蛋氨酸酶在抗蛋氨酸和抗高半胱氨酸的化学治疗中的应用的制作方法

专利名称：蛋氨酸酶在抗蛋氨酸和抗高半胱氨酸的化学治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋氨酸酶组合物，蛋氨酸酶的纯化方法，把蛋氨酸酶结合到聚合物如PEG(聚乙二醇)的方法，在抗氨蛋酸和抗高半胱氨酸的化学治疗中使用蛋氨酸酶的方法。更具体的说，本发明的方法包括蛋氨酸酶在癌症治疗，心血管病治疗和肿瘤造影和诊断中的使用。本发明还涉及重组DNA技术。本发明特别提供了编码蛋氨酸酶的表达模型。
背景技术：
以治疗药物为主的癌症疗法是指使用能够选择性抑制或杀灭癌细胞，但不对正常组织的功能造成超出可接受的范围的损伤的药物。常规疗法的难点在于治疗药物对正常组织的毒性。
现已发现在各种细胞类型和所评论的肿瘤组织中许多肿瘤都对蛋氨酸有绝对的需求。其中所述的细胞和肿瘤组织包括结肠、乳腺、前列腺、卵巢、肾、喉黑色素瘤、肉瘤、肺、脑、胃和膀胱中的肿瘤以及白血病和淋巴瘤。现已明确当生长培养基中的蛋氨酸被高半胱氨酸取代时，肿瘤的无生长能力已被定义为对蛋氨酸的依赖性。例如，参见Chello等，Cancer Res.，331898-1904，1973；和Hoffman，Anticancer Res.，51-30，1985。
现已表明去除蛋氨酸(methionine depletion)能够选择性地使依赖蛋氨酸的肿瘤细胞同步进入该细胞周期中的S/G2晚期，Hoffman等，Proc.Natl.Ad.Acad.Sci.USA.777306-7310，1980。联合使用去除蛋氨酸，接着与暴露于抗有丝分裂剂，即抗蛋氨酸的化学疗法，已经把肿瘤细胞从正常和肿瘤细胞的共培养物中选择性地去除，结果导致正常细胞细胞的培养物强有力地增生。Stern等，J.Natl.Cancer Inst.，76629-639，1986。
但是，为了在体内进行蛋氨酸依赖性化学疗法，必需有一种从血清中有效去除循环的蛋氨酸的方法，目前还没有人描述过这样一种去除蛋氨酸的方法，即这种方法能够降低体内循环的蛋氨酸的含量使其足以在抗肿瘤治疗中有效。
现已从各种细菌源纯化出一种能够降解蛋氨酸的酶即蛋氨酸酶，并且据报道这种酶能够减缓体外肿瘤细胞增生的速度。Kreis等，Cancer Res.，331862-1865和1866-1869，1973；Tanaka等，FEBS Letters.66307-311 1976；Ito等，J.Biochem.，791263-1272，1976和Nakayama等，Agric.Biol.Chem.，482367-2369，1984。
Kreis等，在Cancer Rs.，331866-1869，1973中已经描述了使用从产芽胞梭状芽胞杆菌(Clostridium sporgenes)中分离出的很不纯的蛋氨酸酶制剂，以1150单位/千克/天的量抑制移入小鼠模型中的癌肉瘤细胞的生长。尽管该酶明显降低了原发肿瘤细胞的生长，但是从未报道过把肿瘤直径的T/C率(处理与对照之比)降低到50％以下，并且也从未报道过对转移瘤有任何作用。作者也指出没有其他非特异性的干涉不能预测蛋氨酸酶的肿瘤特异性，而且作者也没有评论不纯制剂中内毒素或其他组分对所观察到的效果起的作用的可能性。所报道的唯一毒理研究是在治疗期之后动物体重没有减轻并且对毒性的一般肉眼检查呈阴性。另外，作者报道了这种酶具有4小时的血清半衰期。这种酶制剂只有一半纯度并且含有显著量的内毒素，这使得对该结果的解释复杂化。
而且，Kreis不能把血清蛋氨酸的含量降低到对照组的8％以下，这可能归因于芽胞杆菌(Clostridium)酶的高Km(大约90mM)。据报道蛋氨酸酶制剂不稳定并且在对它的纯化中只能获得2％回收(产率)。
Kreis等，在Cancer Res.，331866-1869，1973中还报道了一种抗肿瘤的方法即使用不含蛋氨酸的食物作为去除蛋氨酸的方法。但是，作者报道该饮食方法不能象使用不纯的蛋氨酸酶制剂一样有效地减缓细胞的生长，并且会导致动物体重持续下降这种不希望出现的副作用。作者没有报道联合使用不含蛋氨酸的食物与蛋氨酸酶治疗，并且没有研究细胞的同步化。
本发明的在先的申请提出了有效的肿瘤化学疗法，这些化学疗法是指使用蛋氨酸酶有效降低蛋氨酸的含量从而提供一种无损伤的抗肿瘤的有益效果。本发明通过提供一种用于生产商业上可行数量的高纯度重组蛋氨酸酶来改进这些申请提出了治疗和诊断方法以及组合物。

发明内容
现已发现，蛋氨酸酶，不论是PEG化(PEGylated)的形式还是所生产和纯化的高纯度的不含内毒素的重组形式，都能够无损害地去除哺乳动物体内的蛋氨酸含量，都能够有效地用于选择性抑制肿瘤的生长，并且还能够选择性地阻抑肿瘤细胞，使其与抗有丝分裂的化学疗法同步化。
现在也发现当协同使用好几种不同的方法来基本有效地降低蛋氨酸的含量时，蛋氨酸去除法是最有效的。这些方法包括使用不含蛋氨酸的饮食的蛋氨酸饥饿法，使用能够与蛋氨酸竞争蛋氨酸利用酶(methionine-utilizingenzyme)的抑制剂的蛋氨酸竞争性抑制法，利于由蛋氨酸去除法诱发的特定肿瘤选择性细胞周期阻抑的化学治疗剂以及这些方法的组合。
所以，本发明描述了一种抑制肿瘤细胞生长的方法，它包括把肿瘤细胞群与治疗有效量的本文所定义的蛋氨酸酶接触一段足以诱发细胞群中细胞的细胞周期停滞的时期，并形成静止的肿瘤细胞。“接触”一词是指把本发明的治疗组合物与靶肿瘤放得非常接近以至于能够观察到抑制肿瘤的作用，或者把本发明的治疗组合物放在一种培养基如营养培养基或血液中，以至于能使培养基中的蛋氨酸含量降低到能够抑制培养基中的肿瘤细胞生长的水平。“静止的”肿瘤细胞是指生长受抑制的肿瘤细胞。这种方法能够在体外或体内使用。与肿瘤细胞的接触不需要是直接的，它可以在体外或体内与含有肿瘤细胞的营养培养基接触来实现。这种接触也可以把循环血液与蛋氨酸酶接触来完成。当肿瘤是不能循环的固体肿瘤时这种循环血液可以含有肿瘤细胞或不含肿瘤细胞。“抑制肿瘤细胞的生长”是指服用本发明化合物能够减少肿瘤的生长，例如以体积来衡量，与未用该化合物治疗的肿瘤相比，肿瘤的体积可降低10％到100％，更优选为至少34％到79％，最优选为降低到55％到68％。
蛋氨酸酶通过去除蛋氨酸被用作减缓或终止细胞分裂的一种抗肿瘤剂。使用蛋氨酸的竞争性抑制剂能够增强这种作用。另外，把蛋氨酸酶与抗有丝分裂剂和其他细胞周期的特异性细胞毒素剂一起使用能够通过诱发细胞周期同步化来增加抗有丝分裂剂或其他细胞周期的特异性细胞毒素剂的治疗有效性。
蛋氨酸酶也能用于去除高半胱氨酸的化学疗法中来降低心血管疾病的危险和治疗心血管疾病。蛋氨酸酶也用于超高分辩率地探测和诊断肿瘤时，再充足供[11C]蛋氨酸之前去除血液和肿瘤中的[12C]蛋氨酸。
在一个技术方案中，首先使肿瘤细胞接受蛋氨酸饥饿步骤来首次降低蛋氨酸的含量。可不受限制地以高半肮氨酸伴随蛋饥饿法来降低对正常细胞的毒性，从而增加治疗的特异性。
本发明的其他相关方面的特征是使用本发明的蛋氨酸去除法来将肿瘤细胞阻抑在细胞周期中的S/G2晚期，接着进行同步开始细胞周期的处理并服用一种细胞周期的特异细胞毒素剂如抗有丝分裂剂来选择性地并有效地杀灭肿瘤细胞。本领域普通技术人员熟知对细胞周期具体阶段的细胞具有毒性的细胞周期特异性细胞毒素剂。这种方法包括下列步骤(a)使由上述蛋氨酸去除步骤产生的静止的肿瘤细胞与可诱发细胞周期的用量的蛋氨酸接触，以启动形成静止肿瘤细胞周期生长的细胞(cycling-cells)的细胞周期，和(b)使周期生长的细胞与一定量的细胞周期的特异性细胞毒素剂接触。这种周期生长的细胞毒素剂用量要足以抑制有丝分裂细胞的有丝分裂，由此抑制肿瘤细胞的生长。
在一个技术方案中，这种方法包括下列步骤(a)使由上述蛋氨酸去除步骤产生的静止肿瘤细胞与可诱发细胞周期用量的蛋氨酸接触来启动形成静止肿瘤细胞的有丝细胞的有丝分裂，和(b)使有丝分裂细胞与一定量的抗有丝分裂剂接触，这种抗有丝分裂剂用量要足以抑制有丝分裂细胞的有丝分裂，由此抑制肿瘤细胞的生长。
根据本发明的一个方面，提供了一种诊断患者的肿瘤的方法，包括a)通过给患者服用蛋氨酸酶来去除患者体内的12C蛋氨酸；b)通过给患者服用11C蛋氨酸来给患者体内充分供应蛋氨酸；和c)测定患者体内肿瘤细胞中存在的11C蛋氨酸升高的水平。
本发明另一个特征是使用蛋氨酸酶以降低患者体内的半胱氨酸水平来降低心血管疾病的危险性并治疗心血管疾病。
本发明提供了通过给药蛋氨酸酶以去除蛋氨酸来进行肿瘤诊断和造影的方法。
另一个特点是用于蛋氨酸去除治疗法的治疗组合物，它含有治疗有效量的基本分离出的蛋氨酸酶，这种蛋氨酸酶具有的比活性为每毫克(mg)蛋白至少大约10到40个单位的蛋氨酸酶活性且每毫克蛋白少于大约1到100ng的内毒素，在优选的方案中，该治疗组合物包括每毫克蛋白少于10ng的内毒素，与一种药学上合适的载体。
本发明的治疗组合物还包括不含内毒素的蛋氨酸酶，在一个技术方案中，蛋氨酸酶是使用一种新的有效的方法从在改良的发酵条件下生长的恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)中制得的。在这方面本发明还提供了一种分离改良的高效生产蛋氨酸酶的恶臭假单胞菌菌株的方法。在另一个方案中，蛋氨酸酶是由含有编码蛋氨酸酶的表达模型的重组宿主产生的。
本发明的蛋氨酸酶组合物也可以通过将蛋氨酸酶偶联到聚合物如聚乙二醇(PEG)而以一种化学修饰的形式提供。本发明使用的PEG修饰的蛋氨酸酶具有高效去除蛋氨酸的活性，延长的半衰期和低免疫原性。
本发明的蛋氨酸酶组合物也可以利用一种表达载体如本文所定义的高效表达载体所生产的重组蛋白的形态来提供。采用高效表达体系所生产的蛋氨酸酶能够很容易地使用本文所描述的方法来纯化以获得不含内毒素并且非常纯的蛋氨酸酶组合物，该组合物具有大约10到40个单位/毫克蛋氨酸酶的比活度。
本发明还提供了含有能够表达高得出奇的高含量蛋氨酸酶的核酸的载体。现在已经使用这种载体如那些使用T7RNA聚合酶启动子的载体，在适当的温育条件下生产大约1到4克蛋氨酸酶/升的蛋氨酸酶，其在粗制的组织匀浆液中比活度为大约2.6到5，可表示为大约总细胞蛋白的10％到20％。
本发明还提供了基因治疗方法，即本文所述的使用能够用来替代含有蛋氨酸酶组合物的克隆的蛋氨酸酶基因的方法。患者体内的细胞可以被改变来表达蛋氨酸酶为患者血清提供治疗量的蛋氨酸酶。
本发明还涉及分离出的核苷酸分子，含有图8中所提供的核苷酸序列和一个或多个能够在蛋氨酸酶的C-或N-端编码两个或多个组氨酸残基的核酸序列。
本发明还涉及使用一种表达模型的改良的基因疗法。
本发明的其他特征、优点和相关方案将以本文所包含的说明书为主进行阐述。
附图简述

图1以6个图形详细说明在不含蛋氨酸、不含高半胱氨酸、或不含蛋氨酸和高半胱氨酸培养基中肿瘤细胞系的生长。
图2详细说明蛋氨酸酶在小鼠异种移植中降低人的肺肿瘤(H460)生长水平的有效性。也详细说明了5-FU和长春新碱治疗的结果。
图3详细说明蛋氨酸酶、5-FU和长春新碱对移植人肺肿瘤(H460)鼠的体重作用。
图4、5和6示给三名患者服用蛋氨酸酶之后蛋氨酸酶和蛋氨酸的药物动力学。以蛋氨酸酶活性百分比作为蛋氨酸酶起始制剂活性的相对百分比。以蛋氨酸的百分比作为服用蛋氨酸酶之前蛋氨酸的相对百分比。
图7是对蛋氨酸酶-高半胱氨酸代谢循环的详细说明。
图8提供了从恶臭假单胞菌分离出来的编码蛋氨酸酶DNA分子的蛋氨酸酶的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。
图9图解载体中典型的高表达的模型。
图10简要说明获得高纯度、不含内毒素的蛋氨酸酶的纯化步骤简图。
图11概述使用本文所述的纯化方法时重组蛋氨酸酶(rMETase)的典型纯度和回收率。
图12提供了采用本发明方法纯化rMETase产物的例子。
图13提供了不同剂型的rMETase的活性图。
图14提供了对PEG-rMETase的HPLC的分析数据。
图15示不同PEG与rMETase的分子时PECT-rMETase的活性。
图16提供了在小鼠体内PEG-rMETase的药物动力学。
图17示rMETase对KB3-1细胞体外培养中的生长抑制作用。
图18提供了rMETase抗裸鼠的KB3-1细胞的有效性。
图19提供了以裸鼠体重示rMETase的毒性。
图20提供了rMETase对移植了KB3-1细胞的裸鼠血液细胞的毒性。
图21提供了rMETase对BALB/C小鼠的毒性。
图22提供了rMETase对BALB/C小鼠的毒性。
图23提供了对人患者中蛋氨酸酶的毒性评价。
图24提供了对人患者中蛋氨酸酶的药物动力学评价。
图25提供了证实rMETase对裸鼠体内的H460和HT29的生长抑制的数据。
图26提供了体外正常细胞和人癌细胞对rMETase的敏感性的对比。
这些附图不必要按比例绘制，本发明的某些特征可以在比例上放大并且为了清楚和简要以草图的形式表示。
发明内容A.定义
“氨基酸残基”是指在多肽肽链上化学消化(水解)多肽所形成的氨基酸。本文所述的氨基酸残基尤其是指“L”光学异构体形式。但是，只要多肽保留了所需的功能特性，“D”光学异构体上的残基能被任何L-氨基酸残基取代。NH2-是指存在于多肽氨基端的游离氨基。COOH是指存在于多肽羰基端的游离羰基。本文保留了标准的多肽命名法(在J.Biol.Chem.，243，3552-59，1969所描述的，并被37C.F.R.1.822(b)(2))采纳，这里引用为参考文件。
应当注意本文使用通式所表示的所有氨基酸残基序列的氨基端向羧基端的一般方向都是从左向右的取向。另外，把词组“氨基酸残基”较宽地定义为包括氨基酸表中所列的氨基酸以及改良的和不常用的氨基酸，如列于本文引用为参考文件的37CER 1.822(b)(4)中的那些氨基酸。而且，应当注意在氨基酸残基序列起始端或末端的短线表示对另一个单个的或多个的氨基酸残基序列的肽键或者对氨基端基团如NH2的或乙酰基或羧基端基团如COOH的共价键。
“重组DNA(rDNA)分子”指的是通过操作性连接两个DNA片段所形成的DNA分子。所以，重组DNA分子是含有在自然中通常发现不在一起的至少两个核苷酸序列的杂交的DNA分子。没有相同生物起源的即进化上不同的rDNA被称作为“异源的”rDNA。
“载体”指的是在细胞中能够自主复制的rDNA分子和为了使所附着的区段发生复制，能够可操作地连接DNA区段如基因或多核苷酸的rDNA分子。本文把能够导向表达编码一个或多个多肽的基因的载体称作“表达载体”。特别重要的载体能够容易地表达本发明的蛋氨酸酶蛋白。
B.使用蛋氨酸酶作为抗肿瘤剂的方法I.蛋氨酸的去除本文以各种方式使用蛋氨酸酶作为抗肿瘤剂来从肿瘤细胞、肿瘤组织或患有癌症的哺乳动物的循环系统中基本上去除蛋氨酸或者在如本文下面所详细描述的认为需要去除蛋氨酸的情况下，去除蛋氨酸。
尽管已有的方法能够把体内的蛋氨酸含量降低到不低于35μm左右，但是目前还没有一种能够安全、简便并迅速把蛋氨酸含量降低到几乎低于10μm左右的方法。基本上是指使用蛋氨酸的常规测定方法至少可测得蛋氨酸含量低于10μm，优选少于1μm，更优选少于0.1μm，最好是测定不出蛋氨酸的含量。使用一些方法能够在水溶液，包括体液如血液、血浆和血清中测定出蛋氨酸。一个举例说明的方法是使用蛋氨酸标准物的反相FPLC法。
