专利名称：一种培育抗逆转基因烟草的方法
技术领域：
本发明涉及一种培育抗逆转基因烟草的方法。
背景技术：
植物生长发育过程中的任何不适环境因素均可称为环境胁迫，一般分为生物胁迫(如病虫害)与非生物胁迫。后者包括水分(干旱与涝灾)，温度，盐碱，光照，营养等多方面的胁迫。
环境胁迫给农业生产带来的危害是世界性的，非生物胁迫，特别是干旱造成的危害尤重(Boyer JS.1982.Plant productivity and environment.Science 218443-448)，可使农作物减产50％至80％。正因为如此，很多科学家都将植物非生物胁迫生物学作为研究重点，以期加速发现植物耐非生物胁迫的基因和分子机理，为基因工程改良农作物耐逆性抢占制高点。
我国是农业大国，非生物胁迫给我国农业带来的危害非常严重，其中干旱与土壤盐碱化是限制我国农业可持续性发展的主要因素。我国可耕农地的50％受干旱影响，即使在降水较多的华中和华南地区，由于雨量分布不均，这些地区的水稻几乎每年在扬花的关键时期都受干旱的影响，直接影响产量，情节严重时甚至颗粒无收。我国北方大部分地区的降雨量偏低，加重土壤的盐碱化，严重影响农业生产。
研究非生物胁迫生物学和分离克隆耐逆基因非常重要，全世界的植物生物学家也为此做了大量的工作，并取得很多新进展，特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展。专利申请号为200410000682.2的中国发明专利申请公开了一个拟南芥转录因子AtHD/START1，它与拟南芥的耐盐性相关。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育抗逆转基因烟草的方法。
本发明所提供的培育抗逆转基因烟草的方法，是将AtHD/START1基因通过植物表达载体导入烟草中，筛选得到抗逆性提高的烟草；所述AtHD/START1是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与(a)相同活性活性的由(a)衍生的蛋白质。
所述AtHD/START1优选为由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质。
其中，序列表中的序列2由722个氨基酸残基组成，自氨基末端第31位至第88位氨基酸残基为同源盒(homeo-box)结构域，自氨基末端第236位至第457位氨基酸残基为START结构域，在同源盒结构域和START结构域之间是亮氨酸拉链(自氨基末端第89位至第235位氨基酸残基)，可能和二聚化有关，同源盒结构域主要是和DNA结合。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的上述同源盒结构域和START结构域之外进行取代和/或缺失和/或添加。
所述AtHD/START1基因的编码序列优选为序列表中的序列1。
所述植物表达载体可为现有的任何植物表达载体。所述植物表达载体中启动外源基因转录的启动子优选为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子或玄参花叶病毒(FMV)35S启动子或水稻肌动蛋白基因(Actin1)启动子。如，所述AtHD/START1基因可通过植物表达载体pCB2004C导入烟草中，所述AtHD/START1基因通过植物表达载体pCB2006导入烟草中。
所述抗逆性可为抗盐性和/或抗旱性和/或抗氧化性。
所述AtHD/START1基因可用现有的方法构建到现有的植物表达载体中，可在其转录起始核苷酸前加上包括组成型启动子、增强启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异性启动子在内的任何一种启动子。为了便于对转所述AtHD/START1基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(Bar基因、GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。携带有所述AtHD/START1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化烟草细胞或组织，并将转化的烟草经组织培育成植株，获得抗逆性提高的烟草植株。
实验证明，转AtHD/START1基因烟草株系(转化体)的耐旱性和耐盐性都明显高于对照(未转基因烟草)株系。转AtHD/START1基因株系的脯氨酸含量、SOD酶活性、总糖含量都明显高于对照。脯氨酸含量和总糖含量的提高，使得植物体可以更好的调节渗透势以保护细胞不受到干旱的胁迫，SOD是1969年McCord和Fridovich首次在牛红细胞中发现的。它是防御超氧阴离子自由基对细胞伤害的抗氧化酶，对于清除过氧化自由基的毒性更有着不可忽视的作用，转化体中SOD酶活的升高表明，体内对细胞造成伤害的自由基增多，从而诱导了更多的SOD酶来清除自由基的这种伤害，转化体中SOD酶的活性升高强度明显大于对照，这也说明转化体有更高的清除这种有害自由基的能力，从而保护自身的细胞少受伤害，使植物在一定程度上忍耐、减缓或抵御逆境胁迫伤害。对于这几项指标，随着干旱胁迫时间的延长，转化体和对照之间的差异也越来越明显，大量的研究认为，植物在逆境下，通过代谢反应来阻止、降低或修复由逆境造成的损伤，从而保证正常的生理活动。在植物可耐受的范围内，逆境所造成的伤害是可逆的，当条件合适时，可以恢复正常，但如果超出植物自身修复的能力，则损伤将变成为不可逆的过程，植物会受到严重伤害直至死亡。脯氨酸是植物蛋白质的重要组成部分，当植物受到干旱、盐碱等胁迫时，可作为植物的渗透剂，参与植物的渗透调节作用。另外，脯氨酸是一种高亲水性物质，可防止细胞脱水，因此当植物受到水分胁迫时体内的脯氨酸会积累。植物体积累高浓度的脯氨酸，将使植物更加耐盐。从对转基因烟草的耐盐性实验中也可看出，在盐胁迫条件下，转化体基本可以正常生长，而对照的生长则受到非常明显的抑制，这也和转化体内积累了更多的脯氨酸有关。
通过气孔的蒸腾作用失去水分是干旱耐受的一个重要决定因素，转AtHD/START1基因株系叶片下表皮的气孔密度和对照相比，降低了50％，气孔密度的大幅度降低，使得植物通过蒸腾作用从叶片失去水分的效率降低，这可以大大提高植物对水分的保持能力。测定它们的光合作用指标，转AtHD/START1基因株系的光合速率、水分利用率都大于对照株系，而蒸腾效率则低于对照株系，部分株系的这些差异都达到了显著水平。根系的生长情况是干旱耐受的另一个重要决定因素，转AtHD/START1基因株系根的构型同样发生了明显变化主根变长、侧根数增加、根的生物学重量增加，说明突变体的根系更加发达，这样可以使植株在受到干旱胁迫时能持续不断的从土壤吸水。
此外，转AtHD/START1基因烟草还有一个很重要的特性，即体内的K+含量比对照明显增加，研究表明，烟草是嗜钾作物，烟叶K+含量的增高对提高烟叶的品质有着极为重要的作用，此特性在生产中具有重要的经济价值。
图1为转化体和对照PCR结果图2为southern blot图谱图3a为喷除草剂一周的转化体和对照照片图3b为转化体和对照的RT-PCR结果图4a为干旱胁迫10天的转化体和对照照片图4b为干旱胁迫20天的转化体和对照照片图4c为干旱胁迫20天，复水7天的转化体和对照照片图4d为干旱胁迫20天，复水16天的转化体和对照照片图5为干旱胁迫不同时间转化体和对照中SOD酶活性统计结果图6为干旱胁迫不同时间转化体和对照中脯氨酸含量统计结果图7为干旱胁迫不同时间转化体和对照中总糖含量统计结果图8为干旱胁迫不同时间转化体和对照中钾离子含量统计结果图9a为生长60天的转化体和对照植株照片图9b为生长110天的转化体和对照植株照片图10a为生长50天的转化体和对照照片图10b为移栽后不同时间的转化体和对照每株叶片数统计结果图11a为移栽不同时间转化体和对照每株最大叶片长的统计结果图11b为移栽不同时间转化体和对照每株最大叶片宽的统计结果图12为转化体和对照果荚数统计结果图13为转化体和对照叶片下表皮气孔比较照片图14为转化体和对照气孔密度比较的统计结果图15为转化体和对照表皮细胞密度比较的统计结果图16为转化体和对照气孔指数比较的统计结果图17为转化体和对照气孔大小比较的统计结果图18为转化体和对照株叶片厚度比较照片图19为对照和转化体栅栏细胞大小比较的统计结果图20为转化体和对照光合速率比较的统计结果图21为转化体和对照蒸腾速率比较的统计结果图22为转化体和对照水分利用率比较的统计结果图23为转化体和对照气孔导度比较的统计结果图24为NaCl处理后转化体和对照的生长情况照片图25为NaCl处理后转化体和对照的的叶片数统计结果图26为NaCl处理后转化体和对照的根重统计结果图27为NaCl处理后转化体和对照的根冠比统计结果图28为NaCl处理后的转化体和对照的光合速率统计结果的比较图29为NaCl处理后的转化体和对照的蒸腾速率统计结果的比较图30为NaCl处理后的转化体和对照水分利用率统计结果的比较图31为NaCl处理后的转化体和对照气孔导度统计结果的比较图32为含不同浓度NaCl的培养皿上转化体和对照的萌发比较照片图33a为100mM NaCl培养板上萌发2周的转化体和对照根长比较统计结果图33b为200mM