利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶Ⅲ蛋白的方法

文档序号:442431阅读:612来源:国知局
专利名称:利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶Ⅲ蛋白的方法
技术领域
本发明属于一种利用非人哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人的抗凝血酶III的方法,具体涉及一种利用非人哺乳动物乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法。
背景技术
抗凝血酶III(antithrombin III,简称AT-III)是人体血浆中的一种重要的抗凝血因子,它在血浆中承担着60%~70%抗凝血酶活性,在维持血液生理性凝血与抗凝血平衡中起着重要的作用,是正常人血浆中存在的重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂,其主要功能是灭活凝血酶,如与凝血酶Xa及XIa结合。并主要由肝脏合成。
人体内与凝血系统功能相桔抗的是抗凝血系统,在正常情况下,两者保持动态平衡。AT-III主要反映机体是抗凝系统的功能。AT-III的升高一般不会引起病理性后果,但是AT-III在人体中的量的减少常见于以下病例a)遗传性抗凝血酶III缺乏;b)获得性抗凝血酶III缺乏见于各种肝病,如肝硬化、重症呷、肝癌晚期等;c)抗凝血酶III丢失增多如肾脏疾病;d)抗凝血酶III消耗增多如各种原因所造成的血液凝固性增高,抗凝血酶III中和活化的凝血因子,以致消耗增加。
e)最重要的是AT-III的先天性或后天获得性缺乏症可导致血栓的形成,而引起脑血栓或心肌梗塞等等非常严重的疾病。
因此,AT-III在临床上,有预防和治疗急慢性血栓血塞形成的作用,对治疗抗凝血酶缺失症有显著效果,目前市场有从人体血浆中提取的人抗凝血酶III蛋白,也有用细胞和酵母作为表达载体在体外生产的重组人抗凝血酶III。世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶III(商品名ATryn,GTC生物治疗公司,美国)于2006年6月通过欧洲医药评价署人用医药产品委员会(EMEA)的上市评估,同年8月获得欧洲委员会的上市许可,并将在不久的未来(2007年)开始在欧洲市场上销售。这也证明利用哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人抗凝血酶III(AT-III)的可行性和市场价值。
GTC生物治疗公司在美国拥有几个专利其中包括1转基因方法生产人抗凝血酶III(Transgenically produced antithrombin III,专利号5,843,705和6,441,145);2人抗凝血酶III及其相关方法(Human antithrombin IIIs and methods related thereto,专利号6,878,813);3转基因羊生产的重组人抗凝血酶III的治疗(Treatments using transgenic goatproduced antithrombin III,专利号7,019,193)等。
本专利公开的一种利用非人哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人的抗凝血酶III(AT-III)的方法与GTC生物治疗公司的相关专利生产的人的抗凝血酶III的方法存在关键的区别
1,本专利生产的重组人的抗凝血酶III蛋白质只是抗凝血酶III蛋白质的成熟部分(即功能部分氨基酸33-464),GTC生物治疗公司生产的重组人的抗凝血酶III蛋白质有抗凝血酶III蛋白质的信号部分(氨基酸1-32)和成熟功能部分(氨基酸33-464);2,本专利是将重组人的抗凝血酶III蛋白质表达载体首先转入体外培养的山羊胎儿成纤维细胞中,然后再用体细胞核移植技术(克隆技术)获得含有人的抗凝血酶III蛋白质基因的转基因动物,GTC生物治疗公司是将重组人的抗凝血酶III蛋白质表达载体直接注射到山羊受精卵的原核中(原核注射法),所获得含有人的抗凝血酶III蛋白质基因的转基因动物;3,本专利的重组人的抗凝血酶III蛋白质表达载体,是用的乳腺蛋白质的分泌信号多肽(MKVLILACLVALAIAL)将表达的重组人的抗凝血酶III蛋白质从转基因动物的乳腺细胞分泌到乳汁中,GTC生物治疗公司是用的人的抗凝血酶III蛋白质的信号肽(分泌多肽),实验证明乳腺蛋白质的分泌信号多肽在乳腺细胞中的分泌能力比其它信号多肽的分泌能力强。
4,本专利所表达的蛋白质中含有一个Enterokinase蛋白质酶切序列(DDDK),可将分泌多肽和重组人的抗凝血酶III蛋白质(功能部分)分开,增强重组人的抗凝血酶III蛋白质的活性和治疗功能。
本发明专利采用体细胞核移植技术(克隆技术,Wilmut et al,1997)来获得转人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因的动物,与原核注射法获得的转基因动物(GTC生物治疗公司所用的方法)相比,大动物转基因体细胞的克隆有以下的优点获得转基因动物的效率高,资金投入少;更重要的是,可以首先对体外培养的细胞进行遗传改造,如转基因的整合及检测,甚至监测转基因在细胞内的表达量。
中国还没有类似利用非人哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的专利,申请人检索到几个相关专利或申请从水蛭中分离抗凝血酶多肽的方法方面的专利(CN1066272和CN1452986等),抗凝血酶-III的生产方法纯化方法及含该酶的制剂(CN1189502)和凝血酶试剂,以及检查试剂套装(CN1504580)等专利。
本发明采用崂山奶山羊为研究动物,崂山奶山羊(Capra hircus)是我国的高产奶山羊之一,产奶量大,产奶期8个月以上,长者可达10个月,一胎羊平均年产奶310公斤,二胎羊平均年产奶590公斤,三胎羊平均年产奶700公斤以上,高者可达1300公斤,相当于1/3头奶牛的产奶量,而且山羊的研究周期短,饲养管理费用低,是乳腺生物反应器的重要研究对象之一。
本发明的特点是用体细胞克隆和转基因动物的方法在转基因动物的乳腺中生产重组人的抗凝血酶III(AT-III)的方法。

发明内容