在体内，哺乳动物的循环中，在组织培养物或其他生物培养基需要去除蛋氨酸的体外条件下，以及在体外操作生物体液、细胞或组织并接着放回哺乳动物患者的体内的离体方法中都能够进行去除。
从循环、培养基、生物体液或细胞中进行蛋氨酸的去除是为了减少进入要治疗物的蛋氨酸的量，因此它包括在去除蛋氨酸的条件下把要去除的物质与去除蛋氨酸量的本发明蛋氨酸酶接触，来降解被接触物质中的蛋氨酸。
因为肿瘤细胞依赖于它们营养培养基中的蛋氨酸，所以可以去除这些细胞的营养源，而不必去除这些细胞本身。因此，在体内应用本发明，使蛋氨酸酶与肿瘤细胞群的营养介质接触。在这种方案中，介质可以是血液、淋巴液、脑脊液等需要去除蛋氨酸的体液。
去除蛋氨酸的量能够根据使用的不同而在很宽范围内变化，并且一般取决于物质中存在的蛋氨酸的量、所需的去除速度和该物质对于暴露于蛋氨酸酶的耐受性。使用本领域所熟知的各种化学和生化方法能够很容易地监控物质中的蛋氨酸的含量和从该物质中去除蛋氨酸的速度。本文还描述了去除蛋氨酸量的例子，其中在每毫升被处理物质中，蛋氨酸酶的范围是0.001到100单位(U)，优选大约为0.01到10U，更优选为大约0.1到5U蛋氨酸酶的范围内变化。
去除蛋氨酸的条件是与蛋氨酸酶的生物活性相适应的缓冲液和温度条件，并且包括与该酶相适应的缓和的温度、盐和pH条件。尽管优选生理条件，但条件的例子包括4-40摄氏度(℃)左右、相对于0.05到0.2M NaCl的离子强度和5到9左右的pH。
在一个优选的方案中，本发明设想了使用蛋氨酸酶作为抗肿瘤剂的方法，所以它包括把肿瘤细胞群与治疗有效量的蛋氨酸酶接触一段足以诱发群体中的细胞的细胞周期停滞的时期，并形成静止的肿瘤细胞。
如本文所述，由于各种原因，包括但不限于，选择性地减缓肿瘤的生长、通过把停滞期的细胞保持一段延长的时期以产生细胞死亡的方法杀灭肿瘤细胞和在接着的化学治疗之前为细胞周期同步化制备肿瘤细胞群等，都需要使肿瘤细胞处于细胞周期停滞期。
通过与蛋氨酸酶接触诱发细胞周期停滞所需的时间取决于好几种因素，如与该细胞或含有该细胞的培养基所接触的蛋氨酸酶的量，蛋氨酸的量，酶的比活度，温度和其他影响反应速度的反应条件以及由实施者很容易控制的参数等。典型的时期是10分钟到30天左右，优选1小时到20天左右，更优选1到10天左右。
细胞周期的停滞是这样一种状态，其中细胞既不分裂也不通过全部周期过程进行循环，各个阶段分别称作G0、G1、G2和S期。正如通过相对于正常静息细胞DNA的累积所证实，据认为一旦去除蛋氨酸，细胞周期会停止在S/G2晚期停止。通过各种组织学方法进行测定，能够鉴定细胞周期停滞的方法，并且可以以细胞培养物进行评价，如实施例中所述该方法包括测定细胞群的DNA含量。
本治疗方法可用于的肿瘤包括任何恶性细胞型如在固体肿瘤或血液肿瘤中发现的恶性细胞。固体肿瘤的例子包括但不限于下列器官的肿瘤胰脏、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳房。血液肿瘤的例子包括骨髓肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤等。
在一个方案中，通过静脉内或腹腔内注射给药患者有效量的一种含有本发明的蛋氨酸酶的生理上可耐受的组合物来完成体内的接触，由此去除存在于患者体内循环的肿瘤细胞的蛋氨酸源。也能通过把蛋氨酸酶向含有肿瘤细胞的组织给药来完成蛋氨酸酶的接触。
蛋氨酸酶的治疗有效量是达到所需作用即去除肿瘤组织或患者循环中的蛋氨酸而计算好的预测量，因此使肿瘤细胞停止分裂。
所以，服用本发明蛋氨酸酶的剂量范围是足以产生所需的作用即减少肿瘤细胞分裂和细胞周期的症候的剂量范围。该剂量不能大到引起不利的副作用，如粘滞性过高症状，肺水肿，充血性心力衰竭等。通过剂量将随着患者的年龄、身体状况、性别和疾病程度的不同而变化，这是本领域普通技术人员能够决定的。
如果有并发症医生可以调整该剂量。
本发明蛋氨酸酶的治疗有效量一般是这样一种剂量，即服用一种生理上可耐受的组合物时足以使血管内(血浆)或局部的蛋氨酸酶浓度达到每毫升大约0.001到100单位(U)，优选在0.1U以上，更优选每毫升在1U蛋氨酸酶以上。普通的剂量是以体重为准服用，并且在大约5-1000U/kg/天，优选大约5-100U/kg/天，更优选大约10-50U/kg/天，最优选大约20-40U/kg/天的范围内。
在优选的方法中，所用的蛋氨酸酶基本上不含内毒素，正如本文进一步讨论的。特别优选的是使用重组体所产生的基本上不含内毒素的蛋氨酸酶。
该蛋氨酸酶能够通过注射或逐渐输注一段时间经肠道外给药。蛋氨酸酶也能通过静脉内、动脉内、腹膜内、经口腔、肌肉内、皮下、腔内、经皮、皮肤给药，能够通过蠕动方式运送，或者直接注射到含有肿瘤细胞的组织或通过与内含有潜在的生物传感器或蛋氨酸的导管相连的泵来给药。
含有蛋氨酸酶的治疗组合物通常静脉内给药，如注射单位剂量。术语“单位剂量”当用于本发明治疗组合物的说明书中时是指适于受治疗者的单一剂量的物理上分立的单位，每个单位含有能产生所需治疗作用的预测量的活性物质与所需稀释剂即载体或赋形剂(vehicle)。
该组合物是以与剂型一致的方式和一种治疗有效量给药的。所给的量取决于所治疗的对象，该对象系统对使用活性组分的能力和所需治疗有效的程度。需要给药的活性成分的精确量取决于医师的判断并且都是每个个体都是独特的。但是，本文公开了系统使用的适当剂量范围，它取决于给药的途径。也仔细考虑了适当的最初给药和加强剂量注射的方法，这种方法的特征是最初给药接着在一或多个小时的间隔又进行注射或给药重复的剂量。本文描述了多次给药的例子，它特别优选持续维持血清或组织蛋氨酸酶的高含量并相反持续维持血清或组织蛋氨酸的低含量。另一方面，也仔细考虑了足以把体内的血液中的浓度维持到体内治疗的特殊范围的连续静脉注射。
II.蛋氨酸的去除法在实现本发明的方法中，通过能够把含有蛋氨酸的物质与上文描述的蛋氨酸酶接触的去除蛋氨酸的同时还可伴有一种或多种附加的蛋氨酸去除步骤。而且，本发明考虑了要去除蛋氨酸的各种治疗步骤，本文会进一步描述。
a.蛋氨酸饥饿法例如，可以使用蛋氨酸饥饿步骤来首次降低周围的蛋氨酸含量，其中该饥饿步骤包括把肿瘤细胞与不含蛋氨酸的营养物接触一段时间即蛋氨酸饥饿期，这个步骤可以在与蛋氨酸酶接触步骤之前或过程中进行。蛋氨酸饥饿步骤可以包括在体外使用缺乏蛋氨酸的培养基即低含量或没有蛋氨酸的培养基，或者体内使用不含蛋氨酸的饮食。不含蛋氨酸的培养基在组织培养领域中是熟知的。该培养基的一个例子是含有非必需氨基酸的Eagle的基本培养基(缺少蛋氨酸和氯化胆碱)，如可从GIBCO得到。缺少蛋氨酸的氨基酸饮食也能够在以商业途径得到，包括从Teklad，Inc.得到的TD 92077饮食。
蛋氨酸饥饿步骤的时间可以根据具体应用的不同而大范围地变化，它是足以使细胞培养物，组织或血管的蛋氨酸浓度下降到较低水平并终止该水平进一步下降的时间。典型的时间可以从大约6小时到2个月，优选大约1天到2周。
因为蛋氨酸是一种必需的氨基酸，应当清楚在许多本发明方法的使用中都在某种程度上对正常细胞具有毒性。但是，如本文所描述的，正常细胞和肿瘤细胞能够不同地代谢蛋氨酸的前体高半胱氨酸，这样高半胱氨酸能够补充正常细胞中蛋氨酸的缺乏，同时又不挽救肿瘤细胞对蛋氨酸的依赖性。
所以，在一个相关的方案中，本发明考虑了一种使用缺乏蛋氨酸的营养物(培养基或饮食)的方法，它可以添加正常细胞所用的蛋氨酸的前体如高半胱氨酸或其类似物，来提供必需的营养补充。以大约5到200μM优选大约10到100μM的浓度向营养培养基中加入高半胱氨酸。
用于该方案的优选蛋氨酸的前体包括L-高半胱氨酸-硫内酯，高半胱氨酸和4-甲基硫-2-氧丁酸。
所以，在一个方案中，本发明包括用蛋氨酸缺乏的饮食喂养哺乳动物一段时间的步骤来去除血管内蛋氨酸。这种饮食可以任选包括蛋氨酸前体作为蛋氨酸的补充物。另一方面，这种蛋氨酸前体也可以通过注射或其他熟知的途径来服用。作为饮食补充物的高半胱氨酸优选的每日剂量是每天每千克体重大约5到约1000mg高半胱氨酸。
高半胱氨酸的给药途径一般和加入蛋氨酸酶的途径一样，它取决于运送该补充物到达的靶组织。
b.蛋氨酸酯的竞争性抑制剂按照实施例中所述的观察，我们进一步发现使用蛋氨酸酶的竞争性抑制剂可用来协同性增强本文所述的蛋氨酸去除法的作用。所以本发明考虑到使用蛋氨酸饥饿步骤还包括把肿瘤细胞与一定量的蛋氨酸的竞争性抑制剂接触一段足以能用蛋氨酸利用酶抑制蛋氨酸代谢的时间。用于指导竞争性抑制剂的蛋氨酸酶包括S-腺苷蛋氨酸脱羧酶，蛋氨酸t-RNA合成酶和蛋氨酸腺苷转移酶。
抑制蛋氨酸酶所需的时间优选在蛋氨酸饥饿期本身。
蛋氨酸的竞争性抑制剂与蛋氨酸竞争作蛋氨酸利用酶的底物，并通过直接竞争内源蛋氨酸可能产生的正常代谢的作用，也就是说抑制蛋氨酸的代谢。在细胞需要蛋氨酸和蛋氨酸辅助代谢的地方，该竞争性抑制剂起着降低蛋氨酸代谢的作用，因而需要更高的蛋氨酸浓度以产生与不存在抑制剂时观察到的效果相同的效果。
蛋氨酸的竞争性抑制剂可以是任何具有典型竞争性抑制剂功能的蛋氨酸衍生物。一般竞争性抑制剂包括蛋氨酸的烷基衍生物(即烷基硫堇)，其中甲硫氨酸(即蛋氨酸)的甲基可以被乙基取代(乙硫氨酸)，被丙基取代(丙硫氨酸)，被丁基取代(丁硫氨酸)，或者被戊基取代(戊硫氨酸)。
也考虑到把环亮氨酸和卤代蛋氨酸用作可利用的蛋氨酸竞争性抑制剂。一般卤代蛋氨酸选自于氟代蛋氨酸、氯代蛋氨酸、溴代蛋氨酸和碘代蛋氨酸。所以，所考虑到的蛋氨酸竞争性抑制剂选自于包括烷基硫堇、环亮氨酸和卤代蛋氨酸在内的一些物质，其中所说的烷基硫堇不是甲硫氨酸。
对竞争性抑制蛋氨酸有效的蛋氨酸竞争性抑制剂的量是在蛋氨酸的有效浓度内能够产生降低的作用的量。这种量相对于存在的蛋氨酸来说一般是超过一摩尔，这正如实施例中所显示的。抑制剂量的范围一般是相对于存在有被竞争的蛋氨酸的培养基中蛋氨酸浓度，超过10到1000倍摩尔的，优选超过至少20倍摩尔，更优选超过至少50倍摩尔。如本文所示，在体内使用抑制剂时，剂量一般是每千克动物体重大约5-30mg，优选大约25mg/kg。
有效时所需的抑制剂的量可以取决于服用该抑制剂时存在的内源蛋氨酸的量。通过在实施例中所显示的剂量滴定结果可以证实蛋氨酸浓度和抑制剂的有效浓度之间的关系，并可以通过竞争性抑制剂的典型反应速度理论进行限定。抑制剂的典型用量是从大约10μM到大约1mM。
而且，通过本文所描述的体外组织培养方法能够预测抑制剂的有效用量，这种方法包括首先采用本文所描述的任何方法在去除蛋氨酸的特殊肿瘤组织中建立有效的条件，接着测定抑制剂的有效浓度。
使用各种指示剂包括实施例中所描述的指示剂能够监控使用蛋氨酸竞争性抑制剂抑制蛋氨酸的代谢。这些指示剂包括在喂过不含蛋氨酸饮食的小鼠中，测定组织培养物的DNA含量，作为细胞周期停止和增强抑制肿瘤组织生长的指示剂。其他指示剂对本领域普通技术人员来说也是很清楚的。
C.使用多种蛋氨酸去除法-抗蛋氨酸化疗法的协同作用在一个方案中，为了利用在使用两种或多种不同的蛋氨酸去除法时发生的协同作用，本发明考虑到使用常称作抗蛋氨酸化疗法的多种蛋氨酸去除法。
本文所描述的蛋氨酸去除法包括(1)使用不含蛋氨酸的培养基(体外)或饮食(体内)的蛋氨酸饥饿法，(2)暴露给蛋氨酸酶以采用酶的方法去除内源性蛋氨酸，(3)以蛋氨酸竞争性抑制剂来降低内源蛋氨酸的有效浓度，特别是与上述(1)和(2)方法的结合，其中蛋氨酸的含量已经降低，以及(4)使用蛋氨酸的前体和本文所描述的高半胱氨酸来增加其他三种蛋氨酸去除法中的任何一种对肿瘤细胞的选择性。
所以，对蛋氨酸的去除来说，能够使用上述所定义的方法的任何一种组合，包括(1)+(2)，(1)+(3)，(2)+(3)，(1)+(2)+(3)和这四种组合的任何一种加(4)来进行本文所描述的抗蛋氨酸的化学疗法。
对最大限度地去除蛋氨酸和其代谢产物来说，特别优选使用不含蛋氨酸但含有蛋氨酸前体并同时使用蛋氨酸的竞争性抑制剂和蛋氨酸酶。
III.增强抗有丝分裂剂的肿瘤治疗作用在另一个方案中，本发明考虑到在方法中使用本文所述的蛋氨酸去除法来增加(增强)常规化疗法的效力和选择性，特别是癌症治疗所用的抗有丝分裂药的选择性。
把蛋氨酸去除步骤和常规的抗有丝分裂疗法结合使用的主要目的是利用这样一种情况即在有丝分裂之前蛋氨酸去除法能够选择性地并特异性地终止肿瘤细胞的增生，这样一旦用再充分供应蛋氨酸给细胞、组织、培养基或脉管系统，静止的细胞能够同步开始细胞周期，使得细胞群一致增生并且容易受到对细胞周期特异性化学疗法的作用。为了使肿瘤细胞进入细胞停滞期，可以使用任何细胞周期的细胞毒素剂。这种药剂对本领域普通技术人员来说是熟知的。在一个优选的方案中，该细胞周期的细胞毒素剂是一种抗有丝分裂剂。
所以，在一个优选的方案中，本发明考虑到一种抗肿瘤化疗法，它包括用本文所述的蛋氨酸去除步骤形成静止的肿瘤细胞，接着以另外的步骤(a)把静止的肿瘤细胞与诱发细胞周期用量的蛋氨酸接触来启动静止的肿瘤细胞的有丝分裂，形成有丝分裂细胞，和(b)把有丝分裂细胞与一定量的抗有丝分裂剂接触，这种用量足以抑制有丝分裂细胞的有丝分裂，由此抑制肿瘤细胞的生长。
把具有启动静止细胞的细胞周期功能的蛋氨酸、蛋氨酸盐及其功能等同物称作细胞周期诱发剂，并能够一起使用或另一方面在去除了蛋氨酸的肿瘤细胞群中作为启动一个或多个静止细胞中的细胞周期和有丝分裂的试剂。
细胞周期诱发剂的诱发细胞周期的量是能够在去除了蛋氨酸的肿瘤细胞群中至少启动一些(10％)，优选大多数，更优选至少90％的静止细胞中的细胞周期的用量。使用组织学的或代谢的标记物能够很容易地测定细胞周期的启动和程度。对蛋氨酸来说，诱发细胞周期的用量一般在大约1微摩尔(μM)到大约2.5毫摩尔(mM)的范围，优选大约10到250μM。当充分供应蛋氨酸时，同样地能把S期的特异性药物用于攻击仍在S期的任何肿瘤细胞。
把细胞周期诱发剂与静止的肿瘤细胞接触(使用)的途径能够变化，但一般与本文所描述的服用蛋氨酸酶或竞争性抑制剂所用的途径相同。
使静止的肿瘤细胞和细胞周期诱发剂接触的时间安排和时期可以根据肿瘤和其他考虑的不同而变化，这种考虑是能够根据经验通过如本文所描述的组织培养方法来决定的。周期诱发剂能够在抗有丝分裂剂之前或与抗有丝分离剂几乎同时加入。当已经测定到具体抗有丝分离剂迅速起作用并且细胞周期的诱发是缓慢的时候，在抗有丝分裂剂之前加入诱发剂是有利的。这些参数取决于肿瘤的具体类型、组织的部位、抗有丝分裂剂的选择等。而且，在使用治疗方法在体内给药之前，通过各种方法能够很容易地测定最优化的变量如时间的选择、剂量和药物的选择。优选的最优化方法是使用本文所描述的组织培养测定系统的例子。
接触一种抗有丝分裂剂的时间安排的选择取决于对静止的肿瘤细胞的细胞周期的诱发。在周期的任何时候一般都能把抗有丝分裂剂与有丝分裂的细胞接触，并马上使细胞成为有丝分裂细胞。对有些肿瘤细胞群来说，在加入诱发剂之后这种情况可以迅速发生，使得可以向静止的肿瘤细胞中同时或近乎同时加入诱发剂和抗有丝分裂剂。另一方面，在加入诱发剂大约1小时到30天后可以加入抗有丝分裂剂，但是优选在诱发的一天或两天之内。