NaCl培养板上萌发2周的转化体和对照根长比较统计结果图34a为pCB2006/AtHD/START1的BamHI酶切鉴定图谱图34b为pCB2006/AtHD/START1的EcoRI酶切鉴定图谱图34c为pCB2004C/AtHD/START1的BamHI酶切鉴定图谱图34d为pCBpCB2004C/AtHD/START1的HindIII和EcoRI双酶切鉴定图谱图35为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1/pCB2004C/AtHD/START1和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1/pCB2006/AtHD/START1的菌落PCR鉴定图谱具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、转AtHD/START1基因烟草的培育一、转基因表达载体的构建1、AtHD/START1的cDNA基因的获得利用SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase试剂盒(Invitrogen公司，Cat.No.18080-093)从Columbia生态型拟南芥(可以从拟南芥生物资源中心ArabidopsisBiological Resource Center(ABRC)购得)中RT-PCR扩增得到核苷酸序列是序列表中序列1的AtHD/START1的cDNA基因，具体过程如下总量RNA的抽提采用Trizol试(INVITROGEN)，使用1微克总量RNA作为反转录反应的模板，d(T)25作为反转录的引物，每个反转录反应使用200单位的SUPERSCRIPT II反转录酶(INVITROGEN)并按照反转录酶产品使用指南进行。RT-PCR所用引物序列按照AtHD/START1基因的序列设计，其5’末端引物是5’atgagtttcgtcgtcggcgt3’，3’末端引物是5’tcaagctgtagttgaagctgt3’，PCR反应使用1微升反转录反应液为模板，其它完全按照Takara公司的ExTaq酶的使用指南进行，淬火温度为56摄氏度，延伸时间为100秒，30个循环。PCR扩增产物进行琼脂糖电泳分离，回收并克隆到pMD 18-T Vector载体上，进行测序分析，测序结果表明，该PCR扩增产物具有序列表中序列1的核苷酸序列，是AtHD/START1的cDNA基因。
2、转基因表达载体pCB2006/AtHD/START1和pCB2004C/AtHD/START1的构建(1)pCB2004C的构建pCB2004C按照如下方法构建将pCAMBIA3301(CAMBIA)用BstXI和SmaI消化，在pCAMBIA3301的BstXI和SmaI识别位点间插入由依次串联的BstXI，SstI，DraIII(a)，AscI，AvrII，SwaI，DraIII(b)，和SmaI识别序列组成的多克隆位点片段，得到重组载体pCB2002。其中SmaI识别位点是下述两个合成的多聚核苷酸5’AGCTCACGGGGTGGCGCGCCTAGGATTTAAATCACAAAGTGCCC3’和5’GGGCACTTTGTGATTTAAATCCTAGGCGCGCCACCCCGTGAGCTCATG3’在66℃退火60秒得到的。
将Gateway Conversion A试剂盒(Invitrogen，Gateway vector Conversion systemCat.No.11828-019)中的Conversion A通过平末端连接插入到pCB2002的SmaI和PmII识别位点之间就得到基础载体pCB2003。
以pCAMBIA3301(CAMBIA)为模板，用引物5’GGGCACGGGGTGGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAA3’和5’GGGCACTTTGTGATTGTAAATAGTAATTGT3’PCR扩增烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子，将得到的烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子PCR产物用DraIII消化后，直接和用DraIII线性化后的pCB2003连接，得到质粒pCB2004。
将pCB2004使用BamHI消化后去掉氯霉素抗性基因，然后环化，得到pCB2004A。然后使用PCR引物5’-cctttggtcttctgagactgt-3’和5’-ttgagtcgtaagagactctg-3’以pSK015(Addgene Inc.质粒代号11570)为模板将4×35S增强子扩增出来，将该4×35S增强子片段使用NcoI和SacI消化后克隆至pCB2004A的NcoI和SacI之间，得到pCB2004C。
(2)pCB2006的构建以水稻的基因组DNA为模板，使用PCR引物5’-GGGCACGGGGTGTAGCTAGCATACTCGAGGTCA-3’和5’-GGGCACGTTTTGAGTAGATATCCTCGGCGTCAG-3’，PCR扩增水稻Actin 1启动子，PCR产物经DraIII消化后，与用DraIII线性化的pCB2003在T4DNA连接酶的作用下环化得到pCB2006。
(3)pCB2006/AtHD/START1和pCB2004C/AtHD/START1的构建将步骤1中得到的AtHD/START1基因的cDNA基因利用GatewayRBP ClonaseTMII EnzymeMix试剂盒(Invitrogen，Cat.No.11789-020)通过GatewayTMCloning Technology重组克隆到pCB2004C或pCB2006的attR1和attR2之间，得到含有AtHD/START1基因的重组表达载体pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1。利用BamHI或EcoRI单酶切pCB2006/AtHD/START1进行结构鉴定，结果如图34a和34b所示，BamHI单酶切pCB2006/AtHD/START1得到大小为1988bp(包括172bp Actin 1启动子部分和1812bpAtHD/START1cDNA 5’端)片段，9757bp的pCB2006/AtHD/START1两个BamHI位点间的载体骨架部分；EcoRI单酶切pCB2006/AtHD/START1得到大小为2003bp的载体pCB2006/AtHD/START1两个EcoRI位点的部分(包括878bp Actin 1启动子部分和1125bp AtHD/START1cDNA 5’端片段)，和pCB2006/AtHD/START1两个EcoRI位点之间的9742bp载体骨架部分。说明AtHD/START1基因的cDNA基因插入到了pCB2006的attR1和attR2之间。利用BamHI单酶切pCB2004C/AtHD/START1、HindIII和EcoRI双酶切pCB2004C/AtHD/START1进行结构鉴定，结果如图34c和34d所示，BamHI单酶切pCB2004C/AtHD/START1得到大小为3764bp的片段(包括4x35S增强子、35S启动子和AtHD/START1cDNA的一部分)和8689bp的片段(pCB2004C/AtHD/START1两个BamHI位点之间载体骨架部分)；HindIII和EcoRI双酶切pCB2004C/AtHD/START1得到大小为666bp的片段(AtHD/START1cDNA上EcoRI和HindIII位点之间的部分)，和11817bp的片段(pCB2004C/AtHD/START1EcoRI和HindIII位点之间载体骨架部分)；说明AtHD/START1基因的cDNA基因插入到了pCB2004C的attR1和attR2之间。
图34a中，泳道1、2、3为BamHI单酶切pCB2006/AtHD/START1的结果，M为FermentasDNA ladder(250bp-10Kb)；图34b中，泳道1、2、3为EcoRI单酶切pCB2006/AtHD/START1的结果，M为Fermentas DNA ladder(250bp-10Kb)；图34c中，泳道1、2、3为BamHI单酶切pCB2004C/AtHD/START1的结果，M为Fermentas DNA ladder(250bp-10Kb)；图34d中，泳道1、2、3为HindIII和EcoRI双酶切pCB2004C/AtHD/START1的结果，M为FermentasDNA ladder(250bp-10Kb)。
