专利名称：：一种噬菌体基因工程抗体库基因组装的方法
技术领域：
：本发明涉及生物医学研究及临床应用领域，具体涉及一种噬菌体基因工程抗体库基因组装的方法。
背景技术：
：近年来基因工程技术已经得到快速的发展，一系列基因工程药物己经广泛应用于临床，其应用范围主要集中在肿瘤、艾滋病的基因工程药物和单克隆抗体。目前，全球研制中的生物技术药物已经超过2200种，其中1700余种己经进入临床试验阶段。美国有300多种生物药物处于后期临床实验阶段。2001年FDA批准了8种生物技术药物和疫苗及3种药物新的适应症；2002年FDA共批准了20个新生物技术药物和15个生物技术药物的新适应症。2003年FDA批准了35个新药中就包括14个新生物制剂。但是针对真菌的单链抗体的研发，目前还未见报道。由于人源单抗尚存在制备困难、杂交瘤细胞不稳定、产量低及亲和力弱等问题，目前常用的单抗绝大多数为鼠源抗体，鼠源单抗在人体重复使用可产生人抗鼠抗体，Fc段的存在又可使其与体内具有Fc受体的非特异组织和细胞结合等缺点，因此限制了其在临床上的应用。随着基因工程抗体技术日益成熟，利用分子克隆技术制备的基因工程小分子抗体为疾病的免疫诊断和免疫治疗提供了新的思路。其中，小分子单链抗体(single-chainFvFragment，scFv)因其分子小，实体组织穿透力强，血浆半衰期短，又能保持完整抗体的亲和性和特异性，而倍受重视。scFv结构非常简单，由抗体重链可变区和轻链可变区通过一个弹性linker连接而成，是具有完整抗原结合位点的最小抗体片段。能在细菌中表达，易于基因操作和基因工程大量生产，并可用基因工程方法构建与其他效应分子连接的抗肿瘤融合蛋白。因此，scFv成为将药物、毒素、放射性毒素导向真菌的很有价值的分子，在真菌治疗中有很大的临床应用潜力。通常噬菌体抗体库技术是建立在噬菌体表面呈现技术和抗体DNA重组技术上，用PCR扩增抗体的全套可变区基因，特别是在抗体可变区的轻链和重链的连接上，采用AmershamBioscieences公司设计的PCR连接方法，已经实现了试剂盒的产品化，但是AmershamBioscieences公司的试剂盒主要是针对小鼠抗体可变区设计的，尽管scFv已经去除了具有较高抗原性的抗体恒定区部位，但是由于存在种属的差异，因此不可避免还是存在一定的免疫原性。这就大大的限制了其在人源性单链抗体研究中的应用。经典的噬菌体基因工程抗体库基因组装的原理是以小鼠抗体基因序列为基础，设计相应引物，通过PCR技术为平台完成抗体可变区基因的扩增和连接，最终获得完整的单链抗体基因文库。其过程分为三个阶段既通过RT-PCR分别扩增轻链、重链可变区基因；轻链和重链可变区的PCR连接；利用PCR填加酶切位点。经典的噬菌体基因工程抗体库基因组装的方法是首先利用以设计好的小鼠抗体重链和轻链可变区兼并引物通过RT-PCR获得抗体可变区基因后，用SOE-PCR获得全长的scFv片段，最后在通过PCR加上酶切位点，PCR产物经酶切后直接连接到表达载体中。经典的噬菌体基因工程抗体库基因组装的缺点是由于SOE-PCR方法的偶然性较大，在连接过程中除了出现5，-VH-Linker-VL(VK)-3'约800bp的片段外，还可能会出现5，-VH-VL(VK)-3，的连接片段，因此会干扰目的片段的获得。又由于PCR本身也会受到Taq酶扩增效率，Mg2+浓度等多种条件的限制，因此现有技术存在的问题是实验的稳定性较差、效率低、存在较大的突变几率，影响基因的保真性。
发明内容本发明要提供一种噬菌体基因工程抗体库基因组装的方法，以克服现有技术存在的稳定性较差，效率低，存在较大的突变几率和低保真性，以及不能直接用于人源性单链抗体研究的问题。为克服现有技术存在的问题，本发明所采用的技术方案是一种噬菌体基因工程抗体库基因组装的方法是同时利用PCR和酶切连接两种方法，在利用RT-PCR获得人源性抗体重链和轻链可变区基因后，通过引物两端预先设计的酶切位点实现抗体重链可变区、Linker和抗体轻链可变区的拼接。上述方案中根据人类抗体可变区的特点设计了6条5'端重链可变区引物和7条3'端轻链可变区引物，6条5'端轻链可变区引物和13条3'端轻链可变区引物，共计32条引物，同时设计并合成一对包含有Xhol和Apal两个酶切位点的Linker(也就是在抗体可变区的轻链和重链与Linker的连接部位分别引入了Xhol和Apal两个酶切位点)；采用酶切连接的方法实现抗体重链可变区、Linker和抗体轻链可变区的拼接，所述各引物如下重链可变区上游引物随机保护序列一Sfil-重链可变区下游引物:轻链可变区上游引物:轻链可变区下游引物:Linker:随机保护序列一XhoI-随机保护序列一ApaI-随机保护序列""NotI-Xhol——(G4S)3——-抗体重链可变区序列一抗体重链可变区序列-抗体轻链可变区序列-抗体轻链可变区序列Apal在实验中还可以利用同时具有Sfil、Xhol、Apal和Notl酶切位点的pGEM-llZF(+)载体作为克隆载体保存已连接的scFv片段。