本文所用的抗有丝分裂剂和其他细胞周期特异制剂能够是针对细胞增生、有丝分离或细胞周期具有细胞毒性基础的机理的任何试剂。所以，抗有丝分裂剂能够包括各种化合物即抗代谢剂，或其他对分裂(有丝分裂的)细胞具有毒性的化合物中的任意一种。用于本发明方法中的抗有丝分裂剂的优选临床药理学是对细胞有丝分离活性的抑制，对核酸合成、烷化剂、抗菌素、生物碱等抗肿瘤剂的抑制。就药理领域来说是不断提高的，应当清楚本发明是不限于目前已知的抗有丝分裂剂和其他细胞周期特异性制剂，而是包括使用已知的等同物、新发现或开发的化合物和其他具有必要活性的试剂。
烷化剂的例子包括环磷酰胺(CTX；癌得星)、苯丁酸氮芥(CHL；痛可宁)、顺氯氨铂(CisP；氯氨铂)、二甲磺酸丁二醇二酯(马利兰)、左旋苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BCNU)、链脲菌素、三亚乙基密胺(TEM)、丝裂霉素C和其他烷化剂。
抗代谢产物的例子包括氨甲喋呤(MTX)、足叶乙甙(VP16；鬼臼乙叉甙)、6-巯嘌呤(6MP)、6-thiocquanine(6GT)、阿糖胞甙(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5FU)、氮烯唑氨(DTIC)和其他抗代谢剂。
抗菌素的例子包括放线线菌素D、阿霉素(DEX；亚德里亚霉素)、多诺霉素(柔红霉素)、争光霉素、光辉霉素和其他抗菌素。
生物碱的例子包括长春生物碱如长春新碱(VCR)、长春碱等。
其他抗肿瘤剂包括紫杉酚及其衍生物，抑制细胞生长剂糖皮质激素如地塞米松(DEX；氟美松)和皮质甾类如强的松，核苷酶抑制剂如羟基脲，氨基酸去除酶如天冬酰胺酶和其他形形色色的抗肿瘤剂。
上述抗有丝分裂剂(细胞毒性剂)的合成和制备都是人们所熟知的，在各种原始资料中都有描述，所以这里就不再重复。合成和制备上述试剂的原始资料例子包括“内科医生桌面参考”(Physicians Desk Reference)，Barnhart，eds.，Medical Econom ics Company，Inc.，Oradell，N.J.，1992；和“Merck索引”(Merck Index)，第11版，Merck & Co.，1989。
在化疗方法中使用上述细胞毒素剂一般是癌症治疗领域的明显特征，在这里使用它们，还涉及监控耐受性和有效性以及控制给药途径和剂量。例如，该细胞毒素剂的实际剂量可以根据使用现有的组织培养方法所测定的所培养的患者的细胞反应来变化。一般该剂量比缺乏同步的细胞周期所使用的量要降低，这正如本发明说明书中所示。
有效细胞毒素剂的典型剂量能够在制造商所推荐的范围内，并且由体外反应或动物模型反应所表示的剂量可降低到至多大约一个量级的浓度或用量。所以，该实际的剂量将取决于医师的判断，患者的身体状况和治疗方法的有效性，这种有效性以最初培养的恶性细胞或组织培养的组织样品的体外应答性或在适当的动物模型中所观察到的反应为准。
IV.基因疗法在另一个方案中，根据本发明的蛋氨酸酶的接触法，本发明考虑到在组织或被治疗组织周围的淋巴细胞中使用rDNA来表达蛋氨酸酶。为得到这一结果，可以想到通过可控制的蛋氨酸酶表达基因的表达和由此，产生的蛋氨酸酶基因产物而用于接触步骤提供蛋氨酸酶。
如前面所描述的，目前已知有大量的适当表达载体可用来表达能够使用的蛋氨酸酶。在一个方案中，蛋氨酸酶基因的表达是可控制的。所以，一个表达载体具有能够可操作地连接到编码蛋氨酸酶的第一条序列的第二条核苷酸序列，这也定义了调节蛋氨酸酶基因表达的手段。这种调节手段的一个例子是可诱导的启动子，最优选的启动子是肿瘤特异性的。用一种肿瘤特异性的启动子控制蛋氨酸酶基因表达的表达模型，这些表达模型对本文所述的基因疗法是特别有用的。
一类可诱发的启动子对可加入培养基中的组分有反应，或很容易地渗透到含有基因的宿主细胞中来表达蛋氨酸酶基因。其它类的启动子是如上所述的肿瘤特异性启动子，例如癌胚抗原(CEA)启动子。
所以，本发明也考虑到一种把蛋氨酸酶与肿瘤细胞群接触的蛋氨酸的去除法，它包括下列步骤(i)在活体内或活体外，把一种表达载体导入肿瘤细胞或导入浸润肿瘤的淋巴细胞或其骨髓前体细胞来形成蛋氨酸酶基因转染的细胞，其中该表达载体具有编码蛋氨酸酶并能够调节蛋氨酸酶的表达的核苷酸序列，并且具有能够提供调节蛋氨酸酶表达的手段的核苷酸序列；(ii)把体内的肿瘤细胞与蛋氨酸酶基因转染的细胞接触；和(iii)在转染的细胞中表达编码蛋氨酸酶的核苷酸序列，由此在该转染的细胞中产生蛋氨酸酶并把所产生的蛋氨酸酶与肿瘤细胞接触。对本领域普通技术人员来说“导入”是指任何已知的以一种方式把表达载体插入靶细胞的方法，其中该靶细胞可以表达该表达载体中所携带的基因。这种插入能够在体内或活体外进行。通过例如转染、转化或病毒感染的方法可以完成这种“导入”。
使用各种已知的转染方法能够实现肿瘤细胞，无论是粘附细胞或是悬浮液内或体内的细胞的传染。此后，把转染的细胞(如果使用活体外的转染方法)再导入宿主并使该转染细胞定位在天然的、相关的、附近的要治疗的组织，由此把转染的细胞与要治疗的肿瘤细胞接触。使用各种手段能够实现把蛋氨酸酶导入转染的细胞，但是一般需要有选择性标记存在。
在一个方案中，调节基因表达的工具是对能够加入培养基中的试剂应答的可诱发的启动子。如金属硫蛋白的启动子。另一方面，可诱发的启动子可以是肿瘤特异性启动子。这种启动子对肿瘤细胞的靶蛋氨酸酶的表达起作用。
要转染的细胞能够是肿瘤细胞样品或正常免疫细胞如浸润肿瘤的细胞，如浸润肿瘤的淋巴细胞或骨髓的骨髓前体细胞如造血的干细胞或原始细胞。这些细胞能够在体内或体外。
实施例9描述了编码蛋氨酸酶的核苷酸分子的分离。该实施例还描述了用于分批酵解生产蛋氨酸酶的表达载体的产生。熟练的本领域技术人员能够很容易地使用克隆的蛋氨酸酶基因，如在pAC-1中所提供的，来制成适用于上述基因疗法的表达盒。
C.治疗组合物在另一个方案中，本发明考虑到治疗组合物，它含有治疗有效量的基本上分离出的、优选以重组体方法产生的蛋氨酸酶和药物可接受的载体。
L-蛋氨酸酶(L-蛋氨酸-α-脱氨基-γ-巯基甲烷-裂合酶或蛋氨酸酶)是通过脱氨基作用和脱硫代甲基作用来降解蛋氨酸的一种酶。蛋氨酸酶的活性至少能够通过测定在蛋氨酸裂解时所形成的α-丁酮酸盐的量来测得。一个单位(U)的蛋氨酸酶定义为在标准测定条件下从蛋氨酸中每分钟产生1毫摩尔α-丁酮酸盐的酶的量，如Ito等，“生化杂志”(J.Biochem.)，791263-1272，1976；和Soda，“生化分析”(Analyt.Biochem.)，25228-235，1968中所描述的。
蛋氨酸酶可以由许多来源制备，包括直接由细菌培养基分离，或者由编码蛋白酸酶蛋白的重组DNA分子表达，例如描述于例9和例12。
蛋氨酸酶的细菌源包括恶臭假单胞菌(Pseudomona Dutida)，卵状假单胞菌(Pseudomonas ovalis)和气单胞菌菌属(Aeromonas)和任何其他蛋氨酸酶的潜在来源。恶臭假单孢菌菌株可以商业途径从ATCC中得到，它的入藏号分别是ATCC 8209和ATCC 7955。其他细菌一般也能够从学术研究团体得到。现已描述了使用各种方法纯化蛋氨酸酶。例如，参见Kreis等，“癌症研究”(CancerRes.)，331862-1865，1973；Tanaka等，“欧洲生物化学学会联合会通讯”(FEBSLetters)，66307-311，1976；Ito等，“生化杂志”(J.Biochem.)，791263-1272，1976；Nakayama等，“农业生物化学”(Agric.Biol.Chem.)，482367-2369，1984和Soda，“生化分析”(Analyt.Biochem.)，25228-235，1968。但是，这些方法都没有得到高纯度的不含内毒素的蛋氨酸酶。本发明提供了已经用于纯化蛋氨酸酶的两种方法，这样该蛋氨酸酶几乎不含内毒素。
一种优选的蛋氨酸酶具有每毫克蛋白大约10到50个单位(U)的比活度。本文描述了纯化蛋氨酸酶的典型制剂，该制剂具有大约10到大约50U/mg的比活度，在实施例12中，使用表达载体pAC-1所制备的蛋氨酸酶具有大约20.1U/mg的比活度。
一种优选的蛋氨酸酶最好是大体上分离的。大体上分离是指该酶按重量计有至少50％的纯度，优选至少90％的纯度，更优选至少99％的纯度或基本上是均匀的。当在电泳介质如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中分析时，优选的蛋白基本是均匀的。在PAGE上的均匀是指只有单一的测定带。
由于当通过静脉注射或腹腔内给药而与哺乳动物生理接触时不希望有与内毒素有关的副作用，所以，优选的蛋氨酸酶是基本上不含内毒素如细菌性脂多糖。这里的基本上不含是指每毫克(mg)蛋氨酸酶蛋白至少于大约10ng内毒素，优选少于1ng内毒素/mg蛋氨酸酶，更优选的少于0.1ng内毒素/mg蛋氨酸酶。在治疗领域内内毒素的测定是熟知的，使用各种方法能够进行内毒素的测定。在实施例中描述了优选的方法。
优选的蛋氨酸酶是热稳定的，这样当在如动物体内升高温度的条件下使用时能够增加它的存储期和有效性。热稳定是指该酶能够在60℃下暴露10分钟并保持其比活度达80％优选保留90％的比活度，更优选保留95％的比活度。
优选的蛋氨酸酶具有至少5小时的血清半衰期，优选6小时，更优选至少7小时。
特别优选的蛋氨酸酶是从恶臭假单胞菌制备的或使用从恶臭假单胞菌中分离出来的含有编码蛋氨酸酶的DNA分子的表达载体制备的。恶臭假单胞菌蛋氨酸酶在变性条件下PAGE-SDS分析时具有大约43千道尔顿的表观分子量。在实施例中描述了纯化蛋氨酸酶的优选方法。
所以，治疗组合物含有一种生理上可耐受的载体和溶于或分散在其中的作为活性成分的大体上分离的蛋氨酸酶。在一个优选的方案中，当为治疗目的给病人服用时，该治疗组合物是非免疫原性的。
本发明的一个方案的特征是化学修饰的蛋氨酸酶，它包括结合到聚合物上的蛋氨酸酶。优选该蛋氨酸酶是大体上分离的并几乎不含内毒素。“化学修饰”是指被改变形成与从自然中纯化的蛋氨酸酶不同的任何形式的蛋氨酸酶。优选的是通过把该蛋氨酸酶连接到聚合物如聚乙二醇上的方法来化学修饰蛋氨酸酶的。
如本文中所使用的，用来指组分、载体、稀释剂和试剂的术语“药学可接受的”、“生理可耐受的”和它们在语法上的变化都可以交换使用，并且它们都表示能把该物质给药哺乳动物或人类服用或在给哺乳动物或人类服用时不会产生不希望的生理作用如恶心、眩晕和胃不适等。
在本领域中对包括溶于或分散在其中的活性成分的药物组合物的制备是非常清楚的。一般可以把这种组合物制成可注射的无菌的液体溶液如悬浮液、含水或不含水的溶液，或者在使用前也能够配成液体的适用于溶液和悬浮液的固体形式。该制剂也可以是乳剂形式的。如本文所述的特别优选的是磷脂和脂质体组合物。另外，在油膏或分散性盖片如绷带上也可以含有治疗量的蛋氨酸酶以提供该试剂的局部释放。
该活性成分能够与药物可接受的并与活性成分可配伍的赋形剂混合，其用量应适合于本文所述的治疗方法。适当的赋形剂例如有水、盐水、葡萄糖、甘油等及其组合物。另外，如果需要，该组合物可以含有微量的能够提高该活性成分的效果的辅助物质如湿润剂、乳化剂、pH缓冲剂等。
本发明的治疗组合物能够包括组分的药物可接受的盐。药物可接受的盐包括与如盐酸或磷酸的无机酸或者象乙酸、酒石酸、苯乙醇酸等有机酸形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基所形成的)。与游离羰基所形成的盐也能由无机碱例如钠、钾、氨、钙或铁的氢氧化物和有机碱如异丙胺、三甲氨、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生。
在本领域对生理可耐受的载体是熟知的。液体载体的例子有除活性成分和水外不含其他物质的无菌水溶液，或含有缓冲液如生理pH值的磷酸钠、生理盐水或二者如磷酸盐-缓冲的盐水。此外含水载体还包括一种以上的缓冲盐以及象钠和钾的氯化物、葡萄糖、丙二醇、聚乙二醇和其他溶质。
如本文所述液体组合物也能够包括与水相溶的液相和与水不溶的液相。这种附加的液相例子是甘油、植物油如棉籽油、有机酯如油酸乙酯和水包油的乳浊液，尤其是前面所述的脂质体组合物。
该治疗组合物含有有效量的蛋氨酸酶，一般有效量是每治疗组合物总重至少0.1重量百分比的活性蛋白，并优选至少大约25重量百分比。重量百分比是蛋氨酸酶与总组合物的重量比。所以，例如0.1重量百分比是每100克总组合物0.1克的蛋氨酸酶。
为了使蛋氨酸酶组合物能够通过血管在体内使用，我们考虑到配制一种控制释放蛋氨酸酶的治疗组合物的方案，并任选使蛋氨酸酶蛋白不受降解和会降低治疗给药的蛋氨酸酶的血清半衰期的其他现象的影响。
所以，在一个方案中，本发明考虑到包括运送载体的治疗组合物，该运送载体包括聚合物、聚合物载体、颗粒状物、乳状液、团聚体、离子交换树脂、脂质体、肠包衣、介质、生物胶粘剂、微胶囊、水凝胶等载体。包括脂质体的药物释放载体的例子至少由Tarcha在“控制药物释放的聚合物”(“Polymers For Controlled Drug Delivery”)，CRC出版社，Boca Raton，1990中描述过。
本发明还提供了纯化蛋氨酸酶的详细方法，把该方法与其他已知的方法相比较，它能够提供优越的产率和纯度。纯化重组蛋氨酸酶，特别纯化是使用含有编码蛋氨酸酶的高效表达模块的转化宿主产生的蛋氨酸酶的优选方法，包括下列步骤a)在缓冲水溶液中把含有蛋氨酸酶的转化细胞的提取物于约40-60℃下加热约1-10分钟，优选在50℃加热1分钟。
b)在一个GS-3转子(Sorvall，Du Pont)中以大约10k到20k rpm转速把加热后的提取物离心分离大约15分钟到1小时，优选在4℃大约13k rpm离心分离30分钟；c)使用10mM磷酸钾缓冲液(pH8.3)，使用大约50k到100k孔径的过滤器超滤上清液，优选为Millipore Pre/ScaleTFF PLHK 100K 2.5ft2的过滤器芯子；d)在低离子强度(大约10-50mM)KCl并在10-20mM磷酸钾缓冲液大约pH7.0-7.6的条件下进行DEAE离子交换柱层析，并收集用40-200mM的KCl梯度溶液洗脱的含有蛋氨酸酶的级分，优选使用DEAE-SepharoseFF柱；e)在中等离子强度(大约50-100mM)KCl并在10-20mM磷酸钾缓冲液大约pH8.0-8.6的条件下进行第二次DEAE离子交换色谱层析，并收集用100-200mM的KCl洗脱的和用磷酸盐缓冲液(pH8.3)洗脱的含有蛋氨酸酶的级分，优选使用DEAE-琼脂糖FF柱；和f)把在步骤(e)中收集的级分与能够吸附内毒素的柱层析介质接触，并收集洗脱液，由此从该洗脱液中除去内毒素形成不含内毒素的蛋氨酸酶，该蛋氨酸酶具有每毫克蛋白至少20个单位的蛋氨酸酶活性和每毫克蛋白1-199ng，优选1-100ng内毒素，优选使用ActicleanEtox柱。