二、农杆菌介导的遗传转化1、含有pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株的制备将-70℃保存的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1涂布在LB(含庆大霉素50ug/ml)28℃培养活化。然后取4-5个单菌落接种于3mlLB液体培养基(含庆大霉素50ug/ml)过夜培养。将过夜培养的菌液按1∶100的体积比接种于500ml的LB液体培养基(含庆大霉素50ug/ml)，250rpm，28℃，培养至OD600＝1.0左右。5000rmp离心收集菌体，然后用预冷的等体积的无菌去离子水重悬，重复七次，最终将菌体重悬于0.5ml的10％甘油中。取10ng的pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1质粒分别与50ul根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1感受态细胞(根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58C1感受态细胞按照英文影印版《拟南芥实验手册》.Detlef Weigel andJane Glazebrook.化学工业出版社.2004年3月第1版，第1次印刷的方法制备)混合均匀后，加入到预冷的电极杯中(0.2mm，Biorad公司)。使用Agr电击程序(所购买的仪器自带的电击程序，在仪器的说明书上，说明书为MicroPulserTMElectroporationApparatus Operation Instruction and Applications Guide，Catalog Number165-2100)。电击后加入SOC培养基复苏4小时后，涂布含庆大霉素50ug/ml和卡那霉素50ug/ml的LB培养基，28℃，培养两天。取单菌落扩增AtHD/START1基因中的片段(引物序列为5’-GCAACA TGA GAG AGC AGA TAA TA-3’和5’-TCA AGA AGC AAA TCT TTC ACA CAT T-3’)进行菌落PCR验证。PCR得到1091bp的AtHD/START1基因片段条带的pCB2004C/AtHD/START1转化的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1是含有pCB2004C/AtHD/START1的菌株，命名为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1/pCB2004C/AtHD/START1，PCR得到1091bp的AtHD/START1基因片段条带的pCB2006/AtHD/START1转化的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1是含有pCB2006/AtHD/START1的菌株，命名为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1/pCB2006/AtHD/START1。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1/pCB2004C/AtHD/START1和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1/pCB2006/AtHD/START1的菌落PCR鉴定结果如图35所示，泳道1-9是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1/pCB2004C/AtHD/START1的PCR结果，泳道10-16是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1/pCB2006AtHD/START1的PCR结果，均得到1091bp AtHD/START1基因片段条带，M为Fermentas DNA ladder(250bp-10Kb)。
2、烟草叶片转化及植株再生1)烟草NC89(Nicotiana Tobaccum)种子(安徽省烟草公司)用70％乙醇浸泡30sec，去乙醇，无菌水清洗一遍，用0.1％HgCl2消毒10-15min，无菌水清洗5-6遍，播种于MS0培养基(不含任何激素的MS)，约6-8周后取无菌苗叶片转化；2)分别挑取根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1/pCB2004C/AtHD/START1和C58C1/pCB2006/AtHD/START1单菌落分别接种于10ml LB液体培养基，28℃培养过夜至对数生长后期(约17hr)，4℃，5000rpm，离心10min，收集菌体，用LB液体培养基稀释菌体至OD600至0.8-1.0，待用；3)取烟草叶片去中脉，打孔器打成0.25cm2小叶盘，将小叶盘浸入稀释好的农杆菌菌液，不时摇动，共培养10min，并做一组叶盘不经农杆菌侵染的阴性对照；4)共培养结束，无菌滤纸吸去叶盘上多余的菌液，叶面向下置于MS0培养基，28℃暗培养两天；5)暗培养结束，无菌水洗涤叶盘3-5次，无菌滤纸吸去水分，转移至MS0附加6-BA0.5mg/L+NAA 2.0mg/L+谷氨酸20mg/L+羧苄青霉素400mg/L的筛选培养基；6)一周后，叶盘转移至MS0附加6BA0.5mg/L+NAA2.0mg/L+谷氨酸20mg/L+羧苄青霉素400mg/L的选择培养基上进行分化，7-10天继代一次；7)3-4周后将叶盘周围幼芽切下，移至MS0附加20mg/L谷氨酸和20mg/L除草剂草铵膦(glufosinate ammonium)的生根培养基生根；8)幼苗生根并长至约3-5cm高，将培养瓶开盖炼苗1-2天，洗去根部植物凝胶，种植于纸袋中，保湿生长，待幼苗完全成活，移至花盆，于温室正常生长。
结果表明转化后的叶盘，在选择培养基上生长3-4周后，50％叶盘枯黄、死亡，30％叶盘周围在伤口处形成愈伤组织，20％叶盘周围直接分化出芽，将直接分化出的芽转入含20mg/L除草剂的生根培养基，绝大多数芽都可以在生根培养基生根、生长，生根的苗(T0代转化体)长至3-5cm高时，将培养瓶封口膜打开，炼苗1-3天后移栽入纸筒，以防再次移栽时对根产生伤害，纸筒中的苗完全成活并长大后，连纸筒一同移栽至花盆，共223株，温室生长，常规管理至成熟收种，得到T0代转化体的种子(T1代)。
三、转化体的鉴定1、转化体的PCR鉴定在除草剂中生根的烟草幼苗，移栽入温室生长3-4周，取叶片，CTAB抽提法提取转化体(转pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1的烟草NC89)及对照(烟草NC89)的基因组DNA，用于PCR鉴定。由于转化体的标记基因是Bar基因，引物设计根据Bar基因两端序列进行，上下游引物分别为P1TCAAATCTCGGTGACGGGCA；P2GTCTGCACCATCGTCAACCACTA。
PCR反应体系(50μl体系)DNA聚合酶Ex Taq(5U/μl)0.25μl，10×Ex Taqbuffer 5μl，dNTPs(四种dNTP，每种各10mM)4μl，P1(10μM)2μl，P2(10μM)2μl，基因组DNA 2μl，ddH2O 34.75μl。
PCR反应程序先95℃5min；然后94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，共40个循环；再72℃10min；最后4℃保存。PCR扩增产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
结果如图1所示，表明转化体可扩增出552bp的Bar基因目的条带，而对照未扩出相应条带，说明AtHD/START1基因确已转入烟草。图1中，MMarker；WT对照；其余泳道为不同转化单株。其中，4-6、4-12、4-17、4-23、4-30和4-27中转入的是pCB2004C/AtHD/START1，6-40和6-41中转入的是pCB2006/AtHD/START1。
2、转化体Southern blot分析1)除草剂上生根并移栽至温室的幼苗，完全成活后，CTAB法提取转化体(转pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1的烟草NC89)及对照(烟草NC89)的叶片基因组DNA，根据转入外源基因AtHD/START1序列、Bar基因序列以及质粒本身酶切位点，选择HindIII对烟草DNA进行酶切消化，酶切完全后，用1×TAE缓冲液，0.8％琼脂糖凝胶电泳，电压1V/cm，电泳12-14hr；电泳结束，紫外灯下拍照记录；2)将DNA转移尼龙膜上，转移后的尼龙膜，装入杂交管，加入新配制的杂交液(杂交液的组成为SDS 7％，BSA(Casein)1％，EDTA 1mM，Na2HPO4·12H2O0.25M)10-15ml，于65℃预杂交至少6hr；3)加入变性过的放射性标记探针(该探针为Bar基因)，65℃杂交16-20hr；杂交结束，含探针的杂交液倒入指定废液缸；4)加入100ml 2×SSC+0.1％SDS，旋紧盖子，翻转管子几次，洗膜，整个操作在室温下进行，洗后的溶液倒入盛放放射性物质的废液缸；5)加入200ml 2×SSC+0.1％SDS，于杂交炉室温洗膜5min，其余同4)；6)加入200ml 0.2×SSC+0.1％SDS，杂交炉室温洗膜5min，其余同5)；7)加入200ml 0.1×SSC+0.1％SDS，杂交炉室温洗膜5min，其余同5)；8)加入200ml 65℃预热的0.1×SSC+0.1％SDS，65℃杂交炉中洗膜10-30min，其余同5)；9)将膜置于一塑料盒，用SURVEY METER检测放射性强度，依放射性强度的大小，边检测边用65℃预热的0.1×SSC+0.1％SDS洗，直至合适强度。
