利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法

专利名称：：利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法
技术领域：
：本发明属于生物技术和植物学领域。具体地说，本发明涉及一种改良植物抗虫性的新方法。
背景技术：
：在农业上，虫害问题一直是影响农作物产量的一个重要因素。人们每年要投入大量的人力、物力来抑制虫害，以提高作物产量。随着农业害虫对农药的抗性增加，以及出于保护环境和可持续性发展的考虑，迫切需要新的抗虫方法的出台。转基因抗虫植物的出现缓解了这一矛盾，为农业的发展作出了重大贡献，如转基因抗虫大豆，价抗虫棉等。然而，目前已陆续有研究报道，随着时间的推移，各种转基因抗虫植物的抗性正在下降，以前大规模罕见的虫害现象又开始死灰复燃。因此，迫切需要找到新的方法，开发出新型的转基因抗虫植物，以有效地和/或特异性地对抗植物的病虫害。
发明内容本发明的目的在于提供一种利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法。在本发明的第一方面，提供一种提高植物抗虫性的方法，所述的方法包括步骤将表达昆虫基因dsRNA的构建物转入植物细胞、组织或器官中，所述的表达昆虫基因ds認A的构建物为双链，并且其正链或负链含有以下式I结构Seq正向一X—Seq反向《I式中，Seq^为昆虫基因的正向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp;Seq^为同一昆虫基因的反向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp;X为位于Seq,:向禾nSeq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq,.:向和Seq,i向不互补，从而在植物细胞、组织或器官中表达形成式II所示的昆虫基因的dsRNA，<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式工工式中，Seq||;向、Seq反向和X的定义如上述，II表示在Seq^和Seq^之间形成的氢键(优选的，为双链RNA氢键)。在本发明的另一优选例中，所述dsRNA在植物体内被加工成siRNA。在本发明的另一优选例中，所述的抗虫性为对植食性昆虫的抗性。在本发明的另一优选例中，所述的构建物位于表达载体上，所述的表达载体还包含能在植物中转录的启动子。在本发明的另一优选例中，所述昆虫基因是昆虫生长必需的基因，或在特定条件下(如在有农药、或植物抗毒素等存在或诱导的情况下)能影响昆虫生长发育的基因。在本发明的另一优选例中，所述昆虫基因是在昆虫的胃或肠中表达的基因。更佳地，所述昆虫基因是在昆虫的胃或肠中特异性表达或高表达的基因。在本发明的另一优选例中，所述的植物选自双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。在本发明的另一优选例中，所述的植物是农作物、花卉植物、或林业植物。在本发明的另一优选例中，所述的植物包括(但不限于)棉花、烟草、拟南芥、水稻、小麦、玉米、高粱等。在本发明的另一优选例中，所述的昆虫选自植食性昆虫。在本发明的另一优选例中，所述的昆虫包括(但不限于)棉铃虫。在本发明的另一优选例中，所述的间隔序列的长度为80-300bp;更佳地为100-250bp。在本发明的另一优选例中，所述的间隔序列为内含子。在本发明的第二方面，提供一种昆虫基因dsRNA的用途，用于制备具有抗虫性的植物。在本发明的另一优选例中，所述的基因是棉铃虫的GIP基因。在本发明的另一优选例中，所述的昆虫基因被制成一双链构建物，并且其正链或负链含有以下式I结构<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式中，Seq^为昆虫基因的正向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp;Seq础为同一昆虫基因的反向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp;X为位于Seq^和Seq础之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq和Seq^不互补，从而在植物细胞、组织或器官中表达形成式II所示的昆虫基因dsRNA，Seq正向<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式中，Seq,w、Seq^和X的定义如上述，II表示在Seq1:向和Seq反向之间形成氢键。1在本发明的第三方面，提供一种植物细胞，所述的植物细胞中含有表达昆虫基因dsRNA的构建物，所述的表达昆虫基因dsRNA的构建物为双链，并且其正链或负链含有以下式I结构<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式中，Seq^为昆虫基因的正向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp;Seq^为同一昆虫基因的反向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp;X为位于Seq,m和Seq^之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq和Seq^向不互补，从而在植物细胞中表达形成式II所示的昆虫基因dsRNA，<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式中，Seqrt、Seq,M和X的定义如上述，II表示在Seq^和Seq^之间形成的双链RNA氢键。在本发明的第四方面，提供一种G/尸基因的用途，用于制备抑制棉铃虫生长的制剂或植物。在本发明的另一优选例中，所述抑制棉铃虫生长的制剂为含有可下调G/尸基因表达的小干扰RNA(siRNA)的制剂。在本发明的另一优选例中，所述的制剂用于下调棉铃虫体内G/尸基因的表达。在本发明的另一优选例中，所述的制剂通过抑制^尸基因的转录来下调棉铃虫体内G/尸基因的表达。在本发明的另一优选例中，所述的制剂通过降低棉铃虫对棉酚的耐受性来抑制棉铃虫的生长。在本发明的另一优选例中，所述的G/尸基因具有SEQIDN0:1所示的核苷酸序列。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1显示了利用植物表达昆虫基因的dsRNA，通过昆虫取食该植物后抑制昆虫体内相关基因表达的示意图。图2显示了G/尸，"77基因的核苷酸序列以及推测的蛋白序列。其中，A:C/尸的核苷酸序列；B:^尸的蛋白序列；C:^T7的核苷酸序列；D:G577的蛋白序列。