该细胞提取物最好是从已被改变的能够表达高含量的重组蛋氨酸酶(大约5-75％总细胞蛋白)的宿主细胞制得的。另一方面，也能把天然表达蛋氨酸酶的有机物用作起始物。对细菌细胞提取物来说，制备提取物一般是首先收获并再洗涤细菌细胞培养物来形成细胞糊/丸，并取决于是否通过离心分离方法还是空心纤维管过滤方法收获，这些方法一般是大家所熟知的。
然后，使用常规工具把细胞碎裂。优选使用匀浆器如空化型匀浆器(例如Microfluidics Corp.Model#HC 8000碎裂细胞。
把所得到的悬浮液加热以沉淀选择的蛋白和其他不溶物。加热条件一般是大约45-60℃下1-10分钟。优选50℃1分钟的加热步骤。
把加热后的提取物离心分离除去碎片，并过滤上清液再用于上述两个步骤中的DEAE离子交换柱层析介质。在实施例中描述了优选的吸收和洗脱条件。在这些步骤中可以使用各种DEAE离子交换柱层析介质的任何一种，并对介质的选择不作限定。商业来源包括Pharmacia Fine Chemicals，BioRad和Sigma。
之后，除去内毒素生产具有如前面所述的可接受含量的内毒素的蛋白。以熟知的各种工具中的任何一种都能够进行内毒素的去除步骤，该去除步骤一般包括把溶液中的蛋白与能够吸附内毒素的一种柱层析介质接触，得到含有不含内毒素蛋白的柱层析介质洗脱物。用于除去内毒素的优选商业试剂是ActicleanEtox。
D.化学改良的蛋氨酸酶为了延长蛋氨酸酶的半衰期并降低它的免疫原性或抗原性，可以把蛋氨酸酶与一种聚合物结合。
在过分敏感的个体中存在变态反应的可能性。另一方面，抗蛋氨酸酶的抗体可以缩短蛋氨酸酶的半衰期。
现已尝试了各种途径来解决多肽和蛋白的抗原性问题。把聚合物如聚乙二醇偶联到蛋白上是降低蛋白抗原性的途径之一。本发明涉及使用一种新型有效的方法生产的蛋氨酸酶的化学修饰，它包括把在保持酶活性的条件下把纯化蛋氨酸酶与聚乙二醇(PEG)偶联。本发明的PEG-蛋氨酸酶具有延长的半衰期并没有表观免疫原性。
新的与聚乙二醇结合的蛋氨酸酶(“PEG-蛋氨酸酶”或“PEG化的蛋氨酸酶”)具有高的蛋氨酸去除活性、延长的半衰期和低免疫原性。因此PEG-蛋氨酸酶提供了一种保持稳定性，延长血清半衰期，降低免疫原性和降低毒性的抑制肿瘤生长的新工具。
本发明稳定的、蛋氨酸去除有效的、具有长半衰期且是非免疫原性的PEG-蛋氨酸酶可以用作安全有效的多剂量抗肿瘤剂。PEG-蛋氨酸酶可以在-70℃、4℃和室温下保存在10mM磷酸钠(pH 7.2)中的0.12M氯化钠的液体制剂中，而不丧失活性。
重要的是，本发明PEG-蛋氨酸酶是非免疫原性的，这使得它特别适于治疗对蛋氨酸酶敏感且需要重复给药的癌症患者。本领域普通熟练技术人员懂得，和用蛋氨酸酶一样，PEG-蛋氨酸酶可以以多种剂型提供。
纯化的没有内毒素的蛋氨酸酶的优选制剂是以在0.06M和0.2M之间的浓度溶于10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中的0.12M氯化钠溶液中。活性是大约10个单位/mg。
PEG化的蛋氨酸酶可以通过本领域普通熟练技术人员已知的方法测试。例如可以用体内试验来测定本发明方法制备的PEG-蛋氨酸酶的药理学、安全性和功能特征。
这些试验可以包括测定PEG-蛋氨酸酶的急性毒性、药物动力学、蛋氨酸在血清中的去除，以及评定PEG-蛋氨酸酶的免疫原性。
将纯化的无内毒素的PEG-蛋氨酸酶注射入鼠的尾静脉中，并每两小时采集血样。通过活性测定测量蛋氨酸酶的水平。蛋氨酸衍生作用后用HPLC测定蛋氨酸酶的水平。
可以在任何合适的实验动物体内进行急性毒性研究，如实施例5和15所说明的。在小鼠体内将10-100单位/1-10mg PEG-蛋氨酸酶注入其尾静脉。记录活体信号和目测观察。在注射前采集血样，并在注射后每两小时采集血样。测定蛋氨酸酶活性和蛋氨酸水平。也测定肾和肝功能两者的功能。用标准技术测定对组织如肺、肾、肝和脑有无毒性作用。也分析血样和骨髓。
在另一实施例中，蛋氨酸酶与一聚合物结合，产生了一种基本上无免疫原性的组合物，且也导致体内蛋氨酸酶活性半衰期的增加。
在一实例中，蛋氨酸酶通过与一聚合物结合而进行了化学修饰。
在另一实例中，蛋氨酸酶通过与聚环氧烷(polyalkylene oxide)的结合作用而被化学修饰，聚环氧烷的例子包括但不限于聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷共聚物和环氧丙烷共聚物。
在优选实例中，蛋氨酸酶通过与聚乙二醇结合而被化学修饰。
在另一优选实例中，结合聚乙二醇的蛋氨酸酶基本上不含内毒素。
本发明也提供了一种药物组合物，其含有治疗有效量的与聚合物结合的蛋氨酸酶。该聚合物可以是聚环氧烷，例如但不限于聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷共聚物和环氧丙烷的共聚物。
在一优选实例中提供了一种药物组合物，其含有治疗有效量的与聚乙二醇结合的蛋氨酸酶。在另一优选实例中，药物组合物含有治疗有效量的基本上不含内毒素的且与聚乙二醇结合的蛋氨酸酶。这种组合物可以从天然生产蛋氨酸酶的生物体中分离的物质中制备，或者优选从已被改变来表达蛋氨酸酶的宿主制备。
也提供了一种制备无内毒素蛋氨酸酶的方法，所述方法是通过无内毒素蛋氨酸酶与聚合物偶联，而生成基本上无免疫原性化学修饰的无内毒素的蛋氨酸酶。
在一优选实例中，该方法包括将蛋氨酸酶与聚乙二醇偶联。
在另一优选的实例中，通过无内毒素蛋氨酸酶与琥珀酰亚胺碳酸甲氧聚乙二醇酯反应而进行偶联。
也提供了一种治疗肿瘤患者的方法，包括施用治疗有效量的蛋氨酸酶。
在一优选实例中，蛋氨酸酶基本上无内毒素。
在另一优选实例中，蛋氨酸酶与聚合物结合。
在另一实验中，聚合物是一种聚环氧烷。
在另一优选实例中，蛋氨酸酶与聚乙二醇结合。
E.重组蛋氨酸酶制剂本发明进一步提供了冻干或结晶状的蛋氨酸酶。详细地说，已发现用本领域已知方法，蛋氨酸酶能容易地冻干或结晶。发现所得结晶或冻干形式的蛋氨酸酶制剂具有高的稳定性，易水合化，且再水化后保持高活性。
能用各种本领域公知方法来获得结晶或冻干形式的蛋氨酸酶。在实施例中使用Verdis，冻干装置24，在100毫巴，-80℃，72小时，进行蛋氨酸酶的冻干和结晶，本领域熟练技术人员能容易地采用其它本领域已知的方法用于制备冻干或结晶形式的蛋氨酸酶。
F.DNA片段和载体I.编码蛋氨酸酶的DNA分子已经发现当导入合适的宿主细胞中时通过可操作地连接编码蛋氨酸酶的分离DNA分子与启动子，特别是RNA聚合酶启动子如T7 RNA聚合启动子的操作连接，重组蛋氨酸酶可以以大约总细胞蛋白质的5～75％的水平被表达。因此本发明提供了当导入合适条件下的宿主中时表达高水平重组蛋氨酸酶的高水平表达模型。
这里所使用的高水平表达模型，或本发明的表达模型是指包含一个或多个指导编码蛋氨酸酶的可操作地连接的核苷酸序列的转录和翻译的表达调控元件的核酸分子。表达模型可以是分离的核酸分子或者可以存在于载体中(下文说明)。
本发明表达模型包含指导重组蛋氨酸酶生产的调控元件，使得生产的重组蛋氨酸酶相当于大约总细胞蛋白质的5-75％，优选多于总细胞蛋白质的10％。优选的表达控制元件RNA聚合酶启动子，更优选T7 RNA聚合酶启动子。RNA聚合酶启动子的另外的实施例包括但不限于Tac和Trc启动子。
启动子是由允许RNA聚合酶结合以及发生转录的DNA序列构成的表达调控元件。与特定宿主系统相容的启动子序列是本领域公知的，并且一般以在包含一个或几个合适的限制酶切位点的质粒载体中提供。有代表性的这样的质粒载体是包含T7 RNA聚合酶启动子，PT7和PET的质粒载体，其可以从多种渠道获得，如由商家和the American Type Culture Collection获得。
本发明表达模型进一步包括编码蛋氨酸酶的核酸序列。正如这里所使用的，当含有该序列的核酸分子的转录和翻译导致具有蛋氨酸酶活性的蛋白质的产生时，就认为该核酸序列编码蛋氨酸酶。
L-蛋氨酸酶(L-蛋氨酸-α-去氨基-γ巯基甲烷-裂合酶或蛋氨酸酶)是一种通过去氨基和去硫甲基作用而降解蛋氨酸的酶。蛋氨酸酶活性至少可以通过测定蛋氨酸裂解生成的α-丁酮酸的量而测得。一个单位(U)蛋氨酸酶被定义为在标准测定条件下每分钟从蛋氨酸产生1微摩尔α-酮基丁酸根的酶的量，该标准条件描述于Ito等，J.Bio chem.，791263-1272，1976；和Soda，“生化分析”(Anayt.Bio chem)。25228-235，1968。
编码蛋氨酸酶核酸序列可以包括由天然生产重组蛋氨酸酶的生物体获得的未改变的序列，也可以包括由天然生产蛋氨酸酶的生物体获得的已被改变包括一个或多个核酸或氨基酸取代基，缺失或增加的序列。
编码蛋氨酸酶的核酸分子，不管其改变或未改变都能由天然产生蛋白酸酶的任何有机体中制得，优选编码蛋氨酸酶核酸分子的来源是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。实施例9公开了来自恶臭假单胞菌的，编码蛋氨酸酶核酸分子的分离与序列测定。另外优选的编码蛋氨酸酶核酸分子的来源包括但不限于阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)，巴西日本圆线虫Nippostrongylus brasiliensis，和梭杆菌属(Fusobacterium SP.)。
蛋氨酸酶完整编码序列可以使用各种方法由各种来源获得，特别是上文引述的那些来源。图8提供的蛋氨酸酶和核酸序列大大方便于从不是恶臭假单胞菌的生物体内分离编码蛋氨酸酶核酸分子。
具体地，本领域熟练技术人员能容易地使用图8提供的核酸序列制备寡核苷酸引物以用于从蛋氨酸表达生物中选择性扩增编码蛋氨酸酶的核酸分子的聚合酶链反应(PCR)中。优选的以图8提供的序列为基础的PCR引物对是5′-GCCGGTCTGTGGAATAAGCT-3′(有义)5′-CCAGGGTCGACTCCAGCGCC-3′(反义)应用上述PCR引物的优选PCR变性/复性/延伸反应周期如下在95℃第一次在95℃变性10分钟，然后在94℃30秒变性，在60℃退火30秒，在72℃延伸反应2小时进行5个循环，在94℃30秒，60℃30秒变性25个周期，然后在72℃延伸1.5分钟；然后在72℃延伸反应10分钟，进行25个循环。PCR扩增产物是两个区带，收集其中的1365bp区带，纯化成插入的ONCase-1DNA。
或者，图8核苷酸序列片段能用作探针使用现有技术由除由恶臭假单孢菌以外的有机体分离编码蛋氨酸酶的DNA。用本领域公知方法制备和使用含大约18-20个核苷酸(编码大约6-7个氨基酸的一段序列)寡聚体，并用于探查在足够严格以减少假阳性条件下获得杂交的基因组DNA库。(参见Sambrook等，“分子克隆”(Molecular Cloing)，Cold Spring Harbor Press1989)。
用作探针或聚合物酶链反应(PCR)的特异性引物的DNA片段(即合成的寡核苷酸)以及编码蛋氨酸酶的基因序列可容易地通过化学技术而合成，例如，Matteucci等(“美国化学学会杂志”J.Am.Chem.Soc.1033185-3191，1981)的磷酸三酯的方法或使用自动合成方法。另外，较大DNA片段可容易地通过公知方法制备，例如合成限定DNA片段的一组寡核苷酸，然后进行杂交作用并连接寡核苷酸构成完整的片段。
除了以PCR和DNA探针为基础的方法外，用预计为免疫原的图8的肽片段激发的多克隆抗血清或单克隆抗体能分离编码蛋氨酸酶的DNA分子。这样的抗体可以用来探测由特定生物产生的表达文库，如λgtll库，以从除非恶臭假单胞菌以外的生物体获得编码蛋氨酸酶的DNA分子。
一旦获得自然发生的编码蛋氨酸酶的核酸分子，本领域熟练技术人员能容易地使用随机或位点特异性诱变方法来改变蛋氨酸酶编码序列，以来提高表达水平，或者从已编码的蛋氨酸酶取代，增加或缺失一个或多个氨基酸。
在一个实例中，在给定宿主细胞中改变了蛋氨酸酶编码序列以提高重组蛋氨酸酶的表达水平，而不改变被编码的蛋氨酸酶的氨基酸顺序。特定宿主中重组蛋氨酸酶提高的表达可以通过改变存在于核酸分子中的一个或几个密码子而获得，结果是得到的密码子是经常被宿主生物用来编码特定蛋氨酸的密码子。改变核苷酸序列使其包含优选密码子可以用本领域公知方法来实现，如定点诱变或者合成包含优选密码子的核酸分子。
除影响表达的改变外，也能改变编码蛋氨酸酶的核酸分子以便于所得蛋白质的纯化。例如，如实施例中所公开的，通过改变重组蛋氨酸酶的氨基或羧基末端，以增加一段聚组氨酸序列，可以用Ni++琼脂糖凝胶纯化所得的融合蛋白质。
也可以改变蛋氨酸酶编码序列使在被编码蛋氨酸酶的氨基酸顺序中引起变化，如增加，取代，或缺失一个或几个氨基酸残基。所得重组蛋氨酸酶优选具有导致重组蛋氨酸酶具有更好生物或生理特性的变化，如提高的活性，降低的Km，降低的免疫原性，或延长的血清半衰期。这样被改变的类型可以合理设计或随机发生。
当变化是以起始和产物蛋白质的氨基酸顺序以及期望的生理特性为基础的特定选择时，所说的改变是合理设计。例如一种类型的合理设计改变是用较小疏水性残基取代疏水性氨基酸以提高溶解性。产生合理设计改变的优选方法是应用错配序列PCR引物延伸方法的定点诱变。
当改变不是合理选择的时候，改变就是随机发生的。随机诱变技术，如化学诱变，PCR改组和接头分区诱变，在给定蛋白质编码序列中产生大量各种随机的和非特定的变化。这样的方法可以用来从根本上改变编码蛋氨酸酶的核酸分子。
然后按这种方式产生的重组蛋氨酸酶改变的形式用于根据本领域已知各种方法筛选期望性质。选择使用的挑选方法取决于宿主、载体和使用的诱变方法以及待选择的性质。
本发明进一步提供了包含一个或几个本发明表达模型的载体。载体是能在宿主中自主复制的DNA分子。载体可以包含由自然存在质粒衍生的附加型复制起点，基因组复制起点，或者能从病毒基因组衍生。本发明表达模型插入的载体的选择如本领域公知的，直接取决于期望的功能特性，例如蛋白质表达，和要转化的宿主细胞。
在一实施方案中，载体包括一原核复制子。原核复制子如ColE1复制子是本领域公知的且容易地用在与本发明表达组件的结合中。另外，载体可以包括编码可选择标记如抗药性的基因。
真核表达载体也可以用在与本发明表达组件的结合中。真核细胞表达载体是本领域公知的并可从一些商业机构获得。有代表性的这样的载体是PSVL和pKSV-10(Pharmacia)，pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies，Inc.)，pTDT1(ATCC，#31255)，本文说明的载体pCDM8，和类似的真核表达载体。高水平表达载体能进一步用昆虫细胞表达体系产生，如以杆状病毒为基础的表达体系。
一般情况下，编码蛋氨酸酶高表达组件的产生典型地包括以下内容首先获得编码蛋氨酸酶的DNA。如果期望的来自细菌源的序列没有被内含子间断，则其适合于在任何宿主中表达。该序列可以通过在蛋氨酸酶编码序列旁侧区插入包含一个或几个限制性内切酶位点的序列而改变成易于切割和回收的形式。
然后，被切割或回收编码序列与具有高表达控制元件的可操作连接，优选置于可复制表达载体中。然后用表达组件或载体转化合适的宿主，并且被转化宿主在实现重组蛋氨酸酶生产的条件下培养。任意地将重组蛋氨酸酶从培养基中或从细胞中分离出来。在一些例子中蛋白质的回收和纯化不一定是必须的，其中可以允许一些杂质存在。