本发明的目的是将人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因,与乳腺蛋白基因的启动子和终止信号连接构建重组人的抗凝血酶III(AT-III)基因的表达载体,再通过转染体细胞和体细胞核移植的方法,将人的抗凝血酶III(AT-III)基因转入动物的基因组内,而表达重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白。在转基因动物的乳汁中特异高效表达人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白。然后通过蛋白质提纯的方法将转基因动物的重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白质提纯,制成注射针剂,用于人的抗凝血酶III(AT-III)缺乏症的治疗。
本发明的技术解决方案是研制一种利用非人哺乳动物乳腺生物反应器生产人的抗凝血酶III(AT-III)的方法,包括下述步骤1.选用哺乳动物的乳蛋白基因为转基因的调控区和表达框架,在乳蛋白基因的表达框架上建立一个唯一的酶切位点,然后将人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因(功能部分),乳蛋白分泌序列和肠激酶(Enterokinase)蛋白质酶切序列基因,连接在乳蛋白基因的表达框架上,转基因载体的末端再连接一个筛选基因。
2.所构建的载体经DNA序列分析,确定人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因(功能部分)和乳蛋白基因的DNA序列,并与乳蛋白基因本身的表达和功能基因的氨基酸组成一致;3.用电穿孔或脂质体诱导的方法将人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因表达载体转入体外培养的动物的体细胞中;4.在培养基中对细胞株进行筛选,获得筛选后的阳性细胞株;一部分细胞冷冻保存,一部分细胞用于制备DNA;5.阳性细胞株的DNA,经PCR和Southern杂交分析,确定含有人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因的细胞株;6.转基因的细胞株的细胞移入山羊成熟的去核卵母细胞的卵周隙内,然后使供核细胞和去核卵母细胞融合;7.将克隆胚胎移植到寄母羊的输卵管中,经妊娠获得转基因克隆羊;8.检测转人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因动物的乳汁中的人抗凝血酶IH(AT-III)蛋白的含量和活性;9.含有人的抗凝血酶III蛋白的转基因动物的乳汁中的重组人的抗凝血酶III蛋白的提纯;10.纯化的重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的动物试验和人体试验;11.重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白在人体上的应用。
上述的利用乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法,其特征是所述的乳蛋白基因包括晡乳动物的乳球蛋白、α-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳浆蛋白基因或乳铁蛋白基因。
上述的利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III蛋白的方法,其特征是将人的抗凝血酶III蛋白基因连接在乳蛋白基因的表达框架上,并转入哺乳动物的基因组内,然后在转基因动物的乳汁中获得特异高效表达。
上述的利用乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法,其特征是所述的哺乳动物包括牛、绵羊和山羊、猪、兔、马。
一种利用乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法,生产含有重组人的抗凝血酶III蛋白的转基因动物,及其乳汁和制品。
上述的转基因动物的乳汁进行提纯得到的重组人的抗凝血酶III蛋白,在治疗抗凝血酶III缺乏症中的应用。
本发明的有益效果如下本发明是用体细胞核移植(克隆)技术获得人抗凝血酶III基因的转基因动物,比其他方法获得转基因动物的效率高。
本发明是从转基因动物的乳汁中获得重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白,提供制备重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的原料药;从含有重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的转基因动物的乳汁中提取、纯化重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白,制成注射用针剂,经注射到人体内,达到治疗人体抗凝血酶III(AT-III)蛋白缺乏症的目的。


图1是AT-III转基因克隆技术路线示意图;图2-1、图2-2、图2-3是转基因克隆羊的Southern分析数据示意图;图3是转AT-III基因克隆羊的后代奶中的AT-III含量分析数据示意图;图4是转AT-III基因克隆羊的后代奶中的AT-III的活性分析数据示意图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本申请的技术方案作进一步阐述。
图1中,显示AT-III转基因克隆技术路线示意图。
分为11个步骤第1步构建奶山羊基因组文库;第2步用绵羊的部分酪蛋白基因探针获得奶山羊β-酪蛋白基因;第3步去除部分外显子2与7之间的奶山羊β-酪蛋白基因序列,建立乳蛋白分泌序列,唯一的Not1和Xho1酶切位点;图中, 代表乳蛋白分泌序列第4步人的抗凝血酶III蛋白基因和Enterokinase蛋白质酶切序列的PCR。
人肝细胞mRNA的获得,转录成cDNA,PCR反映获得全部的ATIII基因编码序列,序列分析。再用PCR反映获得AIII基因的成熟部分DNA和乳蛋白分泌序和Enterokinase蛋白质酶切序列。
图中, 代表酶切序列; 代表AT-III功能部分;第5步ATIII转基因表达载体的构建;第6步新酶素基因(Neomycin)的连接;第7步体外细胞培养和转化;第8步ATIII转基因体细胞的克隆;第9步克隆羊的繁殖和转基因检测;第10步奶中ATIII蛋白质的检测和提纯;第11步重组人的抗凝血酶III蛋白的在治疗抗凝血酶III缺乏症中的应用。
图2中,显示转基因克隆羊的Southern分析数据图2-1左侧显示的小羊(箭头所指)是所获得的第一只ATIII转基因克隆,在出生后78天死亡;右侧显示克隆小羊羔DNA(1号)和供核细胞DNA(2号)的Southern杂交图;图2-2为转AT-III基因的克隆羊群;图2-3为ATIII转基因的PCR结果图1,2,5是寄母羊;3,4,6和7转抗凝血酶III基因的克隆羊,8是空白对照,MW是DNA分子量。