阴影处为本发明的优选方式中用于构建dsR.NA载体的序列。，始密码子；终止密码子。图3显示了在棉酚存在下，GIP的表达与棉铃虫的生长密切相关。图4A显示了本发明的dsRNA载体的构建。其中，图4A上列为PBI121载体的部分结构，图4A下列为利用PBI121载体构建的PBIdsRNA的部分结构。图4B显示了Northern印迹检测表达含d尸，6TV或序列dsRNA的转基因烟草和拟南芥。图5显示了表达含G/尸序列的dsRNA转基因植物对棉铃虫的影响。图6显示了表达含"77序列的dsRNA转基因拟南芥对棉铃虫的影响。具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现植物体内形成的昆虫基因的siRNA在被昆虫服食后，可达到显著抑制昆虫基因的目的，受昆虫体内消化系统等屏障的影响较小或不受影响。因此，可利用在转基因植物体内产生的昆虫基因的siRNA，藉由植食性昆虫取食进入到昆虫体内，行使对耙基因的RNA干扰，抑制靶基因的表达。因此，本发明人开发了一种利用RNA干扰机制、以植物作为媒介来抑制昆虫生长的方法。即将包含正向和反向昆虫基因(或片段)序列的构建物导入到植物内，该构建物在植物体内可表达昆虫基因的dsRNA，所述dsRNA被加工成siRNA，昆虫在服食了所述植物后，摄入该siRNA，在昆虫体内抑制所述昆虫基因的表达，从而达到抑制昆虫生长的目的。此外，本发明人还发现，在棉铃虫中，有1条基因在棉铃虫对棉酚的解毒中起重要作用，并从亚洲棉铃虫(船h'coKe，aivw'ge")cDNA文库中分离到全长的该基因，本发明人将之命名为G/尸。进一步的研究发现，抑制G/尸基因的表达可显著抑制棉铃虫的生长，并且使棉铃虫对棉酚的耐受性降低。RNA干扰(RNAi)如本文所用，术语"RNA干扰(RNAinterference,RNAi)"是指一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA干预或者干涉。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制。如本文所用，术语"小千扰RNA(smallinterfering:RNA，siRNA)"是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径(RNAinterferencepathway)。在本发明中，所述的RNA干扰的基本原理是以植物作为媒介，使昆虫服食可干扰其基因(如G/尸基因)表达的小干扰RNA(siRNA)，从而抑制昆虫的生长。更具体地，所述的原理为通过转基因的方法让植物体内表达昆虫基因(全长或部分)的双链RNA(dsRNA)，在植物体内加工形成高丰度的siRNA，当昆虫取食这种转基因植物的同时也摄入了大量的siRNA，所述的siRNA在进入昆虫体内后能够抑制所述昆虫基因在昆虫体内的表达，干扰昆虫正常的生长发育甚至引起昆虫的死亡，从而降低昆虫对植物的取食。如图1所示，其中Dicer为脂A酶III样的核酸酶；RISC为RNA诱导的沉默复合物，"间隔"表示间隔序列。利用所述原理，可以有效地改良植物对于昆虫的抗虫性。作为一种优选方式，利用一个内含子序列，两端连接上互补的基因序列，导入细胞后，能产生"颈-环"结构，并且"颈"状部分能够在植物体内被植物加工成约21-25nt左右的小RNA，这种小RNA能特别有效的抑制目的基因的表达。将RNA干扰技术应用到转基因抗虫植物上，开发新型的转基因抗虫植物，对农业的发展具有重大的意义。提髙植物抗虫性的方法基于以上所述的RNA干扰的原理，本发明提供了提高植物抗虫性的方法将表达昆虫基因dsRNA的构建物转入植物细胞、组织或器官中，所述的表达昆虫基因dsRNA的构建物为双链，并且其正链或负链含有以下结构Seq正向一X—Seq反向《I式中，Seq'^为昆虫基因的正向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp;Seq^为同一昆虫基因的反向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp;X为位于Seq^和Seq,M之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq和Seq从而在植物细胞、组织或器官中表达形成式II所示的昆虫基因dsRNA，Seq正向一r人s叫反向7式工工式中，Seq、Seq反^和X的定义如上述，II表示在Seq,f向和Seq反向之间形成的双链RNA氢键。本发明对所采用的昆虫基因没有特别的限制。为了能够使昆虫在服食所述的植物后受到抑制，所述昆虫基因通常为昆虫生长必需的基因或在特定条件下能影响昆虫生长发育的基因。如本文所用，所述的"昆虫生长必需的基因"为在昆虫的生长、发育、代谢、繁殖过程中发挥重要作用的基因(也称为"昆虫生长的重要基因")。所述基因的低表达或不表达将导致昆虫的生长、发育、代谢、繁殖等过程产生异常，甚至导致昆虫的死亡。在用于本发明时，所述的昆虫生长必需的基因是全长基因或基因片段。所述的特定条件比如在有农药或植物抗毒素存在等的情况下。由于昆虫通过口服植物来摄入所述的siRNA，因此，所述昆虫基因优选地为在昆虫的胃或肠中高表达的基因。选择在昆虫的胃或肠中高表达的基因可以一定程度地避免昆虫其它组织或器官的基因的siRNA在行使干扰作用时，受到昆虫体内各种屏障的影响(如被阻断或降解)。作为本发明的优选方式，所述的昆虫基因选自(但不局限于)P450基因(d尸)、或谷胱苷肽-s-转移酶基因("n)。作为本发明的优选方式，本发明优选的昆虫基因的片段的长度至少为50bp，比如可以是60bp、80bp、100bp、200bp、500bp、1000bp。当然也可以采用全长基因。本发明对所采用的间隔序列的长度没有特别的限制，只要在其与正向序列和反向序列形成构建物且被导入到体内后，能够形成式II所示的dsRNA即可。作为本发明的优选方式，本发明所述的间隔序列的长度为80-300bp;更佳地为100-250bp。在本发明中，将所述的表达昆虫基因dsRNA的构建物导入到植物细胞、组织或器官中，并使所述植物细胞、组织或器官生成植物后，在植物体内表达昆虫基因dsRNA，所述dsRNA被加工成siRNA。一般地，所述的siRNA的长度约在21-25nt左右。通常，所述的构建物位于表达载体上。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨节青霉素抗性。包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主可以是任何适合于携带所述表达载体并能够将所述表达载体传递给植物细胞的宿主。优选的，所述的宿主为农杆菌。尽管在本发明的实例中所举例的昆虫为棉铃虫。然而应理解，本发明对于适用于本发明的昆虫没有特别的限制，所述昆虫可以是任何一种能以植物为食的植食性昆虫，比如其可以是鳞翅目昆虫。