10)洗膜结束，滤纸吸干膜上多余洗液，保鲜膜包裹尼龙膜；暗室中曝光，将膜固定在有高速增感屏的压片夹中，-80℃超低温冰箱放射自显影，拍照。
其中，探针按照如下方法制备①微量离心管中配制下列反应液，95℃加热3min，迅速置于冰中冷却，放置5min。
模板 10ng-1μg随机引物(TaKaRa公司的Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2，30reactions，codeD6045，自带) 2μldH2O直到14μl。
其中，模板是以pCB2004C为模板，用P1TCAAATCTCGGTGACGGGCA；和P2GTCTGCACCATCGTCAACCACTA得到的PCR产物。
②加入10×Buffer(TaKaRa公司的Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2，30reactions，codeD6045，自带)，dNTP Mixture(四种dNTP，每种各0.2uM/μl)2.5μl，用于标记的dCTP*2(50μCi)5μl。
③加入1μl Exo-free Klenow Fragment(2U/μl)，37℃反应60-120min；④65℃加热5min使酶失活；⑤95℃加热3min后迅速置于冰中冷却；⑥取反应液直接作为探针使用。
结果如图2所示，转化体可以杂交出条带，对照没有，进一步证明烟草转化成功。图2中，WT对照；其余泳道为不同转化单株。
3、转化体和对照对除草剂的抗性鉴定取PCR鉴定和Southern blot分析结果均为阳性的T0代转化体的种子和对照(烟草NC89)种子播种，萌发的小苗移栽入土壤，完全成活，喷施0.2％商用除草剂glufosinateammonium，喷施的量以叶面有液滴滴下为度，喷除草剂一周后，观察转化体和对照的生长表型，结果表明，喷施除草剂一周后，对照叶色发黄，部分叶片完全枯死，整株植株随后很快死亡，而转化体(T1代)叶色浓绿，生长旺盛，完全没有受到除草剂的影响，由此可确认转化的成功以及将除草剂作为转化体的筛选标记是切实可行的(图3a)。图3a中，上面的两盆为转化体，下面的两盆为对照。图3a只是一个转化体株46的照片，其余六个转化体株与4-6相同。
4、AtHD/START1基因在转化体中的表达分析取经步骤1的PCR鉴定和步骤2的Southern blot分析结果均为阳性的T0代转化体得到的T1代幼苗进行步骤3的除草剂抗性鉴定，取步骤3除草剂抗性鉴定结果为阳性的T1代幼苗对应的4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41等7个转化体株系的T0代幼苗和对照幼苗(烟草NC89，在图中以WT表示)进行RT-PCR。
在转化体和对照营养生长阶段，取叶片用Trizol法抽提RNA，反转录cDNA，进行RT-PCR，以烟草actin1作内标，检测转入基因在转化体内的表达情况。
(1)Trizol试剂盒提取烟草叶片RNA1)分别取50mg生长旺盛转化体和对照叶片，加入1ml Trizol，室温研磨，放置5min；2)4℃，12000g，离心10min，取上清，室温放置5min；
3)上清加入200μl氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min；4)4℃，12000g，离心15min，取上清并加入500μl异丙醇；5)室温放置10min，4℃，12000g，离心10min；6)弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，7500g，离心5min；7)弃上清，沉淀晾5min，10μl DEPC-H2O溶解；8)紫外分光光度计测定A260、A280，检查RNA质量并计算浓度，备用。
(2)RT-PCR1)向管中加入RNA 3μg、Oligod(T)2550pmol、dNTP(10mM)1μl、再加入dH2O直到14μl，混匀，65℃，5min，取出置冰上至少1min；同管中加入5×FS buffer(Invitrogen公司的SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase试剂盒自带，该试剂盒的商品目录号为Cat.No.18080-093)4μl、0.1M DTT 1μl、SSRTase III(Invitrogen公司的SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase试剂盒自带，该试剂盒的商品目录号为Cat.No.18080-093)1μl、至总体积20μl，50℃水浴，60min，得到cDNA的第一链。
2)以反转录得到的cDNA为模板，扩增烟草actin1，两端引物序列为P3CAGGGTTTGCTGGAGATGATGCTC；P4TGAATGCCTGCAGCTTCCATTCC；以rTaq PCR试剂盒(Takara公司)进行PCR扩增，PCR扩增体系(总体积20μl)为rTaq(U/μl)0.1μl，10×ExTaq buffer 2μl，dNTPs(四种dNTP，每种各10mM)1.6μl，P3(10μM)2μl，P4(10μM)2μl，模板1μl，dH2O 11.3μl。PCR扩增条件先95℃3min；然后94℃30sec、68℃1min，35个循环；再72℃10min；最后4℃保存。
3)调整内标，扩增AtHD/START1基因，引物序列为P5AT GAG TTT CGT CGT CGG CGT；P6TCA CTT TAG TGC ACT ATT ATC TGC T；以rTaq PCR试剂盒(Takara公司)进行PCR扩增，PCR扩增体系除将引物替换为P5和P6外，其他同actin1的PCR扩增体系；PCR扩增条件先95℃3min；然后94℃30sec、56℃30sec、72℃30sec，40个循环；再72℃10min；最后4℃保存。
结果如图3b所示，表明转入的AtHD/START1基因在转化体内均有表达，但在不同的载体中表达不同4-6、4-12、4-17、4-23和4-27中转入的是pCB2004C/AtHD/START1，由35S启动子启动AtHD/START1基因转录；而6-40和6-41中转入的是pCB2006/AtHD/START1，由水稻actin1启动子启动AtHD/START1基因转录，从表达情况看，以35S为启动子的载体，其表达显然要高于以水稻actin1为启动子的载体。
实施例2、转AtHD/START1基因烟草的抗旱性检测及其生理生化特性测定将经实施例1的PCR鉴定和Southern blot分析结果均为阳性的T0代转化体得到的T1代幼苗进行除草剂抗性鉴定，取除草剂抗性鉴定结果为阳性的T1代(在图中用转化体表示)4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41等7个转化体株系幼苗和对照(在图中用WT表示)幼苗进行如下抗旱性检测及其生理生化特性测定，每个转化体株系和对照均20株。
T0代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T1代。
做抗旱性鉴定植株，在苗龄为45天时移栽，选取同样大小花盆，花盆中花土称重，使花土重量一致，以尽量保证生长环境条件一致性，干旱前，选取生长状态良好并一致的转化体及对照，充分浇透水，然后同时进行干旱胁迫处理(持续不浇水)，在干旱胁迫后不同时间进行耐旱相关生理生化指标的测定及复水后的形态观察。
1、转化体和对照抗旱性鉴定结果表明干旱胁迫10天时，7个株系转化体仍在正常生长，而对照已严重萎蔫，(图4a，最下面一排为WT，其余三排为不同的转化体株系)；干旱胁迫20天后，7个株系转化体也失水而萎蔫，但是植株的叶片仍为绿色，只是由于失水导致叶绿素被破坏而使得叶片稍有发黄，而此时对照已基本枯死(图4b，最下面一排为WT，其余三排为不同的转化体株系)。干旱胁迫20天后开始恢复浇水，复水7天，转化体全部复活，对照未能复活(图4c，最下面一排为WT，其余三排为不同的转化体株系)，复水16天，转化体全部复活后在继续生长，对照全部死亡(图4d，最下面一排为WT，其余三排为不同的转化体株系)。
图4a、图4b、图4c和图4d只是三个转化体株系4-6、4-27和6-41的照片，其余四个转化体株系与4-6、4-27和6-41相同。
2、转化体抗旱性相关生理指标的测定(方法见《植物生理学实验指南》，中国科学院上海植物生理研究所、上海市植物生理学会编。科学出版社。2004年)(1)SOD酶活性测定转化体和对照开始干旱胁迫后，依照干旱胁迫不同时间取转化体和对照叶片，测定样品中SOD酶活性。具体方法如下1)粗酶液制备分别取每株转化体和对照烟草幼苗叶片0.5g，加入5倍于样品量的50mmol-LpH7.8磷酸缓冲液[含0.1mM EDTA；0.3％(0.3g/100ml)TritonX-100；4％(4g/100ml)聚乙烯吡咯烷酮(pvpp，polyvinylpolyrrolidone)]，研磨后倒入离心管中，以10,500g离心20min，上清液为粗酶液。