图3中,1.AT-HI标准品(30ug);2.AT-IH标准品(10ug);3.正常羊奶样(1∶5稀释,1ul);4.正常羊奶样(1∶5稀释,3ul);5.正常羊奶样(1∶6稀释,6.5ul);6.编号A-08转AT-III克隆后代(编号A-25)奶样(1∶5稀释,1ul);7.编号A-08转AT-III克隆后代(编号A-25)奶样(1∶5稀释,3ul);8.编号A-08转AT-III克隆后代(编号A-25)奶样(1∶5稀释,6.5ul);9.编号A-05转AT-III克隆后代(编号A-23)奶样(1∶5稀释,1ul);10.编号A-05转AT-III克隆后代(编号A-23)奶样(1∶5稀释,3ul);11.编号A-05转AT-III克隆后代(编号A-23)奶样(1∶5稀释,6.5ul);12.蛋白质分子量标准(Bio-rad,货号161-0373);箭头是指重组人的抗凝血酶III蛋白带。
人血浆中的抗凝血酶III是一个432个氨基酸的糖蛋白(成熟功能部分),分子量为58kDa(没有糖基化的成熟AT-III的分子量为49.0kDa)。本哺乳动物乳腺生物反应器生产的重组人的抗凝血酶III(AT-III)也是糖蛋白,分子量大约为60kDa(没有糖基化的重组人的抗凝血酶III(AT-III)的分子量为51.4kDa)。
图4中,奶样品经过离心脱脂处理,然后用于Elisa试验。采用US Biological公司(美国)的AT-III检测试剂。经过计算,编号A-23号羊奶中的AT-III蛋白为0.2-0.5ug/ml;编号A-25号羊奶中的AT-III蛋白为1-3mg/ml。
本发明包括下列步骤(1).选用哺乳动物的乳蛋白基因为转基因的调控区和表达框架,在乳蛋白基因的表达框架上建立一个唯一的酶切位点和乳蛋白分泌序列。
(2)从人肝细胞cDNA,用PCR扩增的方法,获得人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因(功能部分)的DNA片断(参见附图1的第4步)(3)然后将人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因和Enterokinase蛋白酶切序列基因连接在乳蛋白基因的表达框架上,转基因载体的末端再连接一个筛选基因。
(4).所构建的载体经DNA序列分析,确定人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因和乳蛋白基因的DNA序列,并与乳蛋白基因本身的表达和功能基因的氨基酸组成一致(参见重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因的氨基酸序列)。
(5).用电穿孔或脂质体诱导的方法将人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因表达载体转入动物的体细胞中。
(6).在培养基中对细胞株进行筛选,获得筛选后的阳性细胞株;一部分细胞冷冻保存,一部分细胞用于制备DNA。
(7).阳性细胞株的DNA,经PCR和Southern杂交分析,确定含有人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因的细胞株。
(8).转基因的细胞移入山羊的成熟去核卵母细胞的卵周隙内,然后使供核细胞和去核卵母细胞融合,激活;(9).将克隆胚胎移植到寄母羊的输卵管中,通过妊娠获得转基因克隆羊;(10).检测转人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因动物的乳汁中的重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的含量和活性。
(11).含有重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的乳汁中的人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的提纯(使用蛋白质亲和,浓缩,过柱等方法)。
(12).纯化的重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的动物试验和人体试验。
(13).重组人的抗凝血酶III蛋白在人体上的应用。
实施例1本实施例以崂山奶山羊(Capra hircus)为例,用人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因构建了以山羊酪蛋白基因(β-casein)为框架的转基因载体,并最终获得以人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因为功能基因的崂山奶山羊乳腺生物反应器。
具体操作程序如下功能基因的获得人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因是用人的肝细胞cDNA为PCR底物,然后通过PCR扩增的方法建立两端的连接酶切位点,PCR产物连接在pUC19上,在进行DNA序列分析;克隆的AT-III基因的DNA序列与已公开的AT-III蛋白基因的DNA序列相同。
具体方法是人的抗凝血酶III(AT-III)基因的制备是根据已公开的AT-III的DNA顺序(GeneBankD29832和X68793),设计PCR引物,获得1.45KB的AT-III基因的编码序列,PCR产物克隆到pUC19载体上,进行顺序分析。再将DNA顺序分析正确的AT-III pUC19质粒进行PCR克隆去除AT-III的分泌信号肽部分(碱基序列1-96),并在引物前加入1个唯一的酶切位点(Xho1),再通过PCR反应在AT-II基因前加一个Enterokinase蛋白质酶切序列。AT-III的基因片段连接到奶山羊β-酪蛋白基因DNA载体的表达框架上。
转基因载体的构建用绵羊的β-酪蛋白基因的一片断为探针,从崂山奶山羊的基因组文库中分离出β-酪蛋白基因,并用PCR方法去除β-酪蛋白基因的部分第二外显子与第七外显子及其之间的DNA序列,建立一个唯一的Not1酶酶切位点,再合成一段含有Xho1酶酶切位点的乳蛋白分泌序列连接在Not1位点。然后将人的抗凝血酶III(AT-III)基因连接在β-酪蛋白基因的表达框架上,筛选基因连接在β-酪蛋白基因的P(A)后面,操作步骤见附图1。
转化受体细胞从30至45天胎龄的崂山奶山羊胎儿中分离出胎儿成纤维细胞,分离的细胞培养在DMEM-F12(1∶1)并添加10%胎牛血清(FCS)和抗菌素的培养基中。用电穿孔(Bio-rad)或脂质体介导法将基因打靶载体转入山羊胎儿成纤维细胞中,(Gene Targeting-APractical Approach,2ndEdition,Oxford University Press 1999)然后在含有G418(600ug/ml)的培养基中筛选培养大约15-20天;细胞株再进行扩繁,一部分细胞冷冻保存.一部分用于制备DNA。