上面步骤中的每一步可以以各种方式进行。例如可以从基因组片段获得所期望的编码序列并直接用于合适的宿主。各种宿主中可操作的表达载体的构建是使用两个或多个合适的复制子和控制元件进行的。如果通常可得的，合适的限制酶切位点可以被加到编码序列的终端，这样提供一个插入到这些载体中的可切割基因。
II.转化宿主细胞表达高水平重组蛋氨酸酶本发明进一步提供用本发明表达组件或载体转化的宿主细胞，从而生产大约总细胞蛋白质的5-75％重组蛋氨酸酶，优选占总细胞蛋白质量的大约10％以上。宿主细胞可以是原核或真核宿主。
任何原核宿主可以用来表达本发明高水平蛋氨酸酶编码组件。优选的原核宿主是大肠杆菌(E.coli)。在下面的实施例中，使用了大肠杆菌的DH5α和BL21(DE3)菌株。
优选真核宿主细胞包括昆虫细胞，酵母细胞和哺乳动物细胞，优选昆虫细胞如SP6和脊椎动物细胞，如那些来自小鼠、大鼠、猴、或人成纤维细胞系的细胞。其它优选真核宿主细胞包括从ATCC获得的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞CCL61，从ATCC获得的NIH瑞士鼠胚胎细胞NIH/3T3(CRL1658)，幼仓鼠肾细胞(BHK)及类似的真核组织培养细胞系。
通过通常有赖于所使用宿主和载体类型的已知方法实现用本发明高水平表达重组组件对合适宿主的转化。对于原核宿主细胞的转化，优选对宿主细胞进行电穿孔或盐处理方法，例如参见Cohen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692110，1972；和Maniatis等，“分子克隆，实验指南”(MolecularCloning，Alaboratory Mammal)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1982)。
关于真核细胞的转化，优选电穿孔或使用阳离子脂质，例如参见Graham等，Virol.52456，1973；和Wigler等，“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)761373-76，1979。
成功转化的细胞，即包含本发明表达组件的细胞可以用已知技术鉴别。例如由本发明表达组件的导入而产生的细胞可以被克隆制备单菌落。可以收获、溶解来自这些菌落的细胞并用已知方法检查它们DNA中rDNA的存在，所述方法由Southern，“分子生物杂志”(J.Mol.Biol)，98503，1975，或Berent等，“生物技术”(Biotech.)3208，1985描述。然而正如下文所说明的，本发明进一步提供了鉴别表达高水平重组蛋氨酸酶的转化子的快速筛选方法。
III.鉴定表达高水平重组蛋氨酸酶的宿主本发明进一步提供鉴定能以5-75％总细胞蛋白质的水平生产重组蛋氨酸酶的转化宿主细胞。具体地，发现将大约5-75％的总细胞蛋白质表达成重组蛋氨酸酶的转化宿主细胞具有明显的可观察到的粉红色。当用大肠杆菌作为宿主时特别明显。
为鉴定表达高水平重组蛋氨酸酶的转化宿主细胞，让转化细胞在培养基上或培养基中在重组蛋白质被表达的条件下生长，并目测检查生长的细胞。基于粉红色的显示来检测和选择和生长细胞或菌落。
为使用本发明方法选择，使生长转化宿主细胞生长，可使用许多培养/生长条件。生长培养基的成分决定于所用的宿主/载体的营养需要以及用于鉴定与重组蛋氨酸酶高水平表达有关的粉红色的检测系统并从而可以分离高水平表达克隆。优选的培养基是转化宿主细胞在其上可以平铺，以单独的菌落生长的固体培养基，每一个单菌落都来自单个宿主中。检定高水平表达克隆的优选方法是目测生长菌落。
IV.用高水平表达组件生产量组蛋氨酸酶本发明进一步提供生产重组蛋氨酸酶的方法。具体地，应用用一个或几个本发明高水平表达组件转化的宿主能以工业化大量生产重组蛋氨酸酶。这种被转化宿主以大约5-75％总细胞蛋白质的水平表达重组蛋氨酸酶。使用本发明宿主，本领域熟练技术人员能容易地用本领域已知方法生产用于各种诊断和治疗方法中的重组蛋氨酸酶。
纯化用包含编码蛋氨酸酶的高水平表达模型的转化宿主生产的重组蛋氨酸酶，或纯化自然生产蛋氨酸酶的宿主生产的重组蛋氨酸酶的优选方法包括下面步骤a)将含有蛋氨酸酶的转化细胞提取物的含水缓冲液，在大约40-60℃加热大约1-10分钟，优选50℃加热1分钟；b)在GS-3离心机转子(Sorvall，Dvpont)上以大约10k至20k rpm将加热的提取物离心大约15分钟至1小时，优选在4℃以大约13k rpm离心大约30分钟；
c)使用大约50k至100k孔径的过滤器将上清液超滤，优选用10mM磷酸钾缓冲液(pH8.3)的Millipore Pre/ScaleTFF PLHK 100K 2.5ft2柱体；d)进行DEAE离子交换柱层析，用大约pH7.0-7.6 1-20mM磷酸钾缓冲液中的低离子强度(大约10-50mM)KCl，收集含有40-200mM KCl梯度洗脱的蛋氨酸酶的级分，优选使用DEAE-琼脂糖FF柱；e)在大约pH8.0-8.6 10-20mM磷酸钾缓冲液中的中等离子强度(50-100mM)KCl中进行第二次DEAE离子交换柱层析，并收集含有用磷酸盐缓冲液(pH 8.3)、100-200mM KCl洗脱的蛋氨酸酶的级分。优选使用DEAE-琼脂糖FF柱；f)将步骤(e)中收集的所述级分与能吸附内毒素的柱层析基质接触，并收集洗脱液，从而从e)步骤所述洗出液中除去了内毒素，生成了每毫克蛋白质具有至少20单位蛋氨酸酶活性和每mg蛋白质只含1-100ng内毒素的无内毒素蛋氨酸酶，优选使用ActicleanEtox柱。
细胞提取物优选从已被改变来表达高水平重组蛋氨酸酶(大约5-75％总细胞蛋白质)的宿主细胞制备。对于细菌性细胞提取物，提取物一般通过首先收获并冲洗细菌细胞培养物生成细胞团/丸粒(取决于收获是用离心作用或者是用中空纤维过滤，两种方法一般是已知的)来制备。
然后用常规方法破碎细胞，优选使用匀浆器破碎细胞，如空腔型匀浆器，例如Microfluidics Corp.Model#HC 8000。
加热所得悬浮液，以沉淀选择的蛋白质和其它不溶性物质。典型的加热条件是在大约45-60℃加热1-10分钟，优选步骤是在50℃加热1分钟。
离心加热的提取物，去除碎屑，滤出上清液，并如上文所述以两步骤加样到DEAE离子交换层析基质上。优选的吸附和洗脱条件见实施例。在这些步骤中可以使用各种DEAE离子交换柱层析基质，基质的选择不认为是限定条件。商业上的来源包括Pharmacia Fine Chemicals，BioRad，和Sigma。
此后，去除内毒素，生产上文提出的具有可接受水平内毒素的蛋白质。内毒素去除步骤可以用各种已知方法进行，一般包括使溶液中的蛋白质与能吸附内毒素的柱层析基质接触，得到含有无内毒素蛋白质的柱层析基质洗脱液。用于除去内毒素的优选商售试剂是ActicleanEtox。
G.应用蛋氨酸酶预防与高半胱氨酸过高相关的心血管疾病。
本发明的另一方面是蛋氨酸酶用于除去高半胱氨酸治疗。
高半胱氨酸过高与各种类型心血管病相关。这些疾病与高半胱氨酸的关系是McCully在1969年首次发现的(McCully，KS，“美国病理学杂志”(Am.J.Pathol.)56111-28，1969)。McCully发现了升高的血浆高半胱氨酸浓度和动脉硬化疾病之间的关系。最近由Framingham Heart Study对1041人进行的研究发现升高的高半胱氨酸血浆水平引起动脉硬化增加的危险(Selbub，J.等，“英国药学杂志”(N.Engl.J.)Med.32286-91，1995)。其它研究甚至将中等的高半胱氨酸血过高与外周血管，脑血管和冠状心脏病疾病联系起来(Kang，S.等，“营养学进展年刊”(Annu.Rev.Nutr.)12279-98，1992)。例如血管疾病患者空腹高半胱氨酸浓度比正常人高31％。血浆高半胱氨酸浓度超过正常值上限12％既与患心肌梗塞形成危险增加3.4倍相关(Stampfer，M.等，“美国医学协会会刊”(JAMA)268877-81，1992)。高半胱氨酸代谢作用机理的研究发现，对2000多名受试者中，20例对照和跨地域研究表明，患中风或其它心血管血液病的患者具有比没有心血管疾病受试验者更高的高光胱氨酸的血液水平。这与大多数心肌梗塞患者具有正常胆固醇水平的事实相反。在“内科健康研究”(Physicians Health Study)发现了令人瞩目的结果，预期表明，自后来被诊断患心肌梗塞的271名男性身上在患心肌梗塞之前取出的血样中具有明显高于未患心肌梗塞相当的对照组中的高半胱氨酸平均基础线水平。(Ueland，P.等，“心血管疾病止血和内皮功能”Cardiovascular Disease Hemostasis and Endothelial Function，New YorkMarcel Dekler；183-236，1992)。尽管有多种条件能引起高半胱氨酸水平的升高，但不管代谢原因是什么，存在高水平高半胱氨酸与血管疾病之间的关系。在一定向研究中，在狒狒体内诱发血管损伤，并用高半胱氨酸对狒狒输注三个月(Ueland，P.等，上文)。通过口服蛋氨酸后测定患者体内高半胱氨酸水平来诊断高半胱氨酸过高。口服蛋氨酸激发后在动脉硬化患者体内不正常的高半胱氨酸血浆浓度是正常者的12倍(Ueland，等，上文)。用HPLC测定能方便快捷地测定血浆高半胱氨酸水平。研究表明40％的人口可能有升高的高半胱氨酸水平，有患心血管病的危险(Stampfer，M.和Malinow，M.，“新英格兰医学杂志”(New Engl.J.Med.)332326-329 1995)。高半胱氨酸血过高在诱发动脉硬化疾病方面具有急性作用，使个体有患心肌梗塞和脑血管病的危险。急救医疗介入表明上述个体的大部分有患心血管疾病的危险。本发明蛋氨酸酶可以作为急救医疗中一个可选择的治疗方法，可马上降低有患病危险的人的高半胱氨酸水平。蛋氨酸酶催化两种反应，不只在蛋氨酸中而且也在高半胱氨酸中酶解N-C键和γC-S键(Hoffman，“生物技术和生物物理学”(Bioch.et Biophys.)Acta，“癌症研究回顾”(Reviews on Cancer)，73849-87，1984)。图7说明高半胱氨酸和蛋氨酸代谢的代谢循环。维生素B-12，B-6，和叶酸盐影响图中说明的循环的左侧，对用蛋氨酸酶治疗后保持一些人的正常高半胱氨酸水平是有帮助的。而循环的右侧不取决于这些维生素的水平。在循环的右侧，蛋氨酸的存在通过升高的甲基转移反应导致过量高半胱氨酸水平，其可以导致癌症以及动脉硬化疾病。对于循环右侧不正常的患者，保持和短期使用蛋氨酸酶是必要的，可保持高半胱氨酸的正常水平。对于心血管疾病，蛋氨酸酶对蛋氨酸和高半胱氨酸两者的底物特异性是重要的。蛋氨酸酶可降低高半胱氨酸前体蛋氨酸的水平，也可以直接降低高半胱氨酸水平。本领域现有研究只建议使用维生素B-12，B-6和叶酸盐作为治疗剂来降低过高的高半胱氨酸血。如图7所示，只表明这些维生素没有矫正任何该循环右侧中的不正常症状，也没有降低该循环右侧不正常的患者体内的高半胱氨酸水平。本发明包括用蛋氨酸酶治疗患心血管疾病患者的方法。
一方面，提供了治疗患心血管疾病患者的方法，包括给患者施用治疗有效量的蛋氨酸酶。
用于高半胱氨酸去除的蛋氨酸酶的治疗有效量是预测量，计算达到所期高半胱氨酸去除的水平，从而，例如，降低患动脉硬化的危险性。
因此，本发明蛋氨酸酶给药的剂量范围是足以产生所期效果的量，所期效果例如是降低患动脉硬化的危险或水平。剂量不应大至引起副作用，如粘滞性过高，综合症，肺水肿，充血性心力衰竭等等。一般情况下剂量根据患者的年龄，症状，性别和疾病发展程度而不同，这是本领域熟练技术人员能够决定的。
剂量可以在任何复杂的情况下由医生确定。
本发明蛋氨酸酶的治疗有效量一般是当以生理相容组合物给药时足以使血管内(血浆)或局部蛋氨酸酶的浓度是大约0.001至大约100U/ml，优选高于大约0.1U/ml，更优选高于1U/ml的量。给药的一般剂量决定于体重，并且是在大约5-1000U/kg/天，优选大约10-50U/kg/天，更优选大约20-40Ukg/天的范围内。
在优选方法中，所用蛋氨酸酶基本上无内毒素，如上文详细讨论的。特别优选的是使用本发明生产的蛋氨酸酶，其来自重组源且基本上不含内毒素。
可以使用本领域普通熟练技术人员已知的方法给药，且在本说明书中进行了说明。
本发明的另一方面是通过施用治疗有效量的基本上不含内毒素且与聚合物结合的蛋氨酸酶来治疗患心血管疾病的患者。在一优选方面，该聚合物是聚乙二醇。本发明另一优选方面是所述心血管疾病是动脉硬化。本发明的另一方面是给颅外颈动脉狭窄，外周血管，脑血管，冠状心脏病和闭塞性血管疾病患者给药蛋氨酸酶。
本发明的另一方面是提供了一种通过对患者给药治疗有效量的蛋氨酸酶来治疗高半胱氨酸血过高患者的方法。所述蛋氨酸酶基本上不含内毒素且与聚合物如聚乙二醇结合。
本发明也提供了降低患者体内高半胱氨酸水平的方法，包括对患者给药治疗有效量的蛋氨酸酶的步骤，其中所述蛋氨酸酶基本上不含内毒素。本发明另一方面是提供了一种预防患者发生心血管疾病的方法，包括对患者给药治疗有效量的蛋氨酸酶的步骤。在一优选方面，给与患者的蛋氨酸酶基本上无内毒素。另一优选方面，所述蛋氨酸酶与一聚合物结合。再一方面提供预防患者发生心血管疾病的方法，包括对患者给药治疗有效量的蛋氨酸酶的步骤，所述蛋氨酸酶基本上无内毒素，并且还和聚乙二醇结合。实施例7提供了体内高半胱氨酸去除的例子。
H.蛋氨酸酶应用于肿瘤显像本发明另一方面提供了诊断患者体内肿瘤的方法，包括通过对患者给药蛋氨酸酶，去除患者体内12C蛋氨酸，然后通过给与患者11C蛋氨酸来充实患者体内的蛋氨酸，最后测定患者肿瘤细胞中存在的11C蛋氨酸，11C甲基化作用可以通过例如但不限于正电子发射断层显象(PET)扫描的方法来检测。本领域普通熟练技术人员熟悉其它检测癌细胞摄入的11C的方法。这些方法描述在，例如，Lapela等，“核医学杂志”(J.Nucl.Med.)351618-23，1994；Miyazawa等，“核医学杂志”(J.Nucl.Med.)341886-91，1993；Leskinen-Kallio等，“核医学杂志”(J.Nucl.Med.)33691-95，1992；Shields等，“核医学杂志”(J.Nucl.Med.)33581-84，1992；Huovinen等；“英国癌症杂志”(Brit J.Cancer)67787-91，1993；Dethy等，“核医学杂志”(J.Nucl.Med.)351162-66，1994；Lindholm等，“核医学杂志”(J.Nucl.Med.)341711-16，1993；Leskinen-Kallio等，“核医学杂志”(J.Nucl.Med.)321211-18，1991；和Mineura等，“核医学杂志”(J.Nucl.Med.)32726-28，1991，这里一起引作参考。
本发明优选方面，所提供的蛋氨酸酶基本上无内毒素。