有利于实验的重复，保证产物的稳定性。与现有技术相比，本发明的优点是一、稳定性好，突变几率小，有利于提高基因的保真性在构建基因组工程抗体库的过程中，由于既要保证抗体可变区基因的保真性，又要提高scFv的连接效率，所以对于实验的稳定性要求很高，本发明正是在兼顾这两者的基础上提高了实验的可行性，其对稳定性的提高包括以下几点1、Xhol和Apal两个酶切位点在人类的抗体可变区基因上很少存在，在抗体可变区的轻链和重链的引物上设计这两个酶切位点，不会破坏抗体可变区基因的完整性。2、在经典的(G4S)3Linker的基础上，引入Xhol和Apal两个酶切位点后，会在Linker的两侧分别加入亮氨酸、谷氨酸和甘氨酸、脯氨酸，尽管四个氨基酸的加入使Linker的长度有所增加，但是由于这四种氨基酸均不存在较大的支链，因此对于Linker的柔韧性不存在明显的影响，也不能影响轻、重链的正确折叠、相互作用以及轻重链杂合体的稳定性和识别抗原的能力。3、是应用了pGEM-llzf(+)克隆载体上现成的sfil、Sall、Xhol、Notl酶切位点，避免了连接过程中5'-VH-VL(VK)-3'的连接片段片段的出现，进而保证了实验结果的可靠性，防止无效片段的产生。4、在本方法中由于仅需要一次PCR反应和3次酶切连接反应，因此不但有效的扩增了目的抗体可变区基因片段，也有力的回避了多次PCR反应所引起的基因突变，同时商业化的pGEM-llzf(+)克隆载体的应用也大大简便了实验操作，保证了实验的可重复性。二、适用范围广利用当前最新的基因工程技术，通过钓取患者血液中B淋巴细胞免疫抗体可变区基因构建人源性单链抗体库，不但可以用于各种外源感染性疾病的单链抗体研究，也可以用于肿瘤等疾病的研究和治疗。三、实验成本低廉，经济性强。由于利用了基因工程技术扩增人抗体可变区基因，实验所需的引物、内切酶、载体等都可以实现反复利用，同时也避免了单克隆抗体制备中需要大量实验动物的情况，可大大降低研发成本。具体实施例方式下面将通过实施例对本发明作详细的说明。本发明的方法原理:是同时利用PCR和酶切连接两种方法，在利用RT-PCR获得人源性抗体重链和轻链可变区基因后，通过引物两端预先设计的酶切位点实现抗体重链可变区、Linker和抗体轻链可变区的拼接。具体说本发明是根据人类抗体可变区的特点设计了6条5'端重链可变区引物和7条3'端轻链可变区引物，6条5'端轻链可变区引物和13条3'端轻链可变区引物，共计32条引物，同时设计并合成一对包含有Xhol和Apal两个酶切位点的Linker(也就是在抗体可变区的轻链和重链与Linker的连接部位分别引入了Xhol和Apal两个酶切位点)；釆用酶切连接的方法实现抗体重链可变区、Linker和抗体轻链可变区的拼接，所述各引物如下-重链可变区上游引物随机保护序列一SfiI——抗体重链可变区序列重链可变区下游引物随机保护序列一XhoI——抗体重链可变区序列轻链可变区上游引物随机保护序列一Apal—一抗体轻链可变区序列轻链可变区下游引物随机保护序列一NotI——抗体轻链可变区序列Linker:Xhol-(G4S)3-Apal在本发明的实验中还可以利用同时具有SfiI、Xhol、ApaI和NotI酶切位点的pGEM-llZF(+)载体作为克隆载体保存已连接的scFv片段。有利于实验的重复，保证产物的稳定性。具体的操作步骤是1、引物设计引物设计参照Daniele方法[3](略有改动)设计重链Vh段引物，轻链Vl和Vk段引物。重链段引物5'端引入Sfil酶切位点，3'端引入XhoI酶切位点。轻链段引物5'端引入Apal酶切位点，3'端引入NotI酶切位点。轻链和重链的保护碱基均为12个，且序列相同。Link链5，端引入Xhol酶切位点，3，端引入ApaI酶切位点。2、全血总RNA提取取念珠菌病恢复期患者外周血45例，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用试剂盒提取淋巴细胞总RNA。RNA变性电泳鉴定RNA的完整性，核酸蛋白分析仪测定含量。