阳性细胞株的细胞核移植山羊经同期发情和超排处理,获得体内成熟的卵母细胞和寄母羊。阳性细胞在体外饥饿2-5天后,移入去核卵母细胞的卵周隙内,用电刺激的方法将供核细胞与去核卵母细胞融合,体外培养4小时后,用离子霉素(Ionomycin)激活5分钟,再在含有6-二甲基苯胺嘌呤(6-DMAP)的培养基中培养5小时。最后,克隆胚胎移入正常培养基中培养;第二天,移入寄母羊输卵管中。寄母羊怀孕,产出克隆母羊羔,Southern和PCR分析表明(参见附图2),克隆羊都含有转人的抗凝血酶III(AT-III)基因。到目前为止,两只克隆羊的后代母羊已产奶,奶中已检测出含有大量的人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白质,用于提纯和临床试验(正在进行中)。
DNA的制备,Southern分析将培养的细胞和少量克隆羊的组织转入DNA裂解液(含有蛋白酶K)中,在55℃水浴锅中过夜,然后加入两倍的纯酒精,混匀,离心;用70%的酒精洗DNA一次,自然干燥,然后加入适量的TRIS-EDTA溶液,待DNA全部溶解后,放入-20℃的冰箱中。用Pst1酶消化DNA溶液过夜,在0.8%的凝胶上电泳,然后将DNA转入纤维膜中,分别用P32标记探针进行杂交。获得DNA的Southern图片。
AT-III的含量和活性检测AT-III的含量检测是将转有人的抗凝血酶III(AT-III)基因的羊的奶,离心脱脂,用0.5MEDTA稀释溶解酪蛋白质颗粒,蛋白质凝胶跑胶(Invitrogen),然后用Coomassie蓝染色。与空白对照(羊奶)和阳性对照比较,获得奶中AT-III蛋白质的分子量和蛋白质含量。
AT-III的活性检测是用酶联(Elisa)的方法。用US Biological(美国)公司的检测人的抗凝血酶III蛋白试剂,进行检测。
重组人的抗凝血酶III(AT-III)的氨基酸序列 MKVLILACLV ALAIALEDDD DKHGSPVDIC TAKPRDIPMN PMCIYRSPEK KATEDEGSEQKIPEATNRRV WELSKANSRF ATTFYQHLAD SKNDNDNIFL SPLSISTAFA MTKLGACNDTLQQLMEVFKF DTISEKTSDQ IHFFFAKLNC RLYRKANKSS KLVSANRLFG DKSLTFNETYQDISELVYGA KLQPLDFKEN AEQSRAAINK WVSNKTEGRI TDVIPSEAIN ELTVLVLVNTIYFKGLWKSK FSPENTRKEL FYKADGESCS ASMMYQEGKF RYRRVAEGTQ VLELPFKGDDITMVLILPKP EKSLAKVEKE LTPEVLQEWL DELEEMMLVV HMPRFRIEDG FSLKEQLQDMGLVDLFSPEK SKLPGIVAEG RDDLYVSDAF HKAFLEVNEE GSEAAASTAV VIAGRSLNPNRVTFKANRPF LVFIREVPLN TIIFMGRVANPCVK
利用哺乳动物乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III(AT-III)的方法的DNA序列表<110>青岛森淼生物技术研究所<120>利用哺乳动物乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III(AT-III)的方法<130>
<140>
<141>
<160>11<170>Patent version 3.3<210>1<211>3866<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3866)<223>奶山羊β-酪蛋白的启动区和第1外显子和内含子和部分,基因打靶载体的5’同源臂<400>11 GGTACCTGAT GTCATCTTAA ATTGCTGGCT TTTTGATTTT CCATTGGACA 50AGCTTCTTTC TTTAGTATAT TGTTAAGGAT TTCCTTGATC AAGATTTTAC 100CTACTTTTCT GGTCCAATTG GTGAGAGACA GTCATAAGGA AATGCTGTGT 150TTATTGCACA ATATGTAAAG CATCTTCCTG AGAAAATAAA AGGGAAATGT 2005 TGAATGGGAA GGATATGCTT TCTTTTGTAT TCCTTTTCTG AGAAATCAGA 250CTTTTTCACC TGTGGCCTTG GCCACCAAAA GCTAACAAAT AAAGGCATAT 300GAAGTAGCCA AGGCCTTTTC TAGTTATATC TATGACACTG AGTTCATTTC 350ATCATTTATT TTCCTGACTT CCTCCTGGGT CCATATGAGC AGTCTTAGAA 400TGAATATTAG CTGAATAATC CAAATACATA GTAGATGTTG ATTTGGGTTT 45010 TCTAAGCAAT CCAAGACTTG TATGACAGTA AGATGTATTA CCATCCAACA 500CACATCTCAG CATGATATAA ATGCAAGGTA TATTGTGAAG AAAAATTTTT 550AATTATGTCA AAGTGCTTAC TTTAGAAGGT CATCTATCTG TCCCAAAGCT 600GTGAATATAT ATATTGAAGG TAATGAATAG ATGAAGCTAA CCTTGTAAAA 650ATGAGTAGTG TGAAATACAA CTACAATTAT GAACATCTGT CACTAAAGAG 70015 GCAAAGAAAC TTGAAGATTG CTTTTGCAAA TGGGCTCCTA TTAATAAAAA 750GTACTTTTGA GGTCTGGCTC AGACTCTATT GTAGTACTTA GGGTAAGACC 800