本发明对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)棉花、烟草、拟南芥、水稻、小麦、玉米、高粱等。作为本发明的一个实例，本发明人利用G/尸基因来制备所述的具有抗虫性的植物(转基因植物)。G/尸基因是一个棉铃虫中肠高表达的基因，该基因开放阅读框包含1578个碱基(bp)，编码526个氨基酸残基，该基因及其蛋白的序列分别见图2A(SEQIDN0:l)和图2B(SEQIDNO:2)。免疫组化和RT-PCR分析表明，d尸是一个棉铃虫中肠高表达的基因。G/尸基因能被外源添加的棉酚类化合物专一诱导，且在棉酚存在的情况下，其表达水平与棉铃虫体重的增加正相关。因此可知，G/尸是一个在棉铃虫取食含棉酚的棉株时起解毒作用的关键基因。将表达含GIP序列的dsRNA载体导入植物中，发现取食这类转基因植物的棉铃虫肠组织中G/尸的转录水平被显著抑制并伴随过氧化氢酶活性的上升。同时由于棉铃虫中肠内的G/尸表达的下调，而使幼虫生长受到抑制，并且对棉酚的耐受性降低。作为本发明的一个优选例，本发明人以^/尸基因为例，构建了dsRNA表达载体，并将之导入植物中，制备转基因植物并喂食棉铃虫。结果发现，在棉铃虫服食所述植物后，生长受到显著抑制。因此，本发明还提供了一种G/尸基因的用途，用于制备抑制棉铃虫生长的制剂或植物。所述的制剂用于下调棉铃虫体内G/尸基因的表达。更优选的，所述的制剂通过抑制G/尸基因的转录来下调棉铃虫体内G/尸基因的表达。例如，所述抑制棉铃虫生长的制剂为含有可下调G/尸基因表达的小干扰RNA(siRNA)的制剂。6^77基因作为本发明的另一个实例，本发明人利用谷胱甘肽-S-转移酶的基因(^ST7基因)来制备转基因植物，以验证RNA干扰机制是否存在。^77基因及其蛋白的序列分别见图2C(SEQIDNO:3)和图2D(SEQIDNO:4)。本发明人以所述的^77基因为例，构建dsRNA表达载体，导入植物中。结果发现，当植物表达棉铃虫G577基因序列的dsRNA后，棉铃虫在取食这类转基因植物后，其中肠内的"n表达水平下调，并且棉铃虫中肠总蛋白中GST的酶活降低(图6)。综上说明，通过植物介导的RNAi在昆虫中是一种普遍存在的机制，并非限于某一种基因。因此，通过用植物表达昆虫dsRNA来抑制植食性昆虫的基因表达的方法可适用于昆虫的多种基因。本发明的主要优点在于(1)以往的RNA干扰方法均是限于对自体基因的抑制，而本发明首次提出可以利用植物作为媒介、通过RNA干扰机制来抑制昆虫的生长。(2)首次发现Gi尸是一个在棉铃虫取食含棉酚的棉株时起解毒作用的关键基因，可通过抑制G/尸的表达来抑制昆虫的生长。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆实验手册(Molecularcloning:Alaboratorymanual，3rded.，Sambrook等，ColdSpringHarborLaboratory,2001)和植物分子生物学实验手册(PlantMolecularBiology-ALaboratoryMannual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例lGIP基因的表达特征1.GIP基因在棉铃虫体内的表达情况为了检测GIP基因在棉铃虫体内的表达情况，本发明人采用RT-PCR方法，检测了G/尸在不同组织中的表达情况。方法如下分别从棉铃虫中肠、脂肪体、马氏管、生殖器、脑组织中抽提mRNA，通过常规的RT-PCR法扩增GIP基因，将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳检测。其中，RT-PCR所釆用的引物如表1所示。表1<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>RT-PCR产物的电泳结果见图3A。图中，1-5依次代表中肠，脂肪体，马氏管，生殖器，脑组织中GIP基因表达情况，以ACTIN(ACT)作为阳性对照。因此可知，GIP基因在棉铃虫的中肠内高表达。2.不同化合物对GIP表达的影响本发明人采用RT-PCR方法检测了不同化合物对GIP表达的影响。方法如下分别用无添加或添加含0.1%的花椒毒素、单宁、反式肉桂酸、棉酚、p-蒎烯、卩-石竹烯、或a—旅烯的人工饲料饲喂长势一致的5日龄棉铃虫l天后，拿出棉铃虫的中肠组织，抽提mRNA，通过常规的RT-PCR法扩增GIP基因，将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳检测，RT-PCR所采用的引物为同前面"1"所述。结果见图3B。图中，1-8依次代表分别用无添加、添加含0.1%的花椒毒素、单宁、反式肉桂酸、棉酚、P-蒎烯、p-石竹烯、a-蒎烯的食物喂食棉铃虫后，其中肠表达GIP基因情况。因此可知，棉酚对GIP的诱导表达具有专一性。3.不同浓度棉酚对于GIP转录水平的影响本发明人用含0.1%或0.2%棉酚的人工饲料喂长势一致的5日龄棉铃虫1天后，RT-PCR(方法同上)检测每一幼虫中肠内的GIP转录水平。结果见图3C-D。因此可见，在棉酚存在下，GIP的表达与棉铃虫的生长密切相关。实施例2G/尸基因的分离将亚洲棉铃虫(^eh'coKe/wa潔'^ra)(约l(fpfu)cDNA文库(ZAPexpress)梯度稀释后，用如下的专一引物作PCR，确定PCR的最低工作浓度GIP2+:5，-GAAGATTTTCTCGATAAGGAAG-3，(SEQIDN0:7);GIP2-:5'-ATATAAAGCACTGTGCCACTAAG-3'(SEQIDNO:8)。将96孔板用70%乙醇浸泡数小时后甩干，紫外灯照射1530分钟，然后在每孔中加入200300filLB(含10mMMgS04/0.2%麦芽糖)。取适当稀释度的库(一千倍稀释)溶液与400filXL1-Blue菌液混匀，37。C振荡培养30分钟左右，在每孔中加入4pl混合物。将平板在37。C培养过夜。扩增后，每列8孔各取5pl菌液混匀，共12列做PCR。再取有扩增条带的列的各孔分别做PCR。选择阳性孔再次做下一轮筛选。经3轮筛选后，将噬菌体铺于LB平皿，挑取单个噬菌斑到500(ilSM溶液中，振荡，PCR鉴定，即获得阳性克隆。对筛选到的阳性克隆进行测序，获得全长基因，该基因的序列的GenBank登录号为DQ986461。实施例3用于构建dsGJ尸，dsG5T7基因的分离以亚洲棉铃虫(#eh'coyepaar肌'古era)cDNA文库(ZAPexpress)为模板，分别用基因专一引物对-用于获得GIP基因片段的引物对GIPF:5，-GAAGATTTTCTCGATAAGGAAG-3，(SEQIDNO:7)，和GIPR:5，—ATATAAAGCACTGTGCCACTAAG-3，(SEQIDNO:8);以及用于获得GST1基因(GenBank登录号EF033109)片段的引物对GSTF:5，-GACCTTGGCAGACCTCAG-3，(SEQIDNO:9)，禾口GSTR:5，-CCAGCTCGAACCACTTTT-3，(SEQIDNO:10);进行PCR扩增，分别得到用于构建&67尸，G^^ST7表达载体的67尸和6^77片段。