本发明另一优选方面是，所述蛋氨酸酶是与聚合物，如聚乙二醇结合的。
实施例下面涉及本发明的实施例是详细说明而不作为对本发明的特别限制。而且，在本领域熟练技术人员可预见范围内的现在已知的或者以后可发展的本发明的这些变化被认为在下文所要求的本发明的范围内。
实施例1扩大生产蛋氨酸酶恶臭假单孢菌株，被改良并如下挑选卡那霉素抗性，和高水平表达蛋氨酸酶的菌株于1993年10月从ATCC购得ATCC 8209恶臭假单孢菌(Pseudomonasputida)和ATCC 77100大肠杆菌。ATCC 77100在含有50μg/ml卡那霉素的LB(Sambrook等，“分子克隆，实验指南”(Molecular CloningALaboratorymanual)A.1，1989)中生长。从ATCC 77100中分离质粒pCN 51，一种包含能在恶臭假单孢菌(P.putida)和大肠杆菌(E.coli)两者中复制的卡那霉素抗性基因的穿梭质粒(Nieco等，Gene 87145-149，1990，这里引作参考)，并用Triton-溶菌酶方法(Sambrook等，“分子克隆，实验指南”(Molecular CloningAlaboratory manual)1.29-1.30，1989)纯化。ATCC 8209在LB培养基中生长，并用标准转化方法用pCN 51转化，所述标准转化方法如描述在例如Sambrook等，“分子克隆，实验指南”(Molecular Cloninga laboratorymanual.)1.74-1.84，1989中的那些方法。卡那霉素抗性菌株在LB培养基中用卡那霉素(100μg/ml)挑选，并进一步在LB板(Sambrook等，“分子克隆，实验指南”(Molecular CloningAlaboratory manual)A.1-A.4，1989)上在100μg/ml卡那霉素中生长。单一菌落在含有100μg/ml卡那霉素的LB中生长过夜，然后置于高蛋氨酸酶表达条件下10％LB，0.1％磷酸钾缓冲液(pH7.2)，0.1％尿素，0.025％酵母提取物，0.01％硫酸镁和有50μg/ml卡那霉素的0.25％蛋氨酸，培养24小时。用本说明书说明的标准蛋氨酸酶测定方法测定蛋氨酸酶的表达。挑选过量生产蛋氨酸酶的恶臭假单孢菌菌株(Pseudomanas putida)并命名为AC-1。
然后应用AC-1恶臭假单孢菌菌株(Pseudomonas putida)进行扩大生产的发酵过程。AC-1单一菌落在含有50μg/ml卡那霉素的LB板上生长。以250rpm/min振摇速度在26℃将挑选的菌落在5ml含50μg/ml卡那霉素的LB中温育18小时。以200rpm/min震摇速度在26℃将2ml细菌在600ml含50μg/ml卡那霉素的LB中扩增6小时。然后以100rpm/min摇荡在26℃将50ml细菌在2升含50μg/ml卡那霉素的LB中温育过夜(18小时)。然后让2升细菌(OD6001.2-1.6)在40升罐中在含有10％LB，0.1％磷酸钾缓冲液(pH7.2)，0.1％甘油，0.1％尿素，0.025％酵母提取物，0.0l％硫酸镁和0.25％蛋氨酸的特定培养基中，在高通气条件下，在26℃生长24小时。OD600达到1.2-1.8且活性达到20-30单位/升。收获的细胞最佳密度是1.5-1.80D600，具有2-3mg/l蛋氨酸酶，这相当于1kg湿细胞/400升。优选地，使用大约产率1kg湿细胞/10-20升的装备完善的发酵罐。保持温度4℃，用AGT柱(UFP-500-E-55型柱体，A/G Technology Corporation)收集细胞，然后在4℃，以9krpm，用自动冷冻离心机(Sorvall Superspeed RC2-B)离心10分钟。然后收集细胞片状沉淀物。
然后将细胞悬浮于提取溶液(20mM磷酸钾，pH 9.0)中，密度为500克湿细胞/升，三次用空腔匀浆器(Microfluidics Corp.Model#HC 8000)破碎细胞。细胞破碎后立即将匀浆物在-800℃下保存。匀浆物中蛋氨酸酶的比活度是0.08～0.1单位/mg蛋白。
将AC-1匀浆物悬浮于提取缓冲液(10mM磷酸钾，pH 7.2，10μM磷酸吡哆醛，0.01％β-巯基乙醇，1mM EDTA和20％乙醇)，并在50℃加热2分钟。加热步骤可以进行任何长的时间，足以沉淀热敏感杂质蛋白而保持蛋氨酸酶活性。悬浮液在4℃以12krpm离心30分钟。收集上清液并用Millipore Prep/Scale-TFF PLHK 100k 2.5ft2柱体超滤。然后将pH调至7.2。
大约25-35g总蛋白质的10L提取缓冲液(10mM磷酸钾缓冲液pH 7.2，10μm磷酸吡哆醛和0.01％J-巯基乙醇)样品施加到10cm×50cmToyopear(DEAE-650M柱(Toso Haas Japan)上，该柱用10mM磷酸钾缓冲液(pH7.2)预平衡。该柱先用含有10μm磷酸吡哆醛和0.01％β-巯基乙醇的40mM氯化钾的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.2)20-30L预冲洗，直至OD280降低至0.1以下。然后将氯化钾在提取缓冲液自初始浓度40mM提高至300mM，对柱子进行线性梯度洗脱。收集了400ml洗出级分。用本说明书说明的蛋氨酸酶活性测定来测定含蛋氨酸酶的级分并集中。用含有相同浓度磷酸吡哆醛和β-巯基乙醇的10mM磷酸钾缓冲液，pH8.3，和150mM氯化钾将集中的级分预平衡比。
将从DEAE-650M(5cm×20cm)柱的蛋氨酸酶峰得到的大约1-2g总蛋白质的缓冲液样品施加到DEAE-Sephadex A 50柱上，所述缓冲液含有10mM磷酸钾pH8.3，150mM氯化钾，10μM磷酸吡哆醛和0.01％J-巯基乙醇。用含10μM磷酸吡哆醛和0.01％β-巯基乙醇的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.3)中的150-500mM KCl线性梯度洗脱该柱，收集150ml洗出级分。集中用本文说明的活性测试测定的含蛋氨酸酶的级分。然后进一步纯化集中的蛋氨酸酶以去除内毒素。通过在0.12M氯化钠和pH7.1的10mM磷酸钠缓冲液中透析将样品预平衡。将样品加到5cm×15cm Acticlean Etox树脂柱(SterogenBioseparations，Arcadia，CA)上。然后用相同缓冲液从柱上洗脱酶，收集具有蛋氨酸酶活性的洗出级分，然后测定洗出级分中内毒素含量。表1给出该纯化方法的结果。

纯化的蛋氨酸酶在7.5％SDS-PAGE凝胶上的分析显示一条43kd蛋白质带，代表当用SDS-PAGE分析从第二个柱中得到的活性级分时发现的172kd蛋白质的一个亚单位。HPLC分析表明用该方法分离的蛋氨酸酶的纯度是98.7％，通过只有一个蛋白质峰可证明。
本文说明的提取方法产生了基本上无内毒素的基本上提纯的蛋氨酸酶制剂。本领域普通熟练技术人员明白可以对说明的提取方法进行修饰，这些改变包括在本发明范围内。
实施例2人肿瘤对升高的蛋氨酸水平的依赖性蛋氨酸依赖性经常发生在人癌症情况下，来自所有主要器官系统的20种NCI人肿瘤细胞系用于试验蛋氨酸依赖性。所有20个细胞系都发现是蛋氨酸依赖性的。另外测试了新鲜的人肿瘤样品，也发现是蛋氨酸依赖性的。正常人细胞系不是蛋氨酸依赖性的。
图1给出了一个这种试验的结果。在图1中，正常细胞株和肿瘤细胞系与10％透析的血清一起在Eagle′s MEM中生长，所述透析的血清是下列样品之一不含高半胱氨酸含蛋氨酸(MET+HCY-)的样品；不含蛋氨酸含高半胱氨酸(MET-HCY-)的样品或不含蛋氨酸不含高半胱氨酸(MET-HCY-)的样品。在含蛋氨酸(MET)培养基，无MET培养基，含高半胱氨酸(HCY)培养基中和在无MET培养基，含高半胱氨酸(HCY)培养基中和在无MET，无HCY培养基中筛选肾，结肠，肺和前列腺癌细胞系和黑素瘤和正常成纤维细胞株。细胞在补充有10％的透析后胎牛血清，10μm羟钴胺素和100μm叶酸的Eagle′s极限必需培养基(MEM培养基)中生长。该培养基以下面方式补加或不补加蛋氨酸MET+HCY用100μm不含高半胱氨酸的L-蛋氨酸补加该培养基。METHCY+用200μm不含蛋氨酸的D，L-高半胱氨酸补加该培养基。METHCY该培养基不含蛋氨酸且不含高半胱氨酸。胎牛血清对磷酸盐缓冲盐水(PBS)(血清∶PBS为1∶12)透析10次。
通过在450nm测定染料XTT的代谢还原的吸收来测定细胞增殖。通过每孔中接种5×103和2×104个细胞范围之内的细胞让细胞在48孔平皿上生长。活细胞中被代谢还原成水溶性甲产物的XTT(2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑鎓氢氧化物被用来测定细胞增殖。在450nm处测定还原产物的吸收值。在37℃PBS中预温制备1mg/mlXTT，在PBS中制备5mM吩嗪N-甲硫酸酯(PMS)。新鲜XTT溶液与PMS储溶液以每1ml XTT 511 PMS的比例混合。每孔装入1ml培养基。向每孔中加入0.25ml混合的XTT。接种3小时后用Hitachi U-2000分光光度计在450nm处读出还原的XTT的吸收值。细胞最初培养24小时后每三天测定一次XTT的OD。在MET+HCY-或MET-HCY+中，包皮成纤维细胞株FS-3和HS-68基本上相等地增殖。但是本发明书报导了一个新发现，即在MET HCY培养基中，两种成纤维细胞株增殖到某一程度后保持至少16天。
表2详细说明了20种肿瘤细胞系的细胞增殖的测定结果。在该测定中，将5×103-2×104个细胞/孔的细胞悬浮液在48孔平板上在含有10％胎牛血清的MEM中培养24小时。用Hanks碱性盐溶液(HBSS)将细胞洗涤两次后分为三组。第一组细胞在MET+HCY-培养基中培养；第二组细胞在MET-HCY+培养基中培养；第三组细胞在MET-HCY-培养基中培养。细胞在用95％空气/5％CO2通气的培养箱中培养。每2-3天换一次培养基。在表2中，细胞系生长旺盛的用a+++表示，有所生长的用a++表示，稍有些生长的用a+表示，没有生长的用a-表示。大约一半的肿瘤细胞系在无MET含HCY的培养基中不能生长，而其它细胞系不同程度生长，而用相同的培养基以及在含MET的培养基中，正常细胞可以生长。尽管在无MET无HCY的培养基中，正常细胞株能生长到一定程度后保持2星期或更长时间，但所有被试20种肿瘤细胞系在该培养基中死亡，这表明有可能所有的癌细胞通过去除MET而被有选择地杀死。这一实施例提供了证据证明对于癌症治疗尤其是用蛋氨酸酶作为治疗剂来说，蛋氨酸依赖性可能是普遍的和选择性的目标。


实施例3小鼠异种移植模型中蛋氨酸酶对人肿瘤生长的抑制作用为试验蛋氨酸酶对减缓肿瘤生长的药效，使用了小鼠异种移植模型。人肺癌肿瘤(H460)被移植到裸鼠的皮下组织中。每四只小鼠一组将小鼠分为四组。移植四天后，通过每4小时向腹腔内注射给予A组0.4ml缓冲液(0.12M氯化钠，10mM磷酸钠，pH7.1)；通过每4小时向腹腔内注射给予B组蛋氨酸酶(1单位/g)；通过每4天向腹腔内注射给予C组5-FU(60mg/kg)；通过每4天腹腔内注射给予D组长春新碱(VCR)(0.9mg/kg)。每两天测量一次肿瘤大小和体重。结果示于表2和3。结果表明，用蛋氨酸酶治疗大大减缓了裸鼠体内H460人非小细胞肺癌的生长。在这些实验中，小鼠喂进不去除蛋氨酸的正常食物。蛋氨酸酶抗H460的药效完全与5-氟尿嘧啶和长春新碱治疗相反，后两种药物没有抗该肿瘤的活性。给予蛋氨酸酶40-120活性单位/天的10天治疗内没有引起体重减少，这表明其具有低毒性。相反，长春新碱引起体重减少，表明有毒性。因此，蛋氨酸酶是一种有新的肿瘤选择性作用方法的毒性小的高效抗肿瘤剂，证明有抗人固体肿瘤潜力的临床效果。
实施例4
制备PEG-蛋氨酸酶分子量为5000的甲氧聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(M-SC 5000PEG)被溶解于20mM磷酸钠缓冲液(pH8.3)中，浓度在2mM和20mM之间。M-SC5000PEG与蛋氨酸酶的摩尔比自6∶1至240∶1变化。PEG化反应在反应缓冲液(25mM磷酸钠缓冲液，pH8.3)中在4℃或20℃进行30分钟至60分钟。用终止缓冲液(0.14M磷酸钠缓冲液，pH6.5)在0℃终止反应。然后按照本文说明的凝胶过滤层析去除未反应的M-SC 5000PEG。使用30k AmiconCentriprep浓缩器，在0.12M氯化钠和10mM磷酸钠(pH7.2)中配制成最终PEG-蛋氨酸酶。然后通过0.2μm微粒膜过滤器的过滤作用将PEG-蛋氨酸酶灭菌。该PEG-蛋氨酸酶可以在-70℃保存至6个月而不丧失活性。
测定蛋氨酸酶活性。PEG-蛋氨酸酶保留至少60％未PEG化蛋氨酸酶的活性。按照Laemmli和Sambrook的说明(Laemmli，“成熟”(Mature)227-680，1970；Sambrook等，“分子克隆，实验指南”(Molecular Cloninga laboratorymanual)18，47-18.59，1989)，通过天然和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PEG-蛋氨酸酶，并进行了如下改进在有或没有SDS的0.2MTris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)中的7.5％聚丙烯酰胺预制凝胶中进行PEG-蛋氨酸酶电泳。凝胶用考马斯蓝染色，并用40％甲醇10％乙酸去色。尽管在SDS凝胶中可见一条非常小的电泳带，但当PEG-蛋氨酸酶施用到天然凝胶上时，见不到未修饰蛋氨酸酶的电泳带。
然后如下用HPLC凝胶过滤柱分析PEG-蛋氨酸酶将PEG-蛋氨酸酶(20μl，1-2mg/ml以一个20μl的加样器加到0.2M磷酸纳缓冲液(pH7.2)中的Progel-TSK G3000SW(Supelco)柱上，并用0.2M磷酸钠缓冲液(pH7.2)以流速1.0ml/min洗脱。只检测到一个蛋白质峰，即不含未反应的PEG的PEG-蛋氨酸酶峰；检测不到未PEG化的蛋氨酸酶峰。PEG-蛋氨酸酶的纯度大约是100％。
a)PEG化反应的时间进程研究如下测量聚乙二醇与蛋氨酸酶结合作用的时间进程0.07mM蛋氨酸酶与0.4mM-SC 5000PEG在4℃在0.2M磷酸钠缓冲液(pH8.3)中反应不同时间，至多反应2小时。在各时间点用0.2M磷酸钠(pH6.5)终止反应。用30kAmicon离心制备浓缩器去除未反应的PEG。结果见表3。
按照本文的说明在天然和SDS-PAGE凝胶上分析PEG-蛋氨酸酶测到有高分子量带出现，并在表3中标明-、+-、+、或++符号，-表明没有PEG-蛋氨酸酶或蛋氨酸酶，+-表明有少量PEG-蛋氨酸或蛋氨酸酶，++表明有大量PEG-蛋氨酸酶或蛋氨酸酶。表3也表明PEG-蛋氨酸酶或蛋氨酸酶的活性。

*M＝蛋氨酸酶**p＝M-SC 5000-PEG.