CTCCTCCTGT ATGGGCTTTC ATTTTCTTTC TTGCTTCCCT CATTTGCCCT 850TCCATGAATA CTAGCTGATA AACATTGACT ATAAAAGATA TGAGGCCAAA 900CTTGAGCTGT CCCATTTTAA TAAATCTGTA TAAATAATAT TTGTTCTACA 95020 AAAGTATTAT CTAAATAAAT GTTACTTTCT GTCTTAAAAT CCCTCAACAA 1000ATCCCCACTA TCTAGAGAAT AAGATTGACA TTCCCTGGAA TCACAGCATG 1050CTTTGTCTGC CATTATCTGA CCCCTTTCTC TTTCTCTCTT CTCACCTCCA 1100TCTACTCCTT TTTCCTTGCA ATTCATGACC CAGATTCACT GTTTGATTTG 1150GCTTGCATGT GTGTGTGCTG AGTTGCGTCT GACTGTTATC AACCCCATGA 120025 ATGATAGTCC ACCAGGCTCT ACTGTCCATG AAATTTTCCA GTCAAGAATA 1250CTGGAGTGGA TTGCATTTCC TACTCCATTT GATTAATTTA GTGACTTTTA 1300AATTTCTTTT TCCATATTCG GGAGCCTATT CTTCCTTTTT AGTCTATACT 1350CTCTTCACTC TTCAGGTCTA AGGTATCATC GTGTGCTTGT TAGCTTGTTA 1400CTTTCTCCAT TATAGCTTAA GCACTAACAA CTGTTCAGGT TGGCATGAAA 145030 TTGTGTTCTT TGTGTGGCCT GTATATTTCT GTTGTGTATT AGAATTTACC 1500CCAAGATCTC AAAGACCCAC TGAATACTAA AGAGACCTCA TTGTGGTTAC 1550AATAATTTGG GGACTGGGCC AAAACTTCCG TGCATCCCAG CCAAGATCTG 1600TAGCTACTGG ACAATTTCAT TTCCTTTATC AGATTGTGAG TTATTCCTGT 1650TGAAATGCTC CCCAGAATTT CTGGGGACAG AAAAATAGGA AGAATTCATT 170035 TCCTAATCAT GCAGATTTCT AGGAATTCAA ATCCACTATT GGTTTTATTT 1750CAAACCACAA AATTAGCATG CCATTAAATA CTATATATAA ACAGCCACTA 1800AATCAGATCA TTATCCATTC AGCTTCTCCT TCACTTCTTC TCCTCTACTT 1850TGGAAAAAAG GTAAGAATCT CAGATATAAT TTCAGTGTAT CTGCTACTCA 1900TCTTTATTTT GGACTAGGTT AAAATGTAGA AAGAACATAA TTGCTTAAAA 195040 TAGATCTTAA AAATAAGGGT GTTTAAGATA AGGTTTACAC TATTTTCAGC 2000AGATATGTTA AAAAATAGAA GTGACTATAA AGACTTGATA AAAATTATAG 2050TGACTGCAAA TGTTTTAGGA ATATAATAAG ATATAATAAC AGTGGTTGCT 2100ATTTTCTTTA GCACAAGACT AGTCAACAGG CTGTATTAAA AGATCTTTTC 2150TTGAATTAAA TATTTTCAAT TTGATTAAAC CTACCTCAGC CATAAAGGCA 220045 AGCACATTTC ATTTATACTA TGGGGATTTG AATAATTATT ACTGAAGAAG 2250CTCTACCAAC AAAAAGTTTA TAGAGCTATC ATATTTAGTC AAGAGATAAA 2300GAGGGTTGTT AGGATATATA TGCTATTTGA AAGGTATTTA TAAAAGAAGA 2350GTATATTTAT CAAAATTTCT CAGAACATCC AAATTTCAAG TTTATCATTT 2400ATCTTACAAT ATTTCAAAAA TATTAAAATA GATACATGAA ATACAGAAGT 245050 AAATTAAAGA GAAAGTATTT TACTTGGTAA AAAAATTCTA GGTTGGACAG 2500AGAGTGCCAG GAAACAAAAA CAATGAAAAA TGTGACCTGA CTGGAATTAT 2550AGCTCAAAGT ATAGTAGTAA GTAATGAAAT GGCTTAAAAA TTGGTATATA 2600AAATGCTAGT TATAAAATAA ACAAAATGCA ATAATATCCT CCCTACATGT 2650AATGAATTCT AGGTATTATG CTCTTTTTTG AAGTCTTGAC AATAAAAATT 2700
55 TTTTTAGAAG TTTATAGGCA TCTTGAATAA AGTGAAACAA ATTAAGAATT 2750AGTATCCATG AGAAAAATAT AGAACAATTT TCCTAATTTA GTTTGAAAAT 2800CTGGGATTGA AGATGTGTGT CAAGAGATGT TGGTGGCAAG AACATTTTTT 2850TTTCAAGAAC TTATAAAAAT GCAACAAAAC AAACCATTTA ATACATTTTG 2900GTCAAAATCA ATAATGTATT TTATTTTATG CTCCAAGGAG CATAAAATTG 295060 GGGACTGGGC AAGAGAAACT GACACCCTGG TAAATTACCA AGAGATAAGT 3000ACACAGTTCT ATGTAGAGAA AATAAGCATA GTGTATGATC TCTAAAATTA 3050TGTGAGACAA AGGAGAGATG ACATTAGGCA TGTGGGGATG AAGACTGAGT 3100AGAGAAGAAA CAATCTAATC AGTCCAAGAA AACATCTCGA TCAGTGGAAC 3150AAATAGAAGA AATGCTAAAA TGAAACAGAA GTCTTACTGG AAATAAAAGA 320065 TATGCATAAG ACAAAAATTC ATGAAAATCA CTTAGTTTAG CAGAGAAAAG 3250ATAAAAATAA AGTATGACCT TCTTCATATA CATTGTTTGA TCATATGCAC 3300CTCAATAAAA CTGAGTCTCC AACAGAAATG AAACATTAAT ATTTTGTTCA 3350CTGCTCTAAT CCCAGAATCT AAGCGATATC TGGCAATAAA AATAATAAAT 3400ATATATTTTT TAATAAATGA ATCAACCACT TAATTTTTCT GTAAATATCT 345070 GTAACTTCTC TTCTGTCTTT CCAAAAACAC TCATAAGTAC