液氮保存备用。3、RT-PCR扩增VH、Vl和Vk魅按逆转录试剂盒说明，以总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链，以第一链为模板，PCR扩增VH、Vl和Vk魅。PCR反应以反转录合成cDNA第一链为模板分别扩增VH、Vl和Vk基因，将Vh、VL和VK基因的3'端引物分别混合后与5'段各引物分别进行扩增。反应条件为94。C预变性5min，94。C变性1min，55"退火1min，72。C延伸1min，35个循环后72"C延伸8min。反应体系在的反应体系中含有cDNA模板lpl，10xPCRbuffer2.0^1，dNTP0.2mmol/L，Mg2+2.5mmol/L，上下游引物各10pmol/L，Taq酶1.0U。2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DL2000Marker作对照。观察370bp处有条带出现，并切胶回收。回收产物克隆到T载体中，并测序鉴定。4、重链、Linker链与轻链的连接将重链基因和轻链基因分别从T载体上用SfiI、XhoI和ApaI、Notl双酶切下来，经电泳回收后与Linker链分别与载体分步连接，转化。4.1重链基因连入pGEM-llzf(+)载体将重链基因从T载体上用SfiI，Xhol双酶切下来，连入经用同样酶切过的pegm-llz傲体中，转化大肠杆菌，提取质粒并经过双酶切鉴定正确。4.2轻链基因连入将轻链基因从T载体上用ApaI和NotI双酶切后，连入经用同样酶切过的pGEM-llZF(+)载体中，转化大肠杆菌，提取质粒并经过双酶切鉴定正确。4.3Linker链的接入Linker链由合成的两条寡核苷酸退火而成，其两端为已经切好的ApaI和XhoI位点。合成的Linker链连接进第二步所得的质粒中，获得完整的抗体基因。通过克隆载体保存所有连接好的克隆，可以为后期的研究奠定基础。为更清楚地说明本发明与经典的噬菌体基因工程抗体库构建的区别，请参看下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1.一种噬菌体基因工程抗体库基因组装的方法是同时利用PCR和酶切连接两种方法，在利用RT-PCR获得人源性抗体重链和轻链可变区基因后，通过引物两端预先设计的酶切位点实现抗体重链可变区、Linker和抗体轻链可变区的拼接。2、如权利要求1所述的一种噬菌体基因工程抗体库基因组装的方法，其特征在于是根据人类抗体可变区的特点设计了6条5'端重链可变区引物和7条3'端轻链可变区引物，6条5'端轻链可变区引物和13条3'端轻链可变区引物，共计32条引物，同时设计并合成一对包含有Xhol和Apal两个酶切位点的Linker(也就是在抗体可变区的轻链和重链与Linker的连接部位分别引入了Xhol和Apal两个酶切位点)；采用酶切连接的方法实现抗体重链可变区、Linker和抗体轻链可变区的拼接，所述各引物如下重链可变区上游引物随机保护序列一SfiI-——抗体重链可变区序列重链可变区下游引物随机保护序列一XhoI——抗体重链可变区序列轻链可变区上游引物随机保护序列一ApaI——抗体轻链可变区序列轻链可变区下游引物随机保护序列""NotI——抗体轻链可变区序列Linker:Xhol——(G4S)3——Apal3、如权利要求1或2所述的一种噬菌体基因工程抗体库基因组装的方法，其特征在于利用同时具有SfiI、Xhol、ApaI和NotI酶切位点的pGEM-llZF(+)载体作为克隆载体保存已连接的scFv片段。全文摘要本发明涉及生物医学研究及临床应用领域，具体涉及一种噬菌体基因工程抗体库基因组装的方法。本发明要提供一种噬菌体基因工程抗体库基因组装的方法，以克服现有技术存在的稳定性较差，效率低，存在较大的突变几率和低保真性，以及不能直接用于人源性单链抗体研究的问题。为克服现有技术存在的问题，本发明所采用的技术方案是一种噬菌体基因工程抗体库基因组装的方法，是同时利用PCR和酶切连接两种方法，在利用RT-PCR获得人源性抗体重链和轻链可变区基因后，通过引物两端预先设计的酶切位点实现抗体重链可变区、Linker和抗体轻链可变区的拼接。文档编号C12N15/09GK101210241SQ20061010529公开日2008年7月2日申请日期2006年12月27日优先权日2006年12月27日发明者何文亮,杜孟刚,雪步,赵育英申请人:陕西超英生物科技有限公司