实施例4表达载体的构建和转化1.35"5V.'a^^尸，355V.'o^J尸，，55V:ote61577表达载体的构建所需构建的dsRNA载体如图4A中pBIdsRNA所示，包括一个35S启动子，一个正向的基因片段(即Sense)，一个拟南芥/7￥基因的内元(即Intron)(约120bp)和一个反向的基因片段(即Antisense)以及NOS的终止子，其是通过用包含Sense-Intron-Antisense的序列取代pBI121载体(如图4A中pBI121所示)上的GUS片段而构建获得。本发明人首先将拟南芥RTM基因(AT2G43730)的内元(约120bp，)用含有Xbal和Notl的特异引物RTM+和RTM-用高保真酶KOD进行PCR扩增，用Xbal和Notl限制性内切酶对PCR产物进行双酶切，克隆到p5S《(购自Clontech公司)的多克隆位点Xbal和NotI之间。用含有Notl和Sacl酶切位点的基因特异引物FGFP+和FGFP--;FGIP+和FGIP-;FGSTl+和FGSTl-用高保真酶KOD，分别以GFP(来源于质粒pCAMBIA1302(参见www.cambia.org/daisy/bios/585.html)，该基因不存在于棉铃虫中)以及实施例3制备的GIP或GST1为模板，进行PCR扩增，克隆相应的GF尸，G/尸和"77片段。再将克隆到的片段用Notl和Sacl进行双酶切，分别插入到含有RTM内元的/^5^载体上的克隆位点0Votl/5aci)之间。同时，用同样的方法用含有Smal和Xbal酶切位点的基因特异引物RGFP+和RGFP-;RGIP+和RGIP-;RGSL+和RGSL-用高保真酶KOD，分别以GFP以及实施例3制备的GIP或GST1为模板，进行PCR扩增，将获得的GFP，GIP，GST1片段克隆到前述插入了正向^尸，6T尸和"H片段的p^Sf的Smal和Xbal之间。将构建好的；i957r/g^^,，/^57r/^67"尸，/^5"A7d/sG5Z载体分别用Smal和Sacl进行双酶切，同时将pBI121(购自Clonetech公司)用Smal和Sacl进行双酶切，分别将酶切下来的dsGFP、dsGIP、dsGSL片段取代pBI121上的GUS，插入到SmaI和SacI之间，从而获得分别携带相应的目的片段的重组表达载体，分别称为.'.'(/s67^，355".:a^G/尸，.:dsG5"n表达载体。前述制备过程中采用的引物如表2。表2<table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.根癌农杆菌的转化根癌农杆菌的转化采用冻融法。一个单菌落LBA4404或GV3]01(均购自Invitrogen公司)，3mlLB培养基(含25Hg/ml利福霉素Rif和50Pg/ml卡拉霉素Kan或庆大霉素Gen)，28°C，220rpra，过夜培养。2ml菌液，50mlLB培养基(25Pg/ralRif和50Pg/ralGen)，28°C，220rpm，培养到0D6。。=0.5(约6小时)。在冰上放置30分钟，4°C，5000g离心5分钟。重悬于10ml0.15MNaCl。4°C，5000g离心5分钟。重悬于1ml20mMCaCl2，50W/管分装，液氮速冻，-7(TC保存感受态细胞。混合含目的基因双元载体和50W/管感受态细胞，在冰上放置30分钟，液氮速冻1分钟。在37。C水浴中5分钟使菌液融化，加1mlLB培养基，28°C，220rpm，培养24小时。取50100Hl涂LB培养基平板(25Pg/mlRif、5(〕Pg/mlGen和50Pg/rnl卡拉霉素Kan或潮霉素Hyg)。实施例5植物转化以及转基因后代的筛选在本实施例中，以烟草和拟南芥的转基因为例，其它植物的转化也可以此为参照。a.烟草的转基因将含目的基因的农杆菌LBA4404过夜培养(2『C培养过夜，至OD,"2.0)。将无菌烟草叶片切割成约0.lcin2大小，浸泡在农杆菌培养液中5-10分钟。用无菌滤纸吸去多余的农杆菌培养液，将浸泡过的烟草叶片铺在1/2MS固体培养基上，暗培养两天。然后，将叶片移至MS(含lmg/L6-BA)固体筛选培养基(Kan、CeD，隔10-15天更换新鲜MS，直至叶片伤口处长出小芽，将新长出的小芽移至不含6-BA的MS培养基，隔10-15天更换新鲜MS，直至其长根后，移至土壤中种植。MS培养基4.4g/LMurashigeandSkoogbasalraedi咖(Sig脆，Cat.M5519)，蔗糖15g/L，0.8%琼脂粉，MES0.5g/L，pH5.7。b.拟南芥的转基因拟南芥植物的转化采用花芽浸泡法(floraldip)(Clough和Bent，1998，PlantJ.16，735-743)。一个含双元载体的单菌落GV3101,3mlLB培养基(25Pg/mlRif、50Pg/mlGen和50Pg/mlKan或Hyg)，28°C，220rpm，12小日寸。2ml菌^夜，50mlLBi咅养基(254g/mlRif、50Pg/mlGen禾口50l^g/mlKan或Hyg)，28。C，220rpm，12小时。50ml菌液，250mlLB培养基(50Pg/mlGen和50Pg/mlKan或Hyg)，28°C，220rpm，12小时。4200rpm(2900g)，15分钟。菌体重悬于500ml含0.02%SilwetL-77的5%蔗糖溶液中。植株花芽部分在菌液中浸泡5秒钟，平放于塑料盆内，保湿，避光，1624小时，然后温室生长至开花结籽。TO代种子在4'C春化24d，用20%漂水(白猫公司，上海)处理15分钟，无菌水清洗34遍。悬于0.5%的琼脂糖(55°0，铺在O.6。/。琼脂的LB培养基(含50Pg/mlKan或Hyg)，22°C，连续光照，约一周后，绿色抗性苗移栽到营养土(泥炭蛭石珍珠岩二1:1:1)中生长。实施例6转基因植物的分子生物学鉴定在本实施例中，选取实施例5获得的T3代纯合株系转基因植物，采用抗生素筛选、Northern杂交对转基因植株进行验证。用于siRNANorthern检测的转膜转膜采用常规方法提取转基因植物的RNA样品，在認A样品中加入10X电泳加样液，混匀，65"放置10min，冰上冷却。电泳使用15%TBE-ureaPAGE胶，lxTBE电泳缓冲液。上样前预电泳5-IO分钟并用电泳缓冲液冲洗泳道，除去上样孔中析出的尿素。每泳道加样量为10-20|ag总RNA，电场强度20V/cm，至溴芬兰染料迁移至凝胶的底部时结束。凝胶在1XTBE中平衡10min。RNA转移采用半干电转移系统(HoferSemi-DryTransferUnits,Amersham，Cat.80-6211-86)。转移条件40raA(约7-8V)，2-4h，Hybond-N+(Amersham，Cat.RPN303B)尼龙膜。