TGTGAATGAG 3500ATGAAAAAGA GTGAAGTAGG ATATAGGCTG TTAGCAGAAA ACATCTGAAT 3550GGCTGGCAGT GAAACATTAA CTTGAAATGT AAGATTAATG AGTAATAGTA 3600AATTTTAACC TTGGCCATAT GATAAAATGT TCATTAATAT TTTTCTAGAA 3650TACAGGGCTT TTTGTTTTTG CCATGAGGTT TGCAGGATCT TGGTTCCCTG 370075 ACCAGGGATC AAACCTGCAC TCCCCTGGAA GCATGGAGTC TTGGACATCT 3750GTATTATACA CTATCTTTGG TTCCTTTTAA AGGGAAGTAA TTTTACTTAA 3800ATAAGAAAAT AGATTGACAA GTAATACGCT GTTTCCTCAT CTTCCCATTC 3850ACAGGAATCG AGAGCC 3866<210>2<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(9)<223>Not1位点<400>21 GCGGCCGCC 9
<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(45)<223>蛋白质分泌序列<400>31 ATGAAGGTCC TCATCCTTGC CTGTCTGGTG GCTCTGGCCA TTGCA 45<210>4<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>Xho1位点<400>41 CTCGAG 6<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>Enterokinase蛋白酶切位点<400>5
1 GACGACGACG ACAAG15<210>6<211>1299<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1299)<223>人的抗凝血酶III(AT-III)基因序列(功能部分)<400>61 CACGGGAGCC CTGTGGACAT CTGCACAGCC AAGCCGCGGG ACATTCCCAT 50GAATCCCATG TGCATTTACC GCTCCCCGGA GAAGAAGGCA ACTGAGGATG 100AGGGCTCAGA ACAGAAGATC CCGGAGGCCA CCAACCGGCG TGTCTGGGAA 150CTGTCCAAGG CCAATTCCCG CTTTGCTACC ACTTTCTATC AGCACCTGGC 2005 AGATTCCAAG AATGACAATG ATAACATTTT CCTGTCACCC CTGAGTATCT 250CCACGGCTTT TGCTATGACC AAGCTTGGTG CCTGTAATGA CACCCTCCAG 300CAACTGATGG AGGTATTTAA GTTTGACACC ATATCTGAGA AAACATCTGA 350TCAGATCCAC TTCTTCTTTG CCAAACTGAA CTGCCGACTC TATCGAAAAG 400CCAACAAATC CTCCAAGTTA GTATCAGCCA ATCGCCTTTT TGGAGACAAA 45010 TCCCTTACCT TCAATGAGAC CTACCAGGAC ATCAGTGAGT TGGTATATGG 500AGCCAAGCTC CAGCCCCTGG ACTTCAAGGA AAATGCAGAG CAATCCAGAG 550CGGCCATCAA CAAATGGGTG TCCAATAAGA CCGAAGGCCG AATCACCGAT 600GTCATTCCCT CGGAAGCCAT CAATGAGCTC ACTGTTCTGG TGCTGGTTAA 650CACCATTTAC TTCAAGGGCC TGTGGAAGTC AAAGTTCAGC CCTGAGAACA 70015 CAAGGAAGGA ACTGTTCTAC AAGGCTGATG GAGAGTCGTG TTCAGCATCT 750ATGATGTACC AGGAAGGCAA GTTCCGTTAT CGGCGCGTGG CTGAAGGCAC 800CCAGGTGCTT GAGTTGCCCT TCAAAGGTGA TGACATCACC ATGGTCCTCA 850TCTTGCCCAA GCCTGAGAAG AGCCTGGCCA AGGTAGAGAA GGAACTCACC 900CCAGAGGTGC TGCAAGAGTG GCTGGATGAA TTGGAGGAGA TGATGCTGGT 95020 GGTCCACATG CCCCGCTTCC GCATTGAGGA CGGCTTCAGT TTGAAGGAGC 1000AGCTGCAAGA CATGGGCCTT GTCGATCTGT TCAGCCCTGA AAAGTCCAAA 1050CTCCCAGGTA TTGTTGCAGA AGGCCGAGAT GACCTCTATG TCTCAGATGC 1100ATTCCATAAG GCATTTCTTG AGGTAAATGA AGAAGGCAGT GAAGCAGCTG 1150
CAAGTACCGC TGTTGTGATT GCTGGCCGTT CGCTAAACCC CAACAGGGTG 120025 ACTTTCAAGG CCAACAGGCC TTTCCTGGTT TTTATAAGAG AAGTTCCTCT 1250GAACACTATT ATCTTCATGG GCAGAGTAGC CAACCCTTGT GTTAAGTAA 1299<210>7<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>连接序列<400>71 ACCCTAATAA AACCA15<210>8<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>Taq1位点<400>81 CTCGAC 6<210>9<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)