2)酶活性测定在盛有3ml反应混合液(在54ml 14.5mM dl-甲硫氨酸中分别加入均以50mM pH7.8磷酸缓冲液配制的3μMEDTA，2.25mM NBT和60μM核黄素各2ml，溶液均在用前配制，避光放置)的试管中，加入SOD粗酶液，混合后放在试管架上，在光照培养架内照光10min，取出试管，迅速测定OD560值，以不加酶液的照光管为对照。
3)计算酶活性＝酶单位/样品量＝反应被抑制％/(50％)×3ml反应混合液中加入的样品量。
结果表明干旱胁迫2周时，转化体SOD酶活性只比对照略有升高，升高并不明显，未表现出明显差异，干旱胁迫3周，转化体SOD酶活性比对照高，统计分析结果表明，转化体和对照之间已呈现显著差异(p＜0.05)，干旱胁迫4周时，转化体SOD酶活性和对照SOD酶活性之间也是呈现显著差异(p＜0.05)(图5)。图5中转化体为4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系、每个株系各20株的统计结果，对照是20株的统计结果。
(2)游离脯氨酸的测定转化体和对照开始干旱胁迫后，依照干旱胁迫不同时间取转化体和对照叶片，测定样品中脯氨酸含量。具体方法如下
1)脯氨酸提取分别取每株转化体和对照烟草幼苗叶片0.1g，用3％(3g/100ml)磺基水杨酸溶液研磨提取，磺基水杨酸的最终体积为5ml，匀浆液转入离心管中，沸水浴浸提10min。冷却后，以3000rpm离心10min，取上清液待测。
2)含量测定(a)标准曲线制作在1-10μg/ml脯氨酸浓度范围内制作标准曲线。取标准溶液各2ml，加入2ml 3％磺基水杨酸、2ml冰乙酸和4ml 2.5％(2.5g/100ml)茚三酮溶液，置沸水浴中显色60min。冷却后，加入4ml甲苯萃取红色物质。静置，取甲苯相测定520nm处的吸收值，依据脯氨酸量和相应吸收值绘制标准曲线。
(b)样品测定取2ml上清液，加入2ml水，再加入冰乙酸等显色试剂，同标准曲线程序进行显色、萃取和比色。
结果表明干旱胁迫2周时，转化体脯氨酸含量比对照脯氨酸含量略有升高，但未表现出明显差异，干旱胁迫3周时，转化体脯氨酸含量虽然还是比对照脯氨酸含量高，但差异也不大，干旱胁迫4周时，转化体脯氨酸含量明显比对照脯氨酸含量高，而且这种差异达到了显著水平(p＜0.05)(图6)。图6中转化体为4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系、每个株系各20株的统计结果，对照是20株的统计结果。脯氨酸是表明植物体耐逆性状高低的一个重要指标，转化体内脯氨酸含量的升高，表明转化体受到干旱胁迫后，体内积累了多量脯氨酸，从而提高自身对逆境的抗性。
(3)可溶性总糖的测定转化体和对照开始干旱胁迫后，依照干旱胁迫不同时间取转化体和对照叶片，测定样品中总糖含量。具体方法如下1)试剂(a)葡萄糖标准液准确称取分析纯无水葡萄糖0.2000g，蒸馏水溶解并定容至200ml，使用时稀释10倍，其浓度为100μg/ml；(b)蒽酮试剂称取蒽酮1g溶于72％H2SO4溶液1000ml(98％浓H2SO4760ml+蒸馏水240ml)，贮于棕色瓶，冰箱保存，可用2-3周；2)标准曲线绘制取干燥洁净的试管6支(0-5号)，依次加入葡萄糖标准溶液0(空白)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml(各管葡萄糖量依次为0、20、40、60、80、100μg)和蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分别加入蒽酮试剂5ml，摇匀后沸水中10min，取出冷却后于620nm下比色，记录OD620值，绘出标准曲线。
3)样品提取分别取每株转化体和对照烟草幼苗新鲜叶片1.0g，加入少量石英沙及去离子水研磨至匀浆，连同残渣用去离子水定容至100ml，室温下静置60min(经常摇动)，过滤弃残渣。
4)样品测定取干洁试管，分别加入样液1ml和蒽酮试剂5ml，摇匀后，沸水浴10min，冷却后620nm比色(标准曲线空白做零点)，记录OD620值。
5)结果计算按照公式C＝AN/W计算。
其中C-样品可溶性糖含量(μg/g叶片)；A-标准曲线查得的可溶性糖(μg)；W-样品重量(g)；N-样品提取液占样品反应液的倍数。
结果表明干旱胁迫3周时，转化体中总糖含量比对照显著升高，差异达极显著水平(p＜0.01)，这种升高不同于SOD酶活性的升高和脯氨酸含量的升高，在SOD酶活性升高中，转化体和对照之间的差异只是达显著水平(p＜0.05)，而干旱胁迫3周时，转化体和对照之间脯氨酸含量的差异还不明显；干旱胁迫4周时，转化体和对照的总糖含量差别和干旱胁迫3周时差异不大，也达极显著水平(p＜0.01)(图7)。图7中转化体为4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系、每个株系各20株的统计结果，对照是20株的统计结果。
(4)钾离子含量测定转化体和对照开始干旱胁迫后，依照干旱胁迫不同时间取转化体和对照叶片，测定样品中K+含量。具体方法如下1)样品提取分别取每株转化体和对照烟草幼苗新鲜叶片1.0g，加入少量石英沙及去离子水研磨至匀浆，连同残渣一起用去离子水定容至50ml，室温下静置60min(经常摇动)，慢速滤纸过滤弃去残渣。
2)样品测定过滤后的上清液，用火焰分光光度计测定钾离子含量。
结果表明干旱胁迫2周时，转化体K+含量已比对照中K+含量升高，且升高已达极显著差异水平(p＜0.01)，干旱胁迫3周时，转化体和对照K+含量和干旱胁迫2周时差不多，也达到极显著差异(p＜0.01)，干旱胁迫4周时，转化体和对照之间K+含量差异更加明显，其差异的程度比干旱胁迫2周和3周时还要高(图8)。图8中转化体为4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系、每个株系各20株的统计结果，对照是20株的统计结果。
实施例3、转AtHD/START1基因烟草的相关生物学性状观察将经实施例1的PCR鉴定和Southern blot分析结果均为阳性的T0代转化体得到的T1代幼苗进行除草剂抗性鉴定，取除草剂抗性鉴定结果为阳性的T1代(在图中用转化体表示)4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41等7个转化体株系幼苗和对照(在图中用WT表示)幼苗在苗龄为45天时移栽，进行如下相关生物学性状观察。每个转化体株系和对照均20株。
T0代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T1代。
1、开花时间、叶片大小及叶片数的观察对移栽后的7个株系转化体(每个株系20株)和对照(20株)进行不同时期的观察和记录，并测量记录开花时间、最大叶片长、最大叶片宽及叶片数量。
(1)开花时间比较观察转化体和对照正常生长过程，发现转化体和对照的开花时间明显不同，正常生长50天时，对照已开始抽苔，生长至60天，对照最早的已经开出中心花(图9a中后面的两盆)，而转化体仍处于旺盛营养生长阶段(图9a中前面的两盆)；生长110天后，对照大部分已结实，转化体只有少数才开始进入花期，大部分转化体尚未开花(图9b，左列为转化体，右列为对照)。从观察结果看，转化体中心花开花时间比对照平均晚30-40天，最长晚60天，但花期基本没有改变。从观察结果看，对照株普遍抽苔早，当它们已经进入生殖生长期时，转化体还在进行旺盛的营养生长，随着移栽时间的延长，转化体也开始抽苔，进入生殖生长。图9a和图9b只是一个转化体株系4-6的照片，其余六个转化体株系均与4-6相同。
(2)叶片数的比较观察转化体和对照正常生长过程，转化体叶片数比对照多，移栽早期时，转化体和对照都处于幼苗生长期阶段，此时的叶片数看不出明显差异，移栽50天后，已可看出转化体和对照叶片数的差异(图10a，左列为转化体，右列为对照)，随着生长时间的延长，这种差异表现越来越明显(图10b)。从图9a可看出，生长至60天时，对照已抽苔，并开出中心花，中心花一旦开放，则叶片数将不会再增加。由于对照的抽苔时间普遍早于转化体，因此当绝大多数对照已抽苔开花时，转化体还在进行营养生长，这也就导致了转化体的叶片数可以不断增加，一直到它抽苔开花后，叶片数才不会再增加。从图10b的统计结果也可看出这点，移栽70天时，转化体和对照间叶片数差异还没有明显区别，移栽80天时，它们间的叶片数达到显著差异(p＝0.0132)。移栽100天后，达到了极显著差异(p＝0.0001)。移栽100天后叶片数比较结果如表1所示，表1中，WT为20株对照的统计结果，4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系，每个株系20株的统计结果。图10a只是一个转化体株系4-6的照片。图10b中，转化体为4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系、每个株系20株的统计结果，对照是20株的统计结果。