尼龙膜经6XSSC溶液短暂漂洗，紫外交联(120mJ)，夹在两层滤纸之间，8(TC烘烤1h，备用。电泳胶储存液15%聚丙烯酰胺(30。/。Acyl/Bis，19:1，华舜，Cat.W443)，8M尿素，1XTBE;15%TBE-ureaPAGE胶(IOmL)::10raL电泳胶储存液，80uL10%过硫酸铵，5uLTEMED，混匀；10XTBE:0.9MTris，0.9M硼酸，20mMEDTA(pH8.0)(Sigma,Cat.T4415);IOX电泳加样液(Ambion，Cat.8546G)。探针标记取25ng纯化PCR产物作为模板标记探针。探针的标记使用Prime-a-GeneLabelingSystem(Promega，Cat.UllOO)。37。C温浴1h。标记探针在沸水中放置5min，立刻置于冰上，备用。预杂交和杂交(采用Clontech的ExpressHyb体系)将尼龙膜放入杂交管中，以6XSSC润湿，保证膜和管壁间没有气泡。倒掉6XSSC，加入5mL杂交液，37'C预杂交60min。预杂交结束后，更换5mL新鲜杂交液，加入探针，混匀，杂交过夜。洗膜与压片杂交结束后，倒出杂交液。在室温下，用2XSSC，0.05%SDS，洗膜两次，每次5分钟，然后用0.2XSSC，0.1%SDS，再洗涤两次，每次20分钟。用保鲜膜包裹，胶带固定，压增感屏和X-ray胶片，-7(TC，2天。胶片用D-72液显影。Northern检测表达含GJ尸，6T^或G577序列dsRNA的转基因烟草和拟南芥的结果见图4B。图4B中，WT表示野生型植物对照，具有印迹的泳道表示对应的植物中含有与相应的基因对应的dsRNA。实施例7检测表达GIP基因的dsRNA转基因植物对棉铃虫的影响取生长一致的三日龄棉铃虫，分别喂以dsGFP(对照)，dsGIP转基因烟草或拟南芥，4-7天后，称重记录，并解剖取中肠。提取RNA，Northern检测G/尸的表达。RNA提取取材料(约100mg)于液氮中充分研磨。转移至L5ml离心管中，加入1mLTrizol(Invitrogen，Cat.15596-018)，混匀，室温放置5min。12,000rpm离心10min，弃取沉淀。上清中加入200"L三氯甲烷，混匀，12,000rpm离心10min。取上清，加入500uL异丙醇沉淀RNA。12，000rpm离心10min，沉淀用70%乙醇洗涤，真空干燥，溶于20-50pLH20(RNasefree)。将RNA用10mMTris-HCl(pH7.5)做适当稀释，测定波长在200nm-300mn之间的UV吸收值。RNA浓度=40ug/mLXA26。X稀释倍数。用于普通Northern的RNA转膜在RNA样品中加入5XRNA样品缓冲液和10X脂A(甲醛)电泳加样液，混匀，65。C放置10rain，冰上冷却。每泳道加样量为15叫总RNA，电泳使用1.1%变性琼脂糖凝胶，lxM0PS电泳缓冲液，电场强度8V/cm。电泳至溴芬兰染料迁移至凝胶的2/3时结束。用ddH20漂洗凝胶，并用20xSSC平衡40min。加筑转移平台，以20xSSC为转移缓冲液，利用毛细管法将RNA转移到Hybond-XL(Amersham，Cat.RPN303S)尼龙膜上(约18h)。转移结束后，用铅笔在膜上标记出加样孔的位置，并剪去膜的左上角作为标记。膜经6XSSC溶液短暂漂洗后，紫外交联(120mj)，夹在两层滤纸之间，8CTC烘烤2h，密封保存备用。杂交过程与前述siRNA的Northern检测一致。结果显示，进食dsGIP拟南芥^AG/尸-(即通过实施例6中图4B监测到的dsGIP转基因拟南芥中的第3个株系)或烟草厨&W尸-2(即通过实施例6中图4B监测到的dsGIP转基因烟草中的第2个株系)的棉铃虫相对于进食dsGFP拟南芥j^^尸尸(gp:通过实施例6中图4B监测到的dsGFP转基因拟南芥中的第5个株系)或烟草戲&^)。(即通过实施例6中图4B监测到的dsGFP转基因烟草中的第2个株系)的棉铃虫(对照)，其中肠内^T尸的转录被抑制，并且生长缓慢，详见图5和图6。图5A为Northern检测三日龄进食^c^/尸-3拟南芥两天后的棉铃虫中肠内含GIP序列的小RNA，泳道1和泳道2分别为进食JMsft^和^WsC/尸-^的棉铃虫。可见，进食后棉铃虫中肠内含有大量的GIP小RNA分子。图5B为Northern检测三日龄棉铃虫进食不同的表达ds認A的转基因植物4天后，中肠内GIP基因的转录变化。其中，在进食拟南芥的棉铃虫的GIP基因的RNA(图中称为GIP)检测结果中，泳道1、2、3、4、5分别代表进食/1^/s^F和进食图4B中所指的dsGIP转基因拟南芥中的第2，3，4，5个株系的棉铃虫的中肠内GIPRNA检测结果，图中，RNA代表对照(即18sRNA)。在进食烟草的棉铃虫的GIP检测结果中，泳道l、2、3分别代表进食野生型烟草和厨(/W尸尸及图4B中监测到的dsGIP转基因烟草中的第2个株系的棉铃虫的中肠内GIPRNA检测结果。可见，进食含dsGIP的植物后，棉铃虫肠内GIP的转录发生大大下降。图5C为三日龄棉铃虫分别喂以^AG/，^&G/尸-3四天后的平均体重增加(叩er)以及Northern检测中肠内GIP基因的转录变化，其中，测试I、II、III分别代表三次独立的饲喂实验。可见，在喂食^AG/尸-J后，体重的增加明显慢于喂食AAG尸尸的情况。并且，进食^AGJ尸-3后，棉铃虫肠内GIP的转录明显低于喂食^&GF尸的情况。图5D为三日龄棉铃虫分别喂以脸&W尸，厨&d尸-2四天后的平均体重增加(uper)以及Northern检测中肠内GIP基因的转录变化，其中，测试I、II、III分别代表三次独立的饲喂实验。可见，在喂食脸(^^T尸-^后，体重的增加明显慢于喂食脸^^P的情况。并且，进食vVWs67"尸-2后，棉铃虫肠内GIP的转录明显低于喂食A^/W/^的情况。图5E为免疫组化分析进食yVW5677Ys-c入y^^67"尸-^(V-"烟草四天后，中肠内GIP蛋白的分布情况。其中，a、b、c或d、e、f分别代表不同个体的检测结果。可见，进食含dsGIP的烟草后的棉铃虫其中肠内的GIP蛋白分布较少。图5F为Northern分析三日龄棉铃虫进食厨&6^尸(1)7W^W/尸-i"(2)烟草后第l，2，4天时，中肠内GIP的转录水平。可见，随着时间的延长，进食tVWW//7-2的棉铃虫的中肠内GIP的转录水平越来越低；而进食A^/W/的棉铃虫的中肠内GIP的转录水平变化不大。图5G为三日龄棉铃虫进食厨AWP(黑色柱体)浙脸&d尸-2(白色柱体)烟草后第2，4天时的平均体重增长。可见，进食2后的棉铃虫的体重增长明显低于进食W&"F尸的情况。图5H为三日龄棉铃虫进食B^^F尸(黑色柱体)^7^A67尸-3(白色柱体)拟南芥4天和7天时的体重增加(叩er)和Northern分析其GIP的转录水平(down)。可见，进食"c^;/尸-J后的棉铃虫的体重增长明显低于进食射&G尸尸的情况。并且，进食"&67P-3后，棉铃虫肠内GIP的转录明显低于喂食^&C尸的情况。