池泼洒的方法使用简便，效果良好，值得在大面积的养殖生产中推广使用。
实施例7复合微生态制剂对养殖水体有机物的生物降解将假丝酵母、枯草芽孢杆菌、假单胞菌按2∶1∶2组合成复合微生态制剂后来净化养殖水体中有机物，试验结果见表3。
表3 复合菌株对养殖水体中有机物的生物降解
从表3可以看出，复合微生态制剂的适应范围最广，48h的降解率也最大，可达82-91％，其最大降解率比单一菌株作用48h时的30％、50％和70％的最大降解率分别提高200％，80％和30％。在降解率提高的同时，可使假丝酵母和芽孢杆菌的接种量由2‰下降为0.05％，下降率为97.5％。此比例的组合为水产养殖水体的有机污染净化提供了较为优化的生物降解方法，具有一定的实际意义。
权利要求
1.一种水产养殖及景观水体用复合微生态制剂，其特征在于以水生假丝酵母、球形酵母、枯草芽孢杆菌和施氏假单胞菌为活性成份，由四种菌及各自的培养基按0.5-1.7∶0.0-1.5∶1.0-3.0∶1.0-2.5的质量比配制而成。
2.如权利要求1所述水产养殖及景观水体用复合微生态制剂，其特征在于每种菌的活菌数均不低于108/mL。
3.如权利要求1所述水产养殖及景观水体用复合微生态制剂，其特征在于可以降解并转化水产养殖及景观水体的富营养化物质，抑制蓝绿藻生长，净化水质。
4.如权利要求1或2所述水产养殖及景观水体用复合微生态制剂，其特征在于各菌种的种子和发酵培养基由下列物质配制而成水溶液，培养基组分范围如下(单位g/L)水生假丝酵母糖蜜5-15，蛋白胨0-1，葡萄糖5-15，氯化氨1-4，酵母膏0.1-0.5，磷酸二氢钾0.2-1.0，磷酸氢二钾0.5-1.5，硫酸镁0.3-0.8，氯化钠0.4-0.7，硫酸亚铁(0.001-0.005)×10-3，水1L；球形酵母糖蜜6-14，蛋白胨0-2，葡萄糖7-16，氯化氨1.5-3.0，酵母膏0.2-0.7，磷酸二氢钾0.3-0.8，磷酸氢二钾0.4-1.5，硫酸镁0.35-0.7，氯化钠0.3-0.9，硫酸亚铁(0.002-0.005)×10-3，水1L；枯草芽孢杆菌糖蜜2-13，蛋白胨1-6，葡萄糖2-8，氯化氨0.5-3.0，酵母膏0.15-0.45，磷酸二氢钾0.25-0.6，磷酸氢二钾0.6-0.9，硫酸镁0.2-1.0，氯化钠0.2-1.3，硫酸亚铁(0.001-0.004)×10-3，水1L；施氏假单胞菌糖蜜6-17，蛋白胨1.5-4，葡萄糖3-10，氯化氨0.7-2.5，酵母膏0.21-0.7，磷酸二氢钾0.1-0.7，磷酸氢二钾0.3-1.2，硫酸镁0.4-0.9，氯化钠0.1-0.8，硫酸亚铁(0.002-0.007)×10-3，水1L。
5.权利要求1至4任意一项所述水产养殖及景观水体用复合微生态制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)小摇瓶复壮将4种菌的斜面分别用接种环在无菌操作条件下，接种于含种子培养基的小摇瓶中，分别在摇床中进行纯培养；2)大摇瓶扩增将小摇瓶中培养后经检验合格的4种菌分别在无菌操作条件下转移至含种子培养基的大摇瓶中，在摇床中进行纯培养；3)种子罐发酵培养基的制备配制种子罐发酵培养基并放入种子罐中，种子罐和相关管道的蒸汽高温灭菌后冷却到所需温度；4)种子罐发酵在火焰保护下迅速通过接种阀门向4个种子罐分别接入经检验培养合格的种子液，接种量为10％-20％；5)二级发酵罐培养基制备配制二级发酵罐培养基并放入二级发酵罐中，对二级发酵罐和相关管道进行蒸汽高温灭菌后冷却到所需温度；6)二级发酵罐大规模发酵通过降低二级发酵罐的压力和增大种子罐的压力，将经检验合格的4个种子罐的种子液移入二级发酵罐中进行增殖培养，移种量为10％-20％7)成品灌装将经检验合格的二级发酵罐的菌液按比例移入已灭菌的储罐中进行通气搅拌混匀5-12h后，然后在无菌灌装间进行灌装。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤1)和2)的培养条件为温度27-37℃，转速110-220r/min，培养时间为17-24h。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤3)和步骤5)中蒸汽高温灭菌的温度条件为，条件121℃，持续20-30min后停止，对发酵罐保压至0.02-0.18MPa之间和降温至27-37℃之间。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤4)的发酵条件为温度27-37℃，搅拌机转速110-220r/min，培养时间为17-24h，通气量4m3/h，罐压0.02-0.18MPa，pH值为3.0-7.0。
9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤6)中的发酵条件温度27-37℃，搅拌机转速110-220r/min，培养时间为17-24h，通气量4m3/h，罐压保持范围是0.02-0.18MPa。
10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于经步骤7)制得的成品中每种菌活菌数不低于108/mL。
11.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤1)和步骤2)中培养基的用量分另为30mL和500mL。
全文摘要
本发明公开了一种水产养殖及景观水体用复合微生态制剂及其制备方法，它以水生假丝酵母、球形酵母、枯草芽孢杆菌和施氏假单胞菌为活性成份，由四种菌及各自的培养基按0.5－1.7∶0.0－1.5∶1.0－3.0∶1.0－2.5的质量比配制而成。本发明可以降解并转化水产养殖及景观水体的富营养化物质，净化水质，并且具有抑制水体中的蓝绿藻的功能，可用于各种海、淡水养殖(虾、蟹、鱼、贝类)动物育苗池和养成池以及一些富营养化水体等。具有适应温度范围广，菌种数量丰富，菌种类型多，对各种水质类型的适应性较强，应用范围宽的特点。
文档编号C12N1/20GK1962488SQ20061009825
公开日2007年5月16日 申请日期2006年12月6日 优先权日2006年12月6日
发明者周国勤, 吴伟, 茆建强, 陈树桥 申请人:南京市水产科学研究所