<223>Xho1位点<400>91 CTCGAG 6<210>10<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(9)<223>Not1位点<400>101 GCGGCCGCC 9<210>11<211>2233<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2233)<223>奶山羊β-酪蛋白的部分第7外显子至第9外显子基因序列。,基因打靶载体的3’同源臂<400>111 ATCCCTTCAC TGGGCCCATC CCTAACAGCC TCCCACAAAA CATCCTGCCT 50CTTACTCAAA CCCCTGTGGT GGTGCCGCCT TTCCTTCAGC CTGAAATAAT 100GGGAGTCCCC AAAGTGAAGG AGACTATGGT TCCTAAGCAC AAAGAAATGC 150CCTTCCCTAA ATATCCAGTT GAGCCCTTTA CTGAAAGCCA GAGCCTGACT 2005 CTCACTGATG TTGAAAAGCT GCACCTTCCT CTGCCTCTGG TCCAGTCTTG 250GATGCACCAG CCTCCCCAGC CTCTTTCTCC AACCGTCATG TTTCCTCCTC 300AGTCCGTGCT GTCCCTTTCT CAGCCCAAAG TTCTGCCTGT TCCCCAGAAA 350GTAGTGCCCC AGAGAGATAT GCCCATCCAG GCCTTTCTGC TGTACCAGGA 400
GCCTGTACTT GGTCCTGTCC GGGGACCCTT CCCTATTCTT GTAAGTCTAA 45010 ATTTACTAAC TGTGCTGTTT AACTTCTGAT GTTTGTATGA TATTTGAGTA 500ATTAAGAGCC CTACAAAAAA TCAATAATGA ATGGTTCCAA AATAAGCATA 550GCTGAGATTA ATGATTCTCA GCATTGGTTA TAAATAGAAT AAGCTGGAAA 600ACCTTCACCT CCCCTCCACC ACCAGATCTC AATGTCTAGG CTTACCCATG 650GAGATTCTGA TTAACTGTTC TTTCTATGTA GAAGAAACTT ATTGGGAAGA 70015 AATAATATAA TGGACTATGA TTTAATTGGT CTGTTGAGAA TTTAGATGAA 750GGGGATTAAG TTACAATAAA GCCAGAATTG AACTTGATAA TCTCACTTGG 800CTAAGAATAA CAAACCTAAG AAGGTTTGCT ATTTTCTACA ATTTTGAAGT 850TTTCCTTATG CACAATTATT TCACCACATG ACTCATTTCA CCTCTTGTTT 900TTGATATATG AGCATATGAG GGCAAAATAC TGAAGATGCT TATTTCAATA 95020 CTCAGGGAAA ATTTTCTTGC CAAAAGGCAA GAATTGTATA ATTCATTCAC 1000TTATTTTATT TTTTTAATTT TTAAGGTCTA AGAGGATTTC AAAGTGAATG 1050CCCCCTCCTC ACTTTTGGTA AGCTTTAGGA GATTGGAGGC AGACTGATCA 1100TTTTTATAGT TAATATCTTT TACATTTCAT CTTCCTGGAT AAGCCCCAAT 1150AGTAGCAATT TCTATCAGTA TACCAGCGTA AAGATTAGTT TTAAATATAT 120025 TTTCAGTGAT TGACTGTTAT TTACTGACCT GAAATTATGT ATCTGTTATA 1250TTTCAAATAA TGCAAAACTG TATATATATG GTGTTGACAG ATTTGATTGG 1300TTTTCTTTCA ATTGCCTATA TCCTTATTAT TGATTGTAAT CATTTATAGA 1350AAAAACAAAA TAATTTCTTA TACTTTTATG TAAACCTGTT AGAGCTTATT 1400TTAAAGATCA ACTGCATTCA CATTTCTAAT CTAGTCATTA TGAGCTTCAA 145030 TTGTTTTATC TCACTTAAAA TTTATATATT GTCTTTTAAT TCATGAGTCA 1500AAATACAATC TCACAGTCCA GATATGGGAC TTAAAAGGGG AATAGCATAT 1550AGTTTTGATA TTCTTAAAGA AATACATCTT TTTGTGATCA TGATTCAGCA 1600GACATTTTAA TAAAACAATT CCAAGTGAGC CGACACTTGG TCCTAGAGGA 1650ATTTTTATAA TCTTAAGGTA AGGCACAGCA TGGTGTTTTT GTAATAAGAT 170035 TTCTTTTATG AAAAAGTCAC ACCAAAATTG GAAATGGGGT GAGATGAAGA 1750GTTATAACAT ATAACTAAAT GGACATTTGT TCTCTATTCC ACAGAATTGA 1800CTGCGACTGG AAATATGGCA ACTTTTCAAT CCTTGCATCA TGCTACTAAG 1850ATAATTTTTA AATGAGTATA CATGGAACAA AAAATGAAAC TTTATTCCTT 1900TATTTATTTT ATGCTTTTTC ATCTTAATTT GAATTTGAGT CATAAACCAT 195040 ATACTTTCAA AATGTTAATT CAACATTAGC ATAAAAGTTC AATTTTAACT 2000TGGAAATATC ATGAACATAT CAAATTATGT ATAAAAATAA TTTCTGGAAT 2050TGTGATTATT ATTTCTTTAA GAATCTATTT CCTAACCAGT CATTTCAATA 2100AATTAACCCT TAGGCATATT TAAGTTTTCT TGTCTTTATT ATATTTTTAA 2150AAATGAAATT GGTCTCTTTA TTGTTAACTT AAATTTATCT TTGATGTTAA 2200AAATAGCTGT GGAAAATTAA AATTGGATAG AAT 2233