表达含GST1基因的dsRNA转基因拟南芥c/W577-5(即通过实施例6中图4B监测到的dsGSTl转基因拟南芥中的第5个株系)对棉铃虫的影响见图6。图6A为Norther检测五日龄生长一致的棉铃虫进食含lrag/g棉酚的人工饲料1天后，中肠内GST1基因的表达变化。其中，泳道1和2分别为进食无添加或添加lmg/g棉酚的人工饲料后的棉铃虫。可见，棉酚对棉铃虫中肠内GSTl基因的表达没有显著的影响。图6B为Northern检测三日龄生长一致的棉铃虫进食^&C尸(泳道l)和5(泳道2)的转基因拟南芥4天后，中肠内GST1基因的表达变化。其中测试I，II分别表示两次独立的饲喂实验。可见，GST1基因的表达也受到GST1相应的siRNA的干扰。因此，通过植物介导的RNAi在昆虫中是一种普遍存在的机制。实施例8检测表达GSTl基因的dsRNA植物对棉铃虫的影响取生长一致的三日龄棉铃虫分别喂以^^尸(对照)，d^^77转基因拟南芥四天后，称重记录，并解剖取中肠。分成两部分，一部分提取RNA，Northern检测"77的表达。另一部分提取总蛋白检测GST酶活。蛋白提取棉铃虫中肠总蛋白的提取将中肠组织用液氮充分研磨后，加入适量预冷PBS，充分混匀，用8层纱布过滤后，离心(10,000rpra，10min)。取上清，用Bradford比色法测定蛋白浓度后，进行酶活分析。GST酶活测定按南京建成生物工程研究所提供的谷胱甘肽-s转移酶测定试剂盒说明书操作。测定原理谷胱甘肽+1氯-2，4-二硝基苯-谷胱甘肽二硝基苯复合物+盐酸GST+C6H3(N02)2CL④C6H3(N02)2GS+H++CL-GST具有催化还原型谷胱甘肽(GSH)与1氯-2，4-二硝基苯(CDNB底物)结合的能力，在一定反应时间内，其活性高低与反应前后底物浓度的变化呈线性关系。对棉铃虫中肠内的GST酶活测定结果见图6C。可见，在服食了&^577转基因拟南芥后，棉铃虫中肠内的GST酶活发生显著下降。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表〈110〉中国科学院上海生命科学研究院<120>利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法<130>067076<160>24〈170〉Patentlnversion3.3<210>1<211〉1904<212>DNA<213>棉铃虫(〃e7/co卿san/u>e/"a)<400〉1ggcacgaggcgaagcttcaccatgatcacttcattgctactaacggcagtttttgtgata60atcttcacaatctacctcgtgtccaagaaaaagtaccaatactgggagaaaaggaaagta120ccacatttacctccggttcctctcctgggaaattttgggaactttatcctgc卿ggcaa180tttcttggctacacattacaacaaatatgtggaaagtttcccaacgtaccatacgtgggt240gcctattttggcacagaacctgccctgatcgtccaagatcctgaacacatcaagctcgtc300atgactaaggacttctacttcttcagttcccgtgagatatctgaatatgccgacagggaa360aggtttactcagaacctcttctccacttccggaaacaaatggaaggtgttacgtcagaac420ctgactccagtgtttacctccgcga卿tg幼g33C3tgttccatttgatcgaaaagtgt480tctcacgtgttcgaagattttctcgataaggaagccaaaagc肌cgaggtcga肪tgagg540gctcttgtagcgagatacactatggactgcataggaacctgtgcatttggcgttgaaaca600aaaaccatgaatgtgacggaaaataatccgtttacagcagtaggtaacagcattttcatg660ttaagccgggtccaaggatttaaatttgttUgagaggtatctacccttcacttttctac720ttgttgggattcagaactcttccaccagaagttaatgcattcttctccaatttaatgact780ctatacgcccacatctcggaatgactttgtcgatttcgta840ttgaagtggaggggacagtcgaaatatgat900tcacagaa幼aagtgactttagaagtcgacgatgatctcttagtggcacagtgctttata960ttttttgctgctggatatgaaacttcggccaccactttgagttttactttgtatgagttg1020gcgaaacacccagaagctcaga卿gagctatagccgELggtggacgattatctgcggcga1080cac犯caatgagctgaagtacgagtgcctttcggagatgccatttgtagaagcgtgcttt1140gatgagactcttCgt￡L￡l￡Ltatccagttttaagtttgttaactcgcgaagtggtag鄉at1200tacactttcccttcgggattg犯ggt卿gaaaggtctccgtatattcctgcctctgtat1260cacttgcaccataacccggagttcttcccggatccggaggagtataggcctgagcggttc1320ctgcctgagaaataaagccgtacacgtacatgcccttcggtgaaggcccg1380agactttgtattggaatgagattcgcgaaaatgcaaatgaccgctggaataataactttg1440ctgaaaaaataccgtttggaactggctccagggatgccccatttgaacct1500aattcttttgtctcgcaagttgCggg3gg￡Latcaatctgaagatgataa^aagagaaagt1560tgggaaggaagactactgaagaacctcgaaaaggcatattaaaaaatttgacgttcagtt1620gtatgactaatcataattacgctttatgtctggact.atcatcacgtagca1680cttatcacgcgatagcaaattataaatagcattgattacatgattgattt1740ttttttaaattaMatttagattgattagc111taaaaattgtgtcaaatatgttaaatt1800tgaaatgtcgttataagttgacagtaaagtagcagtaaaagtUUttttttagcgcatt1860taaataaaagcttgtttttaaaaaaaaaaa肌犯1904<210>2<211〉526