b)用M-SC 5000PEG对蛋氨酸酶PEG化的浓度依赖性0.07mM蛋氨酸酶与各种浓度(0.4mM至4.0mM)的M-SC 5000PEG在0.2M磷酸钠缓冲液(pH8.3)中反应。摩尔比是1∶6～1∶60。反应在实施例a相同的条件下在4℃进行60分钟。
结果见表4。

*M蛋氨酸酶**P:PEG.***P-M:PEG-蛋氨酸酶。
C)PEG-蛋氨酸酶的药物动力学蛋氨酸酶PEG化作用的M-SC 5000PEG对蛋氨酸酶的摩尔比分别是1∶6(P1)和1∶12(P2)。反应在上文(b)中相同的条件下进行。纯化的P1和P2以及未修饰的蛋氨酸酶分别注入三组不同小鼠的尾静脉。在0，1，2，3，4和20小时取血样，对蛋氨酸酶和PEG-蛋氨酸酶进行活性测定，并测定去除蛋氨酸的水平，结果见表5。

M蛋氨酸酶。**P1，P2:PEG-蛋氨酸酶实施例5使用PEG-蛋氨酸酶在豚鼠体内进行抗原性实验蛋氨酸酶与M-SC 5000PEG分别以摩尔比1∶60，1∶120和1∶240在20℃反应30分钟。其它条件与上文(a)相同。通过蛋氨酸酶活性测试，电泳和HPLC分析PEG-蛋氨酸酶。检测不到未修饰蛋氨酸酶的带或峰。因此，PEG-蛋氨酸酶是唯一的酶源。
每2天对豚鼠腹腔内给药2mg蛋氨酸酶或PEG-蛋氨酸酶，共给药三次。两星期后，静脉内给药4mg蛋氨酸酶或PEG-蛋氨酸酶。在该实验中分别以0.2磷酸钠缓冲液和BSA作为阴性和阳性对照物。根据表6的标准评估结果。结果见表7。根据豚鼠体内试验，蛋氨酸酶的PEG化作用产生了极低抗原性的成分。已知豚鼠与人相比对抗原更敏感。
表6豚鼠体内PEG-蛋氨酸酶抗原性研究的评估标准0.正常1. 不安静2.立毛3. 发抖4.鼻流粘液5. 打喷嚏6.咳嗽7. 呼吸过度8.排尿9. 排便10. 流泪11.呼吸困难
12.有鼾音13.发绀14.步态蹒跚 15.跳跃16.喘息并扭动17.抽搐18.侧位 19.潮式呼吸20.死亡评估标准(-) 阴性无变化(+) 轻变1-4(++) 中度1-10(+++) 严重1-19(++++)死亡20

结果表明，PEG-蛋氨酸酶与牛血清白蛋白(B.S.A)相反，蛋氨酸酶在豚鼠体内无抗原性，这表明当对哺乳动物给药时，PEG-蛋氨酸酶是非抗原性的。
实施例6给药蛋氨酸酶用于人癌症治疗已开始进行蛋氨酸酶第I阶段剂量递增研究来测定蛋氨酸酶毒性，药物动力学和最大容许剂量。通过给2名晚期乳腺癌患者静脉内(iv)输注2小时给予5000单位(0.5g)和10000单位(1.0g)蛋氨酸酶的2小时输注。从0至24小时以频繁间隔取血样和尿样。根据WHO等级系统进行毒性评估。从血清中蛋氨酸酶和蛋氨酸两者的水平而获得药物动力学数据。
没有发现急性临床毒性，测定的所有毒性标准都有0的最小等级。患者1和患者2体内蛋氨酸酶的半衰期分别是2小时和3.2小时。输注后30分钟内开始去除血清蛋氨酸，且在输注完成后保持4个小时。患者1和患者2体内最低血清蛋氨酸水平分别是处理前水平的35％和19％。结果示于表8-10和图4-6。如下对患者进行治疗患者1日期1994年12月14日。诊断晚期乳腺癌，腋窝淋巴结和肺转移。女性，46岁。2小时内静脉内输注200ml给药5000单位(0.4g)根据提取方法(实施例1)纯化的蛋氨酸酶。治疗前以及治疗后每2小时直至治疗后20小时取血样。测量蛋氨酸和蛋氨酸酶水平并计算相对水平，图4。
患者2日期1995年2月2日。诊断晚期乳腺癌，腋窝淋巴结转移。女性，54岁。2小时内静脉内输注400ml给药10000单位(0.8g)根据提取方法(实施例1)纯化的蛋氨酸酶。治疗前以及治疗后每2小时直至治疗后20小时取血样。测量蛋氨酸和蛋氨酸酶的水平并计算相对水平，图5。
患者3日期1995年10月15日。诊断晚期乳腺癌，腋窝淋巴结转移。女性，45岁。10小时内静脉内输注1000ml给药20000单位(1.6g)根据提取方法(实施例1)纯化的蛋氨酸酶。治疗前以及治疗后每2小时取血样，直至治疗后20小时，测量蛋氨酸和蛋氨酸酶水平，并计算相对水平，图6。
患者3在输注后的6小时内保持最大水平的50％高的蛋氨酸酶血清水平。通过10个小时的输注，蛋氨酸去除超过200倍，从23.1μM降至0.1μM。在所有毒性标准测定中没有发现临床毒性。
根据WHO毒性标准在四个方面进行毒性评估a.病史和诊断数据；b.身体检查；c.实验室评估；和d.药物动力学评估(血清中蛋氨酸酶和蛋氨酸含量)。表8-11和图4-6所示结果证明本发明蛋氨酸酶在人体中是无毒性的且可以用来降低蛋氨酸水平。





实施例7体内高半胱氨酸的去除通过如下对小鼠给药该酶证明了本发明的蛋氨酸酶用于去除高半胱氨酸的体内效力给小鼠腹腔内注射实施例1的方法纯化的4单位蛋氨酸酶。注射大约1小时后，通过对50μl PITC衍生化的鼠血清进行反相FPLC分析来测定蛋氨酸，高半胱氨酸和半胱氨酸的血样浓度。将色谱图与PITC衍生的原样品蛋氨酸，高半胱氨酸，和半胱氨酸标准样品的色谱图相比较。测试的灵敏性是大约0.5μM蛋氨酸。
如表11所示，与未处理的小鼠对照的高半氨酸和半胱氨酸相比，蛋氨酸酶具有显著的体内高半胱氨酸去除活性，而没有任何明显的体内半胱氨酸的去除作用。

实施例8蛋氨酸酶用于肿瘤显像如本说明书所说明的，通过给药纯化的蛋氨酸酶，从患者体内去除[12C]蛋氨酸。优选地，该蛋氨酸酶无内毒素。通过静脉内输入4～8小时给药蛋氨酸酶(10000-20000单位)。然后给予大约5-50mCi[11C]蛋氨酸酶。然后应用正电子发射断层显像(PET)成像来测定患者细胞[11C]示踪剂的摄入。通过本领域普通技术人员公知的方法，通过计算标准化摄入值(S、U、V)和动态流入常数(Ki)值定量测定示踪剂摄入量。细胞内升高水平的[11C]蛋氨酸表明这些细胞可能是肿瘤细胞。肿瘤细胞优先摄入[11C]蛋氨酸提供了一种在正常细胞中选择性地检测肿瘤细胞的方法。
上文的具体说明，包括具体实例和实施例是为了详细说明本发明而不作为限定。不超过本发明真正精神和范围，可以进行多种其它的变化和修饰。
实施例9
分离编码蛋氨酸酶的核酸分子蛋氨酸酶基因克隆插入物的PCR反应用ATCC8209衍生的恶臭假单孢菌AC-1的基因组DNA作为模板；所用引物如下t15′-GCCGGTCTGTGGAATAAGCT-3′(有义)，Hind IIIt25′-CCAGGGTCGACTCCAGCGCC-3′(反义)Sal IPCR反应条件如下在95℃第一次变性10分钟，然后在94℃变性30秒，在60℃退火30秒，在72℃延伸2分钟，进行5个循环然后在94℃变性30秒，60℃退火30秒，然后在72℃延伸1.5分钟，进行25个循环；然后在75℃最后伸展10分钟。PCR扩增产物有两条电泳带，收集其中1365bp的带，纯化物是插入物ONCase-1DNA。
克隆和转化ONCase-1DNA与pT7Blue T-载体(Novagen)在EcoR VT-克隆位点连接。用标准方法将pONCase-1DNA转化到DH5-α细菌细胞中。
DNA序列测定用T7DNA聚合酶和双脱氧核苷酸终止反应进行DNA序列测定。使用引物游走方法。用[35S]dATP标记。在含有8M尿素的6％聚丙烯酰胺楔形或非楔形凝胶上分析测序反应。以ACGT顺序装载DNA样品。通过Mac载体分析DNA序列。图8提供了DNA序列和相应的氨基酸顺序。
实施例10重组蛋氨酸酶的高表达克隆蛋氨酸酶表达克隆的插入物的PCR反应用pONCase-1克隆作为模板，所用引物如下t14.5′-GGAATTCCATATGCACGGCTCCAACAAGC-3′(有义)NdeIt15.5′-AGTCATCCTAGGTCACATCATCATCATCATCATGGCACTCGCCTTGAGTGC-3′(反义)BamHIt18.5′-AGTCATCCTAGGTCAGGCACTCGCCTTGAGTGC-3′(反义)BamHI
PCR反应条件如下在95℃第一次变性10分钟，然后在94℃变性1分钟，在56℃退火1.5分钟，并在72℃延伸2分钟，进行5个循环；然后在94℃变性30秒，在56℃退火30秒，然后在72℃延伸1.5分钟，进行20个循环；然后在72℃最后延伸10分钟。收集并纯化两个PCR扩增产物，ONCase-2(1238bp)，ONCase-3(1220bp)带。
克隆和转化用Nde I和Bam HI消化ONCase-2和ONCase-3DNA，并与pT7.7载体在Nde I和Bam HI克隆位点连接。然后用标准方法将PONCase-2和PONCase-3DNA序列转化到BL21(DE3)细菌细胞中。
选择pAC-1和pAC-2克隆在含氨苄青霉素的平板上选择阳性克隆。在4℃保存24小时后，表达高水平重组蛋氨酸酶的阳性克隆具有明显的用于鉴别和选择的粉红色。通过活性分析来测定阳性克隆的蛋氨酸酶的表达水平。选择的两种高表达克隆是包含ONCase-3的pAC-1克隆和包含ONCase-2的pAC-2克隆。
构建pAC-3克隆和pAC-4克隆从pBR322在AvaI和Cla I位点获得四环素抗性基因。Ava I端被补充到平端，并与pAC-1连接，所述pAC-1被BamHI和ClaI限制性内切酶消化，BamHI端被补为平端。从含四环素的平板上挑选在4℃保留24小时后变成粉色的阳性克隆。通过活性分析测定高表达重组蛋氨酸酶克隆，并命名为pAC-3克隆。
从pBR 322在位点Ava I和Hind III也获得了四环素抗性基因。Ava-1端充入一个平端，并与用Hind III和Cla I限制性内切酶消化的pAC-1连接，Cla I端充入一个平端。从含四环素的平板上挑选在4℃保存24小时后变粉色的阳性克隆。用活性分析测定高表达重组蛋氨酸酶克隆，并命名为pAC-4克隆。表12和图9提供了各种高水平表达克隆。


实施例11重组蛋氨酸酶表达克隆的发酵作用在含有氨苄青霉素(100μg/ml)或四环素(10μg/ml)的Terrific Broth培养基中，在28℃或37℃，400rpm摇荡，在6L培养瓶或发酵罐中培养重组蛋氨酸酶的表达克隆。
实施例12重组蛋氨酸酶的纯化图10和11提供了纯化方法的略图。
(1)样品上柱前的处理在4℃以800×g离心10分钟收集细菌，然后将细菌片状沉淀物悬浮于提取溶液(20mM磷酸钾(pH9.0)，10μm磷酸吡哆醛和0.01％β-巯基乙醇)，并用空腔型匀浆器(Microfluidics Corp.model#HC 8000)破碎。然后在50℃将匀浆物进行热处理1分钟。用自动冷冻离心机(SORVALL SuperspeedRC2-B)在4℃以13rpm将悬浮液离心30分钟。然后收集上清液。接着通过Millipore prep/Scale-TFF PLHK 100k 2.5ft2柱体用缓冲液(10mM磷酸钾，pH8.3)超滤。通过超滤将pH调至7.2。
(2)柱层析条件第一柱DEAE琼脂糖FF柱XK 100/60，高度32cm，体积2.5L溶液[A]含有10μm磷酸吡哆醛和0.01％β-巯基乙醇的40mM氯化钾，10mM磷酸钾(pH7.2)。
含有10μm磷酸吡哆醛和0.01％β-巯基乙醇的200mM氯化钾，10mM磷酸钾(pH7.2)。
流速5ml/min样品大约100-200g总蛋白质(10-20mg/ml)被施加到第一柱子上。
梯度[1]用大约10体积的溶液A预先冲洗至OD280降到低于0.1。
梯度20％-100％溶液B级分收集200ml洗脱级分。通过活性分析鉴别含rMETase的级分并集中。
第二柱DEAE琼脂糖FF柱XK 50/30，高度25cm，体积500mL溶液[A]含10μm磷酸吡哆醛和0.01％β-巯基乙醇的100mM氯化钾，10mM磷酸钾(pH8.3)。
含10μm磷酸吡哆醛和0.01％β-巯基乙醇的200mM氯化钾，10mM磷酸钾(pH8.3)。
流速5ml/min样品在含有10μm磷酸吡哆醛的100mM氯化钾，10mM磷酸钾(pH8.3)中透析24小时后将大约10-20g总的蛋白质(2-4mg/ml)施加到第二柱子上。
梯度[1]用大约5体积的溶液A预先冲洗至OD280降到低于0.05。
梯度0％～60％溶液B。
级分收集200ml洗脱级分。通过活性分析鉴别含rMETase的级分并集中。
第三柱Sephacryl S-200HR柱Hi Prep 26/60，体积320ml。
溶液0.15M氯化钠的10mM磷酸钠(pH7.2)溶液。
流速1.2ml/min样品大约10ml浓缩样品。(在0.15M氯化钠，10mM磷酸钠(pH7.2)中透析12小时)，施加到第三柱上。
级分通过黄颜色和活性分析鉴别含rMETase的洗脱级分并收集。
第四柱ActicleanEtox100-200ml体积的纯化的rMETase(10-20mg蛋白质/ml)被加到500mlActicleanEtox柱上，用洗脱缓冲液(0.15M氯化钠的10mM磷酸钠溶液，pH7.2)洗脱以去除内毒素。ActicleanEtox可再生使用，并可用1M氢氧化钠洗净，并可以高压灭菌。
浓缩终洗脱液用30K Amicon离心制备浓缩机浓缩最终洗脱液。纯化的rMETase的制剂是0.15M氯化钠，10mM磷酸钠，pH7.2。
纯化rMETase。组氨酸在Ni++琼脂糖凝胶柱上进行层析上柱前预处理后，将细胞匀浆物悬浮在结合缓冲液中(5mM咪唑，0.5MNaCl，20mM Tris-HCl，pH7.9)。然后用10体积结合缓冲液冲洗柱子，接着用6体积洗涤缓冲液(60mM咪唑，0.5M氯化钠，20mM Tris，HCl，pH7.9)冲洗。6体积洗脱缓冲液(1M咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris·HCl pH7.9)通过柱子后发生洗脱。通过黄颜色鉴别含rMETase的级分，并收集。
实施例13用HPLC测定rMETase的纯度柱SUPELCO，8-08541，Progel TM-TSK，G 3000-SWXL，30cm×7.8mm。
洗脱溶液0.15M氯化钠的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)。
流速1ml/min样品20μl(0.1-1mg/ml)生产rMETase的实施例见图10和11。纯化见图12。
实施例14结晶和冻干形式的含重组蛋氨酸酶(rMETase)的制剂溶液制剂以10-20mg/ml的浓度，配制rMETase溶液，所述溶液是0.15M氯化钠，10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)。rMETase的稳定性见图13。
结晶形式将0.15M氯化钠和10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中的rMETase(10-20mg/ml)用Sephadex G-25(DNA级，超细，Sigma)柱脱盐。该溶液在干冰和丙酮浴中冷冻，然后用Verdis Freeze Mobile 24，在100毫巴真空中在-80℃结晶72小时。
冻干形式在0.15M氯化钠和10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中的rMETase(10-20mg/ml)在干冰和丙酮浴中冷冻，并用Verdis Freeze Mobil 24在100毫巴真空中在-80℃冻干72小时。
活性测试测试是在1ml体积含10μM磷酸吡哆醛和10mM蛋氨酸的50mM磷酸盐缓冲液pH8.0中在37℃，用不同量的酶进行10分钟。加入0.5ml 4.5％TCA终止反应。悬浮液以15K rpm离心2分钟。将0.5ml上清液与0.5ml 0.05％3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙及1ml 1M乙酸钠(pH5.2)溶液一起在50℃温育30分钟。然后用分光光度计在OD335测定α-丁酮酸根。用Lowry Reagent试剂盒(Sigma)的方法测定蛋白质的量，以单位/mg蛋白质计算比活度。
比较rMETase活性，结果表明不同制剂之间没有大的差别。
实施例15重组蛋氨酸酶(PEG-rMETase)的化学修饰在0.15M氯化钠的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中以0.1M和0.2M之间的浓度配制纯化的rMETaes。活性大约是20单位/mg。
将分子量5000的M-SC 5000PEG(Methoxy-SC-PEG，MW 5000，购自Shear water聚合物公司)以2mM和20mM之间的浓度溶于20mM磷酸钠缓冲液(pH8.3)中。M-SC 5000PEG与rMETase的摩尔比自10∶1至120∶1变化。
PEG化反应在反应缓冲液(25mM磷酸钠缓冲液，pH8.3)中，在20℃进行60分钟。用终止缓冲液(0.14M磷酸钠缓冲液，pH6.5)在0℃终止反应。然后用30K Amicon Centriprep浓缩器去除未反应的M-SC 5000PEG。用30KAmicon Centriprep浓缩器离心时在0.15氯化钠和10mM磷酸钠(pH7.2)中配制最后的PEG-蛋氨酸酶。
PEG-rMETase的体外测试用活性分析，电泳和HPLC分析PEG-rMETase，图14-16。
活性分析PEG-rMETase的活性是未修饰rMETase的活性的80％至20％之间。
电泳在不变性和SDS-PAGE两者中对PEG-rMETase进行电泳。