表1不同转化株系移栽后100天叶片数
(3)叶片大小的比较观察转化体和对照的正常生长过程，移栽早期转化体最大叶片长和最大叶片宽都比对照要大，但随着生长时间延长，这种差异逐渐减小，到生长后期，对照的最大叶片长和最大叶片宽都比转化体要大，叶长差异达到了显著水平(p＜0.05)(图11a和11b)。图11a和11b中转化体为4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系、每个株系各20株的统计结果，对照是20株的统计结果。
2、果荚数的比较植株生长进入开花期后，观察并记录转化体和对照开花情况，结果荚后，记录转化体和对照果荚数。
表2不同转化株系果荚数
结果表明生长110天后，对照大部分已结实，转化体只有少数才开始进入花期。在转化体和对照开花时发现，它们的花朵数量有较明显差别，因此果荚成熟后对转化体和对照的果荚数做了统计，确认它们的果荚数量确实存在明显差异(图12，表2)，且这种差异达到了极显著水平(p＝0.0045)。表2中，WT为20株对照的统计结果，4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系，每个株系20株的统计结果。图12中，转化体为4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系、每个株系20株的统计结果，对照是20株的统计结果。
3、叶片气孔密度、表皮细胞密度、气孔大小以及叶片气孔指数的比较选取生长状态一致的转化体和对照，选取同样叶位的相同部位，尖头镊子撕取叶片下表皮，并用小排刷刷去表皮上粘附的叶肉细胞，做成水封片，显微镜下观察记录每一视野中气孔数和表皮细胞数，每个叶片观察记录50个视野，再根据测微尺计算每个视野的面积，计算叶片气孔密度(个/mm2)、叶片表皮细胞密度(个/mm2)。
在计算出转化体和对照的气孔密度和表皮细胞密度之后，根据下述公式计算各自的气孔指数(气孔指数＝[气孔数/(气孔数+表皮细胞数)])。
在上述观察记录气孔数量的同时，用测微尺测量每一气孔长度、宽度，气孔长度以气孔纵轴最长处计算，气孔宽度以垂直于纵轴最宽处计算。
图13中a和b分别为对照和转化体叶片下表皮气孔的200倍光镜照片，图13中c和d分别为对照和转化体叶片下表皮气孔的400倍光镜照片，仅从200倍和400倍的光镜照片可以看出，对照和转化体不仅气孔数量存在很大差异，而且气孔大小也存在明显差别，与此同时，仔细观察照片可以看出，转化体叶片下表皮，在气孔数量减少、气孔变大的同时，表皮细胞也明显变大，转化体和对照叶片下表皮气孔密度、表皮细胞密度、气孔指数和气孔大小统计结果表明，它们之间差异都达到极显著水平(p＜0.01)(图14、15、16、17和表3)。
表3不同转化株系气孔密度、表皮细胞密度及气孔指数
表3中，WT为20株对照的统计结果，4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系，每个株系20株的统计结果。图13只是一个转化体株系4-6的照片。图14-17中，转化体为4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、640和6-41为7个转化体株系、每个株系20株的统计结果，对照是20株的统计结果。
4、叶片厚度的比较选取生长状态一致的转化体和对照，并选取同样叶位的相同部位，徒手切片，切片做成水封片，显微镜下观察，观察的同时用测微尺测量叶肉细胞长和宽。
结果表明转化体和对照叶片在厚度上同样存在明显差异，为清楚是由于叶片叶肉细胞层数增多还是由于叶肉细胞变大而导致了叶片的加厚，对叶片做徒手切片进行观察，图18中a和b分别为对照和转化体叶片徒手切片横切面的100倍光镜照片，图18中c和d分别为对照和转化体叶片徒手切片横切面的200倍光镜照片，从照片可以明显看出，转化体和对照的叶肉细胞层数都没有发生变化，仍然是一层栅栏细胞，2-3层海绵细胞，但转化体的栅栏细胞的大小却发生了显著改变，和对照相比，其栅栏细胞变长、变宽，通过对栅栏细胞的测量(图19)发现，栅栏细胞的长和宽在转化体和对照之间都达到了极显著的差异水平(p＜0.01)，正是由于栅栏细胞大小的改变，从而导致了叶片厚度的变化，而这种叶片厚度的改变也是转化体可以对干旱增加抵抗的一个重要原因。图18只是一个转化体株系4-6的照片，其余六个转化体株系均与4-6相同。图19中，转化体为4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系、每个株系20株的统计结果，对照是20株的统计结果。
5、转化体和对照光合指标测定选取生长状态一致的转化体和对照，测定相同叶位光合速率(μmol CO2/m2s)、蒸腾速率(μmolH2O/m2s)、水分利用率(mg/g)、气孔导度(mmol/m2s)，测定时，7个转化体株系和对照每种测定20株，统计测定结果。所用仪器为PB0402光合蒸腾仪。
表4不同转化株系光合指标
在植物营养生长阶段，用光合测定仪对各植株进行光合指标的测定。从测定的光合指标结果来看，转化体的光合速率、水分利用率均比对照要高(图20、图21和表4)，但并未达到显著差异的水平；而对照的蒸腾速率和气孔导度则都比转化体要高(图22、图23和表4)，但也未达显著差异水平。表4中，WT为20株对照的统计结果，4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系，每个株系20株的统计结果。
图20-23中，转化体为4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系、每个株系20株的统计结果，对照是20株的统计结果。
实施例4、转AtHD/START1基因烟草的耐盐性检测及其生理生化特性测定将经实施例1的PCR鉴定和Southern blot分析结果均为阳性的T0代转化体得到的T1代幼苗进行除草剂抗性鉴定，取除草剂抗性鉴定结果为阳性的7个转化体株系(4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41)的T0代转化体种子，进行如下耐盐性检测。
1、水培观察转化体和对照幼苗期耐盐性及光合指标测定1)T0代转化体种子和对照分别用70％乙醇浸洗30sec，无菌水清洗一遍；2)50％bleach消毒15min，无菌水清洗5-6遍；3)灭菌后的种子播种在MS0含20mg/L除草剂glufosinate ammonium培养皿中萌发，萌发长出四片真叶时移栽入土壤中，于温室继续生长；4)长至6-8片真叶时，选取生长状态一致、大小一致的苗进行水培培养；
5)在大的周转箱中，倒入10L Hoagland营养液，取和周转箱内径大小匹配的泡沫板，泡沫板上等距离打孔备用；其中，Hoagland营养液组成如下(a)大量元素 每升培养液中加入的毫升数KH2PO41M 1KNO31M 5Ca(NO3)21M 5MgSO41M 2(b)微量元素 每升培养液中加入的克数H3BO32.86MnCl2·4H2O1.81ZnSO4·7H2O0.22CuSO4·5H2O0.08H2MoO4·H2O 0.02(c)每升培养液中加入1mL浓度为10mM的Fe-EDTA溶液(即乙二胺四乙酸铁盐溶液)。
6)小心将苗挖出，洗去附着的土壤，插入泡沫板孔中，悬浮于培养液，温室生长；7)水培一天后，在培养液中加入NaCl，使培养液中NaCl的终浓度为50mM，继续培养5天，5天后，再加入NaCl，使培养液中NaCl的终浓度为100mM，再继续培养5天，如此一直使NaCl浓度增加到150mM；选取生长一致的烟草幼苗进行水培，水培苗成活后(只需一天恢复即可)，进行不同浓度NaCl胁迫处理，胁迫处理前转化体和对照生长基本没有差别，幼苗大小及生长状态基本一致(图24中a)；加入NaCl使水培液中NaCl终浓度达50mM继续生长3天，转化体和对照开始表现生长差异，转化体生长基本未受影响，而对照生长速度则变得比较缓慢(图24中b)，此时只是从苗的大小上可看出差别，而从叶色上还看不出明显区别；50mMNaCl处理5天后，NaCl浓度增加到100mM继续处理5天，可以非常明显看出转化体和对照间差异加大，转化体依然生长正常，叶色浓绿(图24中d)，而对照生长明显缓慢，叶片数也较转化体少，叶色发黄，部分心叶叶形发生歧变(图24中h)，NaCl浓度增加到150mM再继续处理6天，转化体和对照还在继续生长，但转化体明显好于对照(图24中e)，这说明转化体对一定浓度NaCl的确有耐受性，由于随着培养时间的延长，水培箱已无法容纳越来越大的苗，所以实验终止，未观察生殖生长阶段的耐盐性状。
图24中，a、50mM NaCl处理前的生长情况；b、50mM NaCl处理3天；c、NaCl胁迫处理开始时的根(右为转化体，左为对照)；d、50mM NaCl处理5天，100mM NaCl处理5天；e、50mM NaCl处理5天，100mM NaCl处理5天，150mM NaCl处理6天；f、50mM NaCl处理5天，100mM NaCl处理5天，150mM NaCl处理6天的根(右为转化体的根，左为对照的根)；g、50mM NaCl处理5天，100mM NaCl处理5天，150mM NaCl处理6天的根(右为转化体的根，左为对照的根)；h、50mM NaCl处理5天，100mM NaCl处理5天后叶片的生长状况(右两片为转化体，左三片为对照)；a、b、d、e均是上排为转化体，下排为对照。图24只是一个转化体株系4-6的照片，其余六个转化体株系的幼苗期耐盐性均与4-6相同。