<212>PRT<213>棉铃虫(AWj'coK，anw'g&ra)<400>2<sequence>complexsequenceseeoriginaldocumentpage23</sequence>340345350ArgHisAsnAsnGluLeuLysTyrGluCysI-euSerGluMetProPhe355360365ValGluAlaCysPheAspGluThrUuArgLysTyrProValLeuSer370375380LeuLeuThrArgGluValValGluAspTyrThrPheProSerGlyLeu385390395400LysValGluLysGlyLeuArgliePheLeuProLeu丁yrHisLeuHis405410415HisAsnProGluPhePheProAspProGluGluTyrArgProGluArg420425430PheLeuProGluAsnLysAspLyslieLysProTyrThrTyrMetPro435440445PheGlyGluGlyProArgLeuCyslieGlyMetArgPheAlaLysMet450455460GinMetThrAlaGlylielieThrLeuLeuLysLysTyrArgLeuGlu465470475480LeuAlaProGlyMetProGinAsnlieGluPheGluProAsnSerPhe485490495ValSerGinValAlaGlyGlylieAsnLeuLysMetlieLysArgGl'u500505510SerTrpGluGlyArgLeuLeuLysAsnLeuGluLysAlaTyr515520525<210〉3<211〉840<212>DNA〈213>棉铃虫(〃eh'co，aanzu'gera)<400〉3ggcacgaagggcgaatcacagtgtgagatagaacaattcagaatgtccttagacttgtat60tacgcccctgggtcggcaccgtgccgagtggtcctgctcgtagcagcagccctcgacgtc120cattttaatccccacatcttaaacttaagaaatggcgaacacctcacaccagaatttttg180aagctgaatccccaacacacagtgcccacactagtcgacggcgacttctctctatgggag240tcgagagccatcggcaaatacttggtgaacaaatatggcggcgagaacaacgacttgtat300cctagtgatcctaaagccagggcgatcgtcgaccagagactagacttcgacttggga.acg360ctttacccaagatttggaaactacatctatcctcaaatcttcggtggagcga幼gcagat420gaggctctgctcaagaagctggaggaagctctgcacttcctcaacacattcctcgaaggt480cagaagtacgctgcgggtgacaaactgaccttggcagacctcagtctcgtggcgactgtg540tccactatagacgccgtcgacatcagcctgaaggaatatcccaatgttgaaaagtggttc600gagctggtgaaagcgactgccccgggataccaggaagcaaatgaagctggccttaaagca660ttcagagctatggtagcgcagttaaaagctaaaactgaattgtaagtgtagcagcataat720gcaatattgtatttagaggtacagaagtaagagagcatttgctcgcagtataatagtaat780actcgcattttgtaagaaattgtcgttaagtaaaaatatttatatttgaaaaaaaa肪aa柳<210〉4〈211〉220<212>PRT<213>棉铃虫(Helicovepaarmigera)<400〉4MetSerLeu1ValLeuLeuLeuAsnLeu35AsnProGin50TrpGluSer65GluAsnAsnAspGinArgAsnTyrlie115LeuLeuI一ys130GluGlyGin145SerLeuValLysGluTyrAlaProGly195AlaMetVal210AspLeuTyrTyr5ValAlaAlaAla20ArgAsnGlyGluHisThrValPro55ArgAlalieGly70Aspl>euTyrPro85LeuAspPheAsp100TyrProGinlieLysLeuGluGlu135LysTyrAlaAla150AlaThrValSer165ProAsnValGlu180TyrGinGluAlaAlaGinLeuLys215AlaProGlySerAlaProCysArgVal1015LeuAspValHisPheAsnProHislie2530HisLeuThrProGluPheLeuLysLeu4045ThrLeuValAspGlyAspPheSerLeu60LysTyrLeuValAsnLysTyrGlyGly7580SerAspProILysAlaArgAlalieVal9095LeuGlyThr:LeuTyrProArgPheGly105110PheGlyGlyAlaLysAlaAspGluAla120125AlaLeuHisPheLeuAsnThrPheLeu140GlyAspLysLeuThrLeuAlaAspLeu155160ThrlieAspAlaValAsplieSerLeu170175LysTrpPheGluLeuValLysAlaThr185190AsnGluAlaGlyLeuLysAlaPheArg200205AlaLysThrGluLeu220<210〉5<211>21<212〉DNA〈213〉人T.序列<220><221>misc—feature<223>引物<400>5gtgctttgatgagactcttcg21〈210〉6<211>23<212〉DNA〈213>人T序列<sequence>complexsequenceseeoriginaldocumentpage26</sequence><220〉<221>misc—feature<223〉引物<400>10ccagctcgaaccactttt18<210〉11<211>32〈212〉■<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223>引物<400〉11ccctctagaacgttgtaagtctgatttttgac32<210〉12<211〉32<212>隨<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400>12cccgcggccgctctatctgctgggtccaaatc32<210>13<211