HPLC分析将PEG-rMETase加到凝胶过滤柱上，没有测到原来的rMETase的峰，只发现PEG-METASE的峰。保留时间(RT)随PEG和rMETase分子比的增大而变短。
PEG-rMETase的药物动力学将纯化的无内毒素的PEG-rMETase注入小鼠的尾静脉。每2小时采集血样。通过活性分析测定rMETase的水平(图16)。
实施例16重组蛋氨酸酶的药效和毒性rMETase对细胞的体外生长抑制在补加有10％FBS的RPMI 1640培养基中培养KB3-1细胞(人鳞状上皮细胞癌)。向培养基中加入各种浓度的rMETase。并在37℃，5％CO2条件下温育。在OD570处测量相对细胞数。结果证明rMETase有效抑制细胞生长(图17)。
rMETase对H460和HT29的体外生长抑制人肺癌细胞H460和人结肠癌细胞HT29在不同浓度rMETase(0-4单位/ml)中生长4天，然后计数存活细胞。实试重复三次。结果证明rMETase有效抑制H460和HT29两者的细胞生长(图25)。
体外比较正常细胞和人癌细胞对rMETase的敏感性用正常人包皮成纤维细胞HS-68和人角化细胞作为对照物，与人结肠癌SW-620和人肺癌细胞H322m相比较。细胞与不同浓度(0-4单位/ml)rMETase一起生长三天后计数存活细胞数。实验重复三次。结果证明SW-620和H322m细胞在rMETase浓度为1单位/ml时死亡，而正常人HS-68细胞仍存活，只是生长速度减慢。正常人包皮成纤维细胞与肺癌细胞相比对rMETase也有小得多的敏感性(图26)。
裸鼠体内rMETase对细胞的生长抑制给Balb/c nu/nu，雌性，八只一组的小鼠注射2×105个细胞。对照生理盐水。第I组30单位rMETase，第II组100单位rMETase；从第5天至第14天，一天两次腹腔内注射。测量肿瘤大小和体重。第18天取血样。结果证明rMETase有效地抑制肿瘤生长而不减轻体重，且对血细胞生成无任何影响(图18-22)。
裸鼠体内rMETase对H460和HT29细胞的生长抑制分别皮下(S.C.)移植，106个H460细胞和HT29细胞，从第2天至第16天通过腹腔内注射每天两次给药40单位或100单位rMETase。对照组每天两次腹腔内注射生理盐水0.2ml。第16天杀死小鼠。结果证明rMETase有效抑制肿瘤生长而不减轻体重，且不影响血细胞生成。
纯化的重组METASE的中试的第一阶段临床试验患者1，女性，50岁，IV期乳腺癌并淋巴结转移，静脉内输注10小时给药10000单位(0.5g)rMETase。
患者2，48岁，女，IV期乳腺癌并淋巴结转移，静脉内输注24小时给药5000单位(0.25g)rMETase。
患者3，56岁，女，III期肾癌，静脉内输入24小时给药10000单位(0.5g)rMETase。表13。记录身体检查，治疗前，治疗期间每两小时取血样，直至输液完后第48小时(如指明的)。根据WHO标准进行实验室测定。
结果表明，所有患者在输液开始后rMETase水平立即升高，并在输液期间保持高水平。一个患者在48小时后蛋氨酸酶水平降回基础线。结果表明，输液开始后rMETase水平立即升高，在10小时时达到最高点。输液停止后8小时，蛋氨酸酶水平是峰值的50％，且在输液后16小时仍保持峰值的20％。根据WHO标准评估实验室检查结果，表明患者1，2或3没有急性毒性反应。表14和15和图23和24。结果表明rMETase不引起任何毒性。




序列表<110>抗癌公司(ANTICANCER，INC.)谭玉英(TAN，Yuying)瓦莱利.里什科(LISHKO，Valeriy)<120>蛋氨酸酶在抗蛋氨酸和抗高半胱氨酸的化学治疗中的应用<130>31276-20002.75<140>200410078709.x<141>2004-09-17<150>PCT/US96/09935<151>1996-06-07<150>US 08/486,519<151>1995-06-07<150>US 08/624,541<151>1996-05-03<160>7<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物(有义)<400>1gccggtctgt ggaataagct 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物(反义)<400>2ccagggtcga ctccagcgcc 20<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物(有义)<400>3ggaattccat atgcacggct ccaacaagc 29<210>4<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物(反义)<400>4agtcatccta ggtcacatca tcatcatcat catggcactc gccttgagtg c51<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物(反义)<400>5agtcatccta ggtcaggcac tcgccttgag tgc 33<210>6<211>1260<212>DNA<213>恶臭假单胞菌(P.putida)<220>
<221>CDS<222>(48)...(1241)<400>6gccggtctgt ggaataagct tataacaaac cacaagaggc ggttgcc atg cac ggc56Met His Gly1tcc aac aag ctc cca gga ttt gcc acc cgc gcc att cac cat ggc tac104Ser Asn Lys Leu Pro Gly Phe Ala Thr Arg Ala Ile His His Gly Tyr5 10 15gac ccc cag gac cac ggc ggc gca ctg gtg cca ccg gtc tac cag acc152Asp Pro Gln Asp His Gly Gly Ala Leu Val Pro Pro Val Tyr Gln Thr20 25 30 35gcg acg ttc acc ttc ccc acc gtg gaa tac ggc gct gcg tgc ttt gcc200Ala Thr Phe Thr Phe Pro Thr Val Glu Tyr Gly Ala Ala Cys Phe Ala40 45 50ggc gag cag gcc ggc cat ttc tac agc cgc atc tcc aac ccc acc ctc248Gly Glu Gln Ala Gly His Phe Tyr Ser Arg Ile Ser Asn Pro Thr Leu55 60 65aac ctg ctg gaa gca cgc atg gcc tcg ctg gaa ggc ggc gag gcc ggg296Asn Leu Leu Glu Ala Arg Met Ala Ser Leu Glu Gly Gly Glu Ala Gly70 75 80ctg gcg ctg gcc tcg ggc atg ggg gcg atc acg tcc acg cta tgg aca344Leu Ala Leu Ala Ser Gly Met Gly Ala Ile Thr Ser Thr Leu Trp Thr85 90 95ctg ctg cgc ccc ggt gac gag gtg ctg ctg ggc aac acc ctg tac ggc392Leu Leu Arg Pro Gly Asp Glu Val Leu Leu Gly Asn Thr Leu Tyr Gly100 105 110 115tgc acc ttt gcc ttc ctg cac cac ggc atc ggc gag ttc ggg gtc aag440Cys Thr Phe Ala Phe Leu His His Gly Ile Gly Glu Phe Gly Val Lys120 125 130ctg cgc cat gtg gac atg gcc gac ctg cag gca ctg gag gcg gcc atg488Leu Arg His Val Asp Met Ala Asp Leu Gln Ala Leu Glu Ala Ala Met135 140 145
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130 135 140Ala Ala Met Thr Pro Ala Thr Arg Val Ile Tyr Phe Glu Ser Pro Ala145 150 155 160Asn Pro Asn Met His Met Ala Asp Ile Ala Gly Val Ala Lys Ile Ala165 170 175Arg Lys His Gly Ala Thr Val Val Val Asp Asn Thr Tyr Cys Thr Pro180 185 190Tyr Leu Gln Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Leu Val Val His Ser195 200 205Ala Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His Gly Asp Ile Thr Ala Gly Ile Val210 215 220Val Gly Ser Gln Ala Leu Val Asp Arg Ile Arg Leu Gln Gly Leu Lys225 230 235 240Asp Met Thr Gly Ala Val Leu Ser Pro His Asp Ala Ala Leu Leu Met245 250 255Arg Gly Ile Lys Thr Leu Asn Leu Arg Met Asp Arg His Cys Ala Asn260 265 270Ala Gln Val Leu Ala Glu Phe Leu Ala Arg Gln Pro Gln Val Glu Leu275 280 285Ile His Tyr Pro Gly Leu Ala Ser Phe Pro Gln Tyr Thr Leu Ala Arg290 295 300Gln Gln Met Ser Gln Pro Gly Gly Met Ile Ala Phe Glu Leu Lys Gly305 310 315 320Gly Ile Gly Ala Gly Arg Arg Phe Met Asn Ala Leu Gln Leu Phe Ser325 330 335Arg Ala Val Ser Leu Gly Asp Ala Glu Ser Leu Ala Gln His Pro Ala340 345 350Ser Met Thr His Ser Ser Tyr Thr Pro Glu Glu Arg Ala His Tyr Gly355 360 365Ile Ser Glu Gly Leu Val Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Ile Asp370 375 380Asp Leu Leu Ala Asp Val Gln Gln Ala Leu Lys Ala Ser Ala385 390 39权利要求
1.一种化学修饰的蛋氨酸酶，它含有结合到聚合物上的蛋氨酸酶。
2.权利要求1的化学修饰的蛋氨酸酶，其中的聚合物是聚亚烷基氧化物。
3.权利要求2的化学修饰的蛋氨酸酶，其中的聚亚烷基氧化物是聚乙二醇。
4.权利要求1的化学修饰的蛋氨酸酶，其中的蛋氨酸酶基本上不含内毒素。
5.分离出的结晶型蛋氨酸酶。
6.分离出的冻干型蛋氨酸酶。
7.分离出的蛋氨酸酶，具有至少大约20个单位/mg的比活度和用HPLC分析所测定的纯度至少大约95％。
8.一种治疗组合物，它含有治疗有效量的权利要求1-7中任一项的蛋氨酸酶。
9.一种治疗肿瘤患者的方法，它包括将治疗有效量的权利要求8的蛋氨酸酶组合物给患者服用的步骤。
10.一种诊断患者肿瘤的方法，它包括下列步骤a)通过给患者服用蛋氨酸酶来去除患者体内的12C蛋氨酸；b)通过给患者服用11C蛋氨酸来给患者体内充分供应蛋氨酸；和c)测定患者体内肿瘤细胞中存在的11C蛋氨酸升高的水平。
11.权利要求10的方法，其中的蛋氨酸酶是权利要求8的组合物。
12.一种给患者治疗或预防心血管疾病的方法，它包括给该患者服用治疗有效量的蛋氨酸酶的步骤，其中的蛋氨酸酶基本上不含内毒素。
13.权利要求12的方法，其中的蛋氨酸酶是权利要求8的组合物。
14.权利要求12的方法，其中的心血管疾病是动脉硬化。
15.一种降低患者高半胱氨酸含量的方法，它包括给该患者服用治疗有效量的蛋氨酸酶的步骤，其中的蛋氨酸酶基本上不含内毒素。
16.权利要求15的方法，其中的蛋氨酸酶是权利要求8的组合物。
17.一种编码蛋氨酸酶的高效表达模型，该模型含有操作性连接启动子序列的编码蛋氨酸酶的核苷酸序列，其中该启动子序列能够引导宿主细胞中蛋氨酸酶的表达，使得蛋氨酸酶的表达是该宿主细胞所生产的总蛋白的5-75％左右。
18.权利要求17的表达模型，其中该启动子是一种RNA聚合酶的启动子。
19.权利要求18的表达模型，其中该启动子是T7 RNA聚合酶的启动子。
20.权利要求17的表达模型，其中该编码蛋氨酸酶的核苷酸序列是从选自于恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)，阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)，巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)和梭形杆菌属(Fusobacteriumsp.)中的有机体中分离的。
21.权利要求20的表达模型，其中的核苷酸序列是图8中提供的和其简并形式。
22.权利要求21的表达模型，其中图8的简并形式的核苷酸序列包括已被改变的图8中所提供的序列，该序列包括在大肠杆菌(E.coli.)中较常用的一个或多个密码子。
23.一种用权利要求17的表达模型转化的宿主细胞。
24.权利要求23的宿主，其中的宿主是大肠杆菌。
25.权利要求24的宿主，其中的宿主是大肠杆菌(E.coli.)BL21(DE3)。
26.一种载体，它含有权利要求17的表达模型。
27.一种分离出的核酸分子，它含有图8中所提供的核苷酸序列和一个或多个在蛋氨酸酶的C-或N-端编码两个或多个组氨酸残基的核酸序列。
28.一种鉴别高效表达蛋氨酸酶的转化宿主细胞的方法，该方法包括下列步骤在表达蛋氨酸酶的条件下培养转染的宿主细胞；和选择粉红色的转化宿主细胞。
29.权利要求28的方法，其中的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。
30.权利要求29的方法，其中的宿主是在固体培养基上培养的。
31.权利要求28的方法，其中所述的选择性宿主产生大约为总细胞蛋白的5到75％的蛋氨酸酶。
32.一种改良的基因疗法，其中的改良包括使用权利要求17的表达模式。
33.权利要求32的方法，其中由肿瘤特异性启动子控制该表达模型的表达。
34.一种纯化蛋氨酸酶的方法，该方法包括下列步骤a)在表达蛋氨酸酶的条件下培养表达蛋氨酸酶的宿主；b)在大约40-60℃下加热含蛋氨酸酶的转化细胞的提取物的含水缓冲液大约1-10分钟；c)在GS-3转子(Sorval，Du Pont)中以大约10k到20k rpm把加热后的提取物离心分离大约15分钟到1小时；d)使用大约50k到100k孔径的过滤器超滤上清液；e)在低离子强度(大约10-50mM)KCl大约pH7.0-7.6的条件下进行DEAE离子交换柱层析，并收集用大约40-200mM的KCl梯度溶液洗脱的含有蛋氨酸酶的级分；f)在中等离子强度(大约100-200mM)KCl大约pH8.0-8.6的条件下进行第二次DEAE离子交换柱层析，并收集用0.1-0.2M KCl的磷酸盐缓冲液洗脱的含有蛋氨酸酶的级分；g)把在步骤(e)中收集的级分与能够吸附内毒素的柱层析介质接触；和h)收集含有蛋氨酸酶的洗脱液。
35.权利要求34的方法，其中所收集的蛋氨酸酶具有每毫克蛋白至少10个单位的活性并且每毫克蛋白具有大约1-100ng的内毒素。
36.权利要求34的方法，其中在步骤(g)中使用ActicleanEtox柱。
全文摘要
本发明提供了重组宿主细胞，包含编码蛋氨酸酶的表达模型，该表达模型包含编码操作连接到启动子序列上的蛋氨酸酶的核苷酸序列，其中所述启动子序列能够引导在宿主细胞中蛋氨酸酶的表达，使得蛋氨酸酶的表达是该宿主细胞所产生的总蛋白的5－75％。本发明进一步提供了生产蛋氨酸酶的方法和鉴别表达高含量的蛋氨酸酶的重组宿主细胞的方法。
文档编号C12N5/10GK1879890SQ20061009978
公开日2006年12月20日 申请日期1996年6月7日 优先权日1995年6月7日
发明者谭玉英, 瓦莱利·里什科 申请人:抗癌公司