转化体对NaCl的耐受性除了造成生长中苗的大小产生差异外，对转化体和对照叶片数也产生了影响，用NaCl处理后，转化体可以正常生长，而对照的生长变得比较缓慢，这种差异在叶片数量方面也得到体现(图25)，此外，NaCl处理也影响了转化体和对照的根系发育，如图24中c所示，水培开始时候，转化体和对照根系相对一致，基本没有差异，用不同浓度NaCl处理后，转化体侧根明显增多，而对照根系表现出发育不良，侧根较少(图24中f、图24中g)，对根系的称重表明，这种差异达到了显著水平(p＜0.05)(图26)，正是由于这种根系发育的差异才导致了全株发育受阻，对根冠比的统计结果也表明，转化体的根冠比比对照株要高(图27)，但差异未达显著水平。图25-27中，转化体为4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系、每个株系20株的统计结果，对照是20株的统计结果。
选取生长一致的烟草幼苗进行水培，水培苗成活后(只需一天恢复即可)，进行不同浓度NaCl胁迫处理50mM NaCl处理5天，100mM NaCl处理5天，150mM NaCl处理6天，用光合测定仪对各植株进行光合指标的测定。从表5和图28-31的光合指标测定结果看，转化体的光合速率、水分利用率均比对照要高，并且这种差异比在正常条件下的差异明显要大，正常生长条件下，光合速率在转化体和对照间的差异p值在0.6602(图20)，而NaCl胁迫后，p值在0.2889(图28)，正常生长条件下的水分利用率在转化体和对照间的差异p值在0.6008(图22)，而NaCl胁迫后，p值在0.2085(图30)，蒸腾速率和气孔导度在正常生长和盐胁迫条件下的差异变化不大(图21、23、29、31)。
表5 NaCl处理后不同转化株系光合指标
图28-31中，转化体为4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系、每个株系20株的统计结果，对照是20株的统计结果。表5中，WT为20株对照的统计结果，4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系、每个株系20株的统计结果。
2、转化体和对照对盐萌发敏感性的观察1)烟草种子灭菌步骤同步骤1；2)将灭菌后的种子点播在MS0附加不同浓度NaCl的培养基板上，NaCl浓度梯度为0mM、50mM、100mM、150mM和200mM，点播时，同一培养皿一半点播转化体，一半点播对照，于植物生长室光照培养或于植物生长室光照竖直培养；将T0代转化体和对照种子播种在含不同浓度NaCl的培养板上，2周后观察结果，表明在0mM NaCl培养板上转化体和对照子叶展开，部分单株已萌发出两片真叶，根系都可以正常生长，全株生长正常(图32中a)；而在100mM NaCl板上，转化体种子全部萌发，绝大多数转化体子叶展开，根也正常长出，但生长速度比在0mM NaCl板上的生长速度要慢，因此整株幼苗比在0mM板上的幼苗小，而对照在100mM板上大多数仅仅是伸出了胚根，只极少数长出子叶，且子叶小于转化体的子叶，全株生长受到明显抑制(图32中b)。将转化体和对照的种子点播在不同浓度NaCl培养板上进行竖直培养，观察根系的生长情况时，NaCl浓度对转化体和对照的影响也很明显，低浓度NaCl对转化体的根影响较小，转化体根系基本可以正常生长，但对对照根的生长却生产了较明显的抑制作用(图32中c)，而在高浓度NaCl培养板上，虽然转化体的根生长也受到抑制，但对对照的抑制作用更加明显图32中d)，高浓度NaCl板上，对照几乎无法生长，仅仅只能萌生出胚根；对根长的统计结果表明，无论是在低浓度NaCl(100mM)培养板上还是在高浓度(200mM)NaCl培养板上，转化体和对照根长之间的差异都达到了极显著水平(图33a和图33b)。
图32中，a、0mMNaCl培养板上萌发2周(上为对照，下为转化体)；b、含100mM NaCl培养板上萌发2周(上为对照，下为转化体)；c、含100mM NaCl培养板上萌发2周的根系(右为转化体，左为对照)；d、含200mM NaCl培养板上萌发2周的根系(右为转化体，左为对照)。图32只是一个转化体株系4-6的照片，其余六个转化体株系的幼苗期耐盐性均与4-6相同。图33a和33b中，转化体为4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41为7个转化体株系、每个株系20株的统计结果，对照是20株的统计结果。
序列表<160>2<210>1<211>2169<212>DNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atgagtttcg tcgtcggcgt cggcggaagt ggtagtggaa gcggcggaga cggtggtggt60agtcatcatc acgacggctc tgaaactgat aggaagaaga aacgttacca tcgtcacacc120gctcaacaga ttcaacgcct tgaatcgagt ttcaaggagt gtcctcatcc agatgagaaa180cagaggaacc agcttagcag agaattgggt ttggctccaa gacaaatcaa gttctggttt240cagaacagaa gaactcagct taaggctcaa catgagagag cagataatag tgcactaaag300gcagagaatg ataaaattcg ttgcgaaaac attgctatta gagaagctct caagcatgct360atatgtccta actgtggagg tcctcctgtt agtgaagatc cttactttga tgaacaaaag420cttcggattg aaaatgcaca ccttagagaa gagcttgaaa gaatgtctac cattgcatca480aagtacatgg gaagaccgat atcgcaactc tctacgctac atccaatgca catctcaccg540ttggatttgt caatgactag tttaactggt tgtggacctt ttggtcatgg tccttcactc600gattttgatc ttcttccagg aagttctatg gctgttggtc ctaataataa tctgcaatct660cagcctaact tggctatatc agacatggat aagcctatta tgaccggcat tgctttgact720gcaatggaag aattgctcag gcttcttcag acaaatgaac ctctatggac aagaacagat780ggctgcagag acattctcaa tcttggtagc tatgagaatg ttttcccaag atcaagtaac840cgagggaaga accagaactt tcgagtcgaa gcatcaaggt cttctggtat tgtcttcatg900aatgctatgg cacttgtcga catgttcatg gattgtgtca agtggacaga actctttccc960tctatcattg cagcttctaa aacacttgca gtgatttctt caggaatggg aggtacccat1020gagggtgcat tgcatttgtt gtatgaagaa atggaagtgc tttcgccttt agtagcaaca1080cgcgaattct gcgagctacg ctattgtcaa cagactgaac aaggaagctg gatagttgta1140aacgtctcat atgatcttcc tcagtttgtt tctcactctc agtcctatag atttccatct1200ggatgcttga ttcaggatat gcccaatgga tattccaagg ttacttgggt tgaacatatt1260gaaactgaag aaaaagaact ggttcatgag ctatacagag agattattca cagagggatt1320gcttttgggg ctgatcgttg ggttaccact ctccagagaa tgtgtgaaag atttgcttct1380ctatcggtac cagcgtcttc atctcgtgat ctcggtggag tgattctatc accggaaggg1440aagagaagca tgatgagact tgctcagagg atgatcagca actactgttt aagtgtcagc1500agatccaaca acacacgctc aaccgttgtt tcggaactga acgaagttgg aatccgtgtg1560actgcacata agagccctga accaaacggc acagtcctat gtgcagccac cactttctgg1620cttcccaatt ctcctcaaaa tgtcttcaat ttcctcaaag acgaaagaac ccgtcctcag1680