>31<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>tnisc一feature<223>引物<400〉13cccgagctcgaagattttctcgataaggaag31〈210〉14<211>34<212〉DNA<213>人T序列<220〉<221〉misc一feature<223>引物<400>14cccgcggccgcatataaagcactgtgccactaag34<210〉15<211>31〈212>DNA<213〉人.T序列<220><221>misc—feature<223〉引物<400〉15ccccccggggaagattttctcgataaggaag31<210>16<211>32<212>DNA<213〉人工序列<220〉〈221〉misc—feature<223〉引物<400>16ccctctagaatataaagcactgtgccactaag32<210〉17<211>27<212〉腿<213〉人工序列〈220><221〉misc—feature<223>引物<400>17cccgagctccgatttc卿gaggacgg27<210〉18<211〉30<212>DNA<213>人工序列<220〉〈221〉ndsc—feature<223〉引物<400〉18cccgcggccgcccatgccatgtgtaatccc30<210〉19〈211〉27<212〉DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223〉引物<400>19ccccccgggcgatttcaaggaggacgg27<210>20<211〉28<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉引物<400〉20ccctctagaccatgccatgtgtaatccc28<210>21<211〉27<212>薩<213>人工序列<220〉<221>misc_feature<223>引物<400〉21cccgagctcgaccttggcagacctcag27<210>22<211〉29<212〉DNA〈213>人T序列<220>〈221>misc—feature<223>引物<400>22cccgcggccgcccagctcgaaccactttt29<210>23<211〉27<212>DNA<213>人T.序列<220〉<221>misc一feature<223〉引物<400>23ccccccggggaccttggcagacctcag27〈210〉24<211〉27<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400>24ccctctagaccagctcgaaccactttt2权利要求1.一种提高植物抗虫性的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤将表达昆虫基因dsRNA的构建物转入植物细胞、组织或器官中，所述的表达昆虫基因dsRNA的构建物为双链，并且其正链或负链含有以下式I结构Seq正向-X-Seq反向式I式中，Seq正向为昆虫基因的正向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；Seq反向为同一昆虫基因的反向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，从而在植物细胞、组织或器官中表达形成式II所示的昆虫基因的dsRNA，id="icf0001"file="A2006101190290002C1.gif"wi="28"he="12"top="111"left="73"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>式II式中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的氢键。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的构建物位于表达载体上，所述的表达载体还包含能在植物中转录的启动子。3.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述昆虫基因是昆虫生长必需的基因，或在特定条件下能影响昆虫生长发育的基因。4.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述昆虫基因是在昆虫的胃或肠中表达的基因。5.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的植物选自双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。6.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的昆虫选自植食性昆虫。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的间隔序列的长度为80-300bp。8.—种昆虫基因dsRNA的用途，其特征在于，用于制备具有抗虫性的植物。9.一种植物细胞，其特征在于，所述的植物细胞中含有表达昆虫基因dsRNA的构建物，所述的表达昆虫基因dsRNA的构建物为双链，并且其正链或负链含有以下式I结构-Seq正向—X—Seq反向I式中，Seq^为昆虫基因的正向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp;Seq^为同一昆虫基因的反向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp;X为位于Seq和SeqM之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq^和Seq从而在植物细胞中表达形成式II所示的昆虫基因dsRNA，Seq正向Seq反向式工工式中，Seq^、Seq^和X的定义如上述，II表示在Seq正向和Seq^之间形成的氢键。10.—种G/尸基因的用途，其特征在于，用于制备抑制棉铃虫生长的制剂或植物。全文摘要本发明公开了提高植物抗虫性的方法，通过转基因的方法让植物体内表达昆虫基因的dsRNA，在植物体内加工形成siRNA，藉由植食性昆虫取食进入到昆虫体内，对靶基因进行RNA干扰，从而抑制靶基因的表达。本发明首次公开了可以利用植物作为媒介、通过RNA干扰机制来抑制昆虫的生长，提供了提高植物抗虫性的新方法。文档编号C12N15/09GK101195821SQ200610119029公开日2008年6月11日申请日期2006年12月4日优先权日2006年12月4日发明者林芝萍,毛颖波,王凌健,陈晓亚申请人:中国科学院上海生命科学研究院