<210>12<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>Sma1位点<400>121 CCCGGG 6<210>11<211>1104<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1104)<223>Neo基因序列<400>111 ATCCGAACAA ACGACCCAAC ACCCGTGCGT TTTATTCTGT CTTTTTATTG 50CCGATCCCCT CAGAAGAACT CGTCAAGAAG GCGATAGAAG GCGATGCGCT 100GCGAATCGGG AGCGGCGATA CCGTAAAGCA CGAGGAAGCG GTCAGCCCAT 150TCGCCGCCAA GCTCTTCAGC AATATCACGG GTAGCCAACG CTATGTCCTG 2005 ATAGCGGTCC GCCACACCCA GCCGGCCACA GTCGATGAAT CCAGAAAAGC 250GGCCATTTTC CACCATGATA TTCGGCAAGC AGGCATCGCC ATGGGTCACG 300ACGAGATCCT CGCCGTCGGG CATGCGCGCC TTGAGCCTGG CGAACAGTTC 350GGCTGGCGCG AGCCCCTGAT GCTCTTCGTC CAGATCATCC TGATCGACAA 400GACCGGCTTC CATCCGAGTA CGTGCTCGCT CGATGCGATG TTTCGCTTGG 45010 TGGTCGAATG GGCAGGTAGC CGGATCAAGC GTATGCAGCC GCCGCATTGC 500ATCAGCCATG ATGGATACTT TCTCGGCAGG AGCAAGGTGA GATGACAGGA 550GATCCTGCCC CGGCACTTCG CCCAATAGCA GCCAGTCCCT TCCCGCTTCA 600GTGACAACGT CGAGCACAGC TGCGCAAGGA ACGCCCGTCG TGGCCAGCCA 650
CGATAGCCGC GCTGCCTCGT CCTGCAGTTC ATTCAGGGCA CCGGACAGGT 70015 CGGTCTTGAC AAAAAGAACC GGGCGCCCCT GCGCTGACAG CCGGAACACG 750GCGGCATCAG AGCAGCCGAT TGTCTGTTGT GCCCAGTCAT AGCCGAATAG 800CCTCTCCACC CAAGCGGCCG GAGAACCTGC GTGCAATCCA TCTTGTTCAA 850TGGCCGATCC CATATTGGCT GCAGGGTCGC TCGGTGTTCG AGGCCACACG 900CGTCACCTTA ATATGCGAAG TGGACCTGGG ACCGCGCCGC CCCGACTGCA 95020 TCTGCGTGTT CGAATTCGCC AATGAAACCA CACTGCTCGA CATTGGGTGG 1000AAACATTCCA GGCCTGGGTG GAGAGGCTTT TTGCTTCCTC TTGCAAAACC 1050ACACTGCTCG AGGAATTCAT AACTTCGTAT AATGTATGCT ATACGAAGTT 1100ATGC 110权利要求
1.一种利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III蛋白的方法,其特征是该方法包括下述步骤(1)选用哺乳动物的乳蛋白基因为转基因的调控区和表达框架,在乳蛋白基因的表达框架上建立唯一的酶切位点和乳蛋白分泌序列,然后将重组人的抗凝血酶III蛋白基因和肠激酶蛋白质酶切序列连接在乳蛋白基因的表达框架上,转基因载体的末端再连接一个筛选基因;(2)所构建的载体经DNA序列分析,确定人的抗凝血酶III蛋白基因与乳蛋白基因的DNA序列,并与乳蛋白基因本身的表达和功能基因的氨基酸组成一致;(3)用电穿孔或脂质体诱导的方法,将人的抗凝血酶III蛋白基因表达载体,转入体外培养的动物的体细胞中;(4)在培养基中对细胞株进行筛选,获得筛选后的阳性细胞株;一部分细胞冷冻保存,一部分细胞用于制备DNA;(5)阳性细胞株的DNA,经PCR和Southern杂交分析,确定含有人的抗凝血酶III蛋白基因的细胞株;(6)转基因的细胞株的细胞移入山羊成熟的去核卵母细胞的卵周隙内,然后使供核细胞和去核卵母细胞融合;(7)将克隆胚胎移植到寄母羊的输卵管中,经妊娠获得转基因克隆羊;(8)检测转人的抗凝血酶III蛋白基因的转基因动物的乳汁中的重组人的抗凝血酶III蛋白含量;(9)含有人的抗凝血酶III蛋白的转基因动物的乳汁中的重组人的抗凝血酶III蛋白的提纯;(10)纯化的重组人的抗凝血酶III蛋白的动物试验;(11)重组人的抗凝血酶III蛋白在人体上的应用。
2.按照权利要求1所述的利用乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法,其特征是所述的乳蛋白基因包括晡乳动物的乳球蛋白、α-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳浆蛋白基因或乳铁蛋白基因。
3.按照权利要求1所述的利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III蛋白的方法,其特征是将人的抗凝血酶III蛋白基因连接在乳蛋白基因的表达框架上,并转入哺乳动物的基因组内,然后在转基因动物的乳汁中获得特异高效表达。
4.按照权利要求1所述的利用乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法,其特征是所述的哺乳动物包括牛、绵羊和山羊、猪、兔、马。
5.一种利用乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法,生产含有重组人的抗凝血酶III蛋白的转基因动物,及其乳汁和制品。
6.按照权利要求5所述的转基因动物的乳汁进行提纯得到的重组人的抗凝血酶III蛋白,在治疗抗凝血酶III缺乏症中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III蛋白的方法。其包括选哺乳动物的乳蛋白基因为转基因的调控区和表达框架,在框架上建立一个唯一的酶切位点,再将人AT-III蛋白基因功能部分,乳蛋白分泌序列和肠激酶蛋白质酶切序列基因,连接在表达框架上,载体的末端再连接一个筛选基因;将表达载体转入体外培养的动物体细胞中;获得含有人的AT-III蛋白基因的细胞株;转基因细胞株移入山羊成熟的去核卵母细胞内,使供核细胞和去核卵母细胞融合;克隆胚胎移植到寄母羊的输卵管中,经妊娠获得转基因克隆羊;检测转基因动物乳汁中的人AT-III蛋白的含量和活性、提纯;经动物试验和人体试验;重组人AT-III蛋白在人体上的应用。
文档编号C12N15/06GK1944645SQ20061010204
公开日2007年4月11日 申请日期2006年10月17日 优先权日2006年10月17日
发明者袁三平, 邹贤刚, 鲜建 申请人:青岛森淼生物技术研究所
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