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Lys Tyr Met Gly Arg Pro IIe Ser Gln Leu Ser Thr Leu His Pro Met165 170 175His Ile Ser Pro Leu Asp Leu Ser Met Thr Ser Leu Thr Gly Cys Gly180 185 190Pro Phe Gly His Gly Pro Ser Leu Asp Phe Asp Leu Leu Pro Gly Ser195 200 205Ser Met Ala Val Gly Pro Asn Asn Asn Leu Gln Ser Gln Pro Asn Leu210 215 220Ala Ile Ser Asp Met Asp Lys Pro Ile Met Thr Gly Ile Ala Leu Thr225 230 235 240Ala Met Glu Glu Leu Leu Arg Leu Leu Gln Thr Asn Glu Pro Leu Trp245 250 255Thr Arg Thr Asp Gly Cys Arg Asp Ile Leu Asn Leu Gly Ser Tyr Glu260 265 270Asn Val Phe Pro Arg Ser Ser Asn Arg Gly Lys Asn Gln Asn Phe Arg275 280 285Val Glu Ala Ser Arg Ser Ser Gly Ile Val Phe Met Asn Ala Met Ala290 295 300Leu Val Asp Met Phe Met Asp Cys Val Lys Trp Thr Glu Leu Phe Pro305 310 315 320Ser Ile Ile Ala Ala Ser Lys Thr Leu Ala Val Ile Ser Ser Gly Met325 330 335Gly Gly Thr His Glu Gly Ala Leu His Leu Leu Tyr Glu Glu Met Glu340 345 350Val Leu Ser Pro Leu Val Ala Thr Arg Glu Phe Cys Glu Leu Arg Tyr355 360 365Cys Gln Gln Thr Glu Gln Gly Ser Trp Ile Val Val Asn Val Ser Tyr370 375 380Asp Leu Pro Gln Phe Val Ser His Ser Gln Ser Tyr Arg Phe Pro Ser385 390 395 400Gly Cys Leu Ile Gln Asp Met Pro Asn Gly Tyr Ser Lys Val Thr Trp405 410 415Val Glu His Ile Glu Thr Glu Glu Lys Glu Leu Val His Glu Leu Tyr420 425 430Arg Glu Ile Ile His Arg Gly Ile Ala Phe Gly Ala Asp Arg Trp Val435 440 445Thr Thr Leu Gln Arg Met Cys Glu Arg Phe Ala Ser Leu Ser Val Pro
450 455 460Ala Ser Ser Ser Arg Asp Leu Gly Gly Val Ile Leu Ser Pro Glu Gly465 470 475 480Lys Arg Ser Met Met Arg Leu Ala Gln Arg Met Ile Ser Asn Tyr Cys485 490 495Leu Ser Val Ser Arg Ser Asn Asn Thr Arg Ser Thr Val Val Ser Glu500 505 510Leu Asn Glu Val Gly Ile Arg Val Thr Ala His Lys Ser Pro Glu Pro515 520 525Asn Gly Thr Val Leu Cys Ala Ala Thr Thr Phe Trp Leu Pro Asn Ser530 535 540Pro Gln Asn Val Phe Asn Phe Leu Lys Asp Glu Arg Thr Arg Pro Gln545 550 555 560Trp Asp Val Leu Ser Asn Gly Asn Ala Val Gln Glu Val Ala His Ile565 570 575Ser Asn Gly Ser His Pro Gly Asn Cys Ile Ser Val Leu Arg Gly Ser580 585 590Asn Ala Thr His Ser Asn Asn Met Leu Ile Leu Gln Glu Ser Ser Thr595 600 605Asp Ser Ser Gly Ala Phe Val Val Tyr Ser Pro Val Asp Leu Ala Ala610 615 620Leu Asn Ile Ala Met Ser Gly Glu Asp Pro Ser Tyr Ile Pro Leu Leu625 630 635 640Ser Ser Gly Phe Thr Ile Ser Pro Asp Gly Asn Gly Ser Asn Ser Glu645 650 655Gln Gly Gly Ala Ser Thr Ser Ser Gly Arg Ala Ser Ala Ser Gly Ser660 665 670Leu Ile Thr Val Gly Phe Gln Ile Met Val Ser Asn Leu Pro Thr Ala675 680 685Lys Leu Asn Met Glu Ser Val Glu Thr Val Asn Asn Leu Ile Gly Thr690 695 700Thr Val His Gln Ile Lys Thr Ala Leu Ser Gly Pro Thr Ala Ser Thr705 710 715 720Thr Ala
权利要求
1.一种培育抗逆转基因烟草的方法，是将AtHD/START1基因通过植物表达载体导入烟草中，筛选得到抗逆性提高的烟草；所述AtHD/START1是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与(a)相同活性活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因的编码序列是序列表中的序列1。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述植物表达载体中启动外源基因转录的启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子或玄参花叶病毒35S启动子。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因通过植物表达载体pCB2004C导入烟草中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因插入植物表达载体pCB2004C的attR1和attR2之间。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述植物表达载体中启动外源基因转录的启动子是水稻actin1启动子。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因通过植物表达载体pCB2006导入烟草中。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因插入植物表达载体pCB2006的attR1和attR2之间。
9.根据权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性和/或抗氧化性。
10.根据权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述烟草为烟草NC89。
全文摘要
本发明公开了一种培育抗逆转基因烟草的方法。该方法是将AtHD/START1基因通过植物表达载体导入烟草中，筛选得到抗逆性提高的烟草；所述AtHD/START1是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与(a)相同活性活性的由(a)衍生的蛋白质。转AtHD/START1基因烟草株系(转化体)的耐旱性和耐盐性都明显高于对照(未转基因烟草)株系。
文档编号C12N15/29GK1948478SQ20061011432
公开日2007年4月18日 申请日期2006年11月6日 优先权日2006年11月6日
发明者向成斌, 陈曦 申请人:中国科学技术大学