专利名称：一种结核杆菌重组卡介苗的制作方法
技术领域：
本发明属医药技术领域，具体涉及一种新型的重组卡介苗。
背景技术：
结核分枝杆菌是引起人类和动物结核病的病原菌，由于其独特的生物特性，如细胞壁厚、生长周期长、多为潜伏感染和易于耐药等特点使结核病药物治疗面临很大的困难。虽然在上世纪上半叶，已成功的研制出预防结核病的卡介苗(BCG)，以及治疗结核病的特效药物(如异烟肼，利福平等)，但到了上世纪末，结核病仍然是全球感染和传染病的第一“杀手”。而且随着艾滋病(HIV)在全球的肆虐，以及结核多重抗药菌株(multi-drug resistantstrains)的出现等诸多原因，使得治疗结核病的形势更加严峻。
目前研制成功的唯一的能够预防结核病的疫苗——卡介苗，虽然已在全球范围内广泛使用，但在近期研究中发现，其许多临床试验结果并不是十分有效，免疫预防效果不稳定，在全球范围的免疫保护力检测，由0-80％不等，并且对成人几乎无效，对已感染患者更是没有治疗作用，因此就要求人们研究新型结核疫苗来代替BCG。研制新型疫苗的目的就是要在天然免疫过程中刺激更有效的免疫反应来控制疾病的发生而不仅仅是刺激免疫反应，这些疫苗应尽可能的延长无症状感染的持续期，这样就可以在结核发病期或是结核杆菌再次感染过程中延缓疾病的发生。
现阶段研究结核病疫苗主要集中在以下几个领域1.以BCG为载体，重组进新基因的重组BCG。
2.营养缺陷型结核减毒活疫苗。
3.结核亚单位疫苗。
4.结核DNA疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提出一种免疫效果稳定的新型结核杆菌重组卡介苗，并提出该疫苗的制备方法。
本发明提出的结核杆菌重组卡介苗为rBCG-Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4。
虽然卡介苗在临床的使用已经超过了半个世纪，但是由于其免疫保护效果在不同地区存在着明显的差距.为了避免BCG的这些缺陷，可以利用结核杆菌的具有免疫保护效果的蛋白质抗原重组入BCG中，从而增强卡介苗的免疫保护力。
实验结果一再证明，结核杆菌的活菌苗对动物的免疫保护力要明显高于死菌苗，这是因为结核杆菌分泌到菌体外的抗原在结核感染的初期阶段能被第一类辅助性T细胞(Th1)所识别而诱发有效的免疫保护反应.这个结果对亚单位疫苗抗原的选择提供了方向.由于抵抗结核杆菌的侵袭，主要依赖巨噬细胞内的抗原特异性T细胞的活化，以及IFN-γ途径的激活.所以如何发挥细胞内这两方面的作用，也就成了本发明选择抗原的依据.
本发明所选用的重组进入卡介苗的结核抗原Agg5B，Mpt64，Mtb8.4就属于这样的抗原。
Ag85B(SEQ.ID.NO1)属于结核杆菌抗原85复合物家族成员.该家族是一类纤维结合素结合蛋白，是结核杆菌ST-CF(short-term culture filtrates短期培养物的过滤后蛋白质)中早期的主要分泌性蛋白质.已被证明是一种潜在的毒力因子，可以特异结合纤维结合素及宿主体内细胞外基质蛋白，从而增强病原体的毒力.实验证明Agg5B基因是重要的结核杆菌免疫保护性抗原.将其免疫小鼠，都获得了明显的特异性体液和细胞免疫反应.在用气雾攻击结核杆菌H37Rv毒株后，均获得了接近BCG的免疫保护力.
(引自1.Patti，J.M.，B.L. Allen，M.J.McGavin，and M.Hook.1994.MSCRAMMmediatedadherence of microorganisms to host tissues.Annu.Rev.Microbiol.48585-617.VOL.68，2000DISRUPTION OF fbpA AND fbpB IN M.TUBERCULOSIS 7772.Ratliff，T.L.，R.McCarthy，W.B.Telle，and E.J.Brown.1993.Purificationof a mycobacterial adhesin for fibronectin.Infect.Irmmun.611889-1894.
3.Ratliff，T.L.，J.A.McGarr，C.Abou-Zeid，G.A.Rook，J.L. Stanford，J.Aslanzadeh，and E.J.Brown.1988.Attachment of mycobacteria to fibronectin-coated surfaces.J.Gen.Microbiol.1341307-1313.
4.李忠明当代新疫苗)Mpt64(SEQ.ID.NO2)是结核杆菌的分泌性蛋白质，也是结核杆菌ST-CF中的主要成分，可以占到结核杆菌培养基上清滤过液中蛋白质总量的8％.相对分子质量24KDa，既能刺激细胞免疫反应，又能诱导体液免疫反应.由Mpt64蛋白的免疫原性表位中，本发明选取了其(190～198)这段多肽为H-2D(b)限制性的CD8+T细胞表位.因为加入激活特异性的CD8+T细胞抗原成分可以提高疫苗的整体保护率(引自1.柏银兰，薛莹，李元，徐志凯，师长宏，张海；结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的免疫学特性；第四军医大学学报(J Fourth Mil Med Univ)2004；25(13)2.Harboe，M.，S.Nagai，M.E.Patarroyo，M.L.Torres，C.Ramirez，and N.Cruz.1986.Properties of proteins MPB64，MPB70，and MPB80 of Mycobacterium bovis BCG. Infect.Immun.52293-302.
3.李忠明当代新疫苗)。
Mtb8.4(SEQ.ID.NO3)一种低分子量的T-细胞抗原.来源于结核杆菌滤过后培养物(culture filtrate)，是结核杆菌潜伏感染期的T细胞免疫反应性抗原．能够激起Th1型细胞反应，刺激高水平的IFN-Y的分泌.(引自李忠明当代新疫苗)本发明提出的重组BCG为rBCG-Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4，它是由ag85B基因mpt64的190-198位的氨基酸序列所对应的核酸序列以及mtb8.4基因连在一起，克隆进原核生物一结核分枝杆菌穿梭质粒中，将带有重组基因的穿梭质粒通过电击转化到BCG中，而获得重组BCG。
具体步骤如下ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4和Mag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4的构建首先设计引物扩增mpt64(190-198)-mtb8.4(简称8.4f)，(引物由DNA的5’端-3’端)上游ACAGTCGAC ATGAGGCTGTCGTTGAC(SEQ.ID.NO2)说明双下划线代表编码Mpt64(190-198)肽段的基因.
单下划线代表Sal I酶切位点下游GCGAAGCTTTTAATAGTTGTTGCAGGAG(SEQ.ID.NO5)说明单下划线Hind III酶切位点以结核杆菌标准毒株H37Rv(上海市肺科医院提供)DNA为模板，用以上两条引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后，用Sal I和Hind III双酶切，克隆构建在质粒PET28a(+)(市售)中。
其次扩增ag85B全长基因(ag85B)和成熟肽基因(Mag85B)上游TGGCCAATGACAGACGT(SEQ.ID.NO6)说明单下划线代表Bal I酶切位点下游ATAGTCGACGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG(SEQ.ID.NO7)说明单下划线代表Sal I酶切位点去掉信号肽的ag85B基因上游引物CGAATTCTTCTCCCGGCCGGGGCT(SEQ.ID.NO8)说明单下划线代表EcoR I酶切位点SEQ.ID.NO6和SEQ.ID.NO7组成ag85B全长基因，SEQ.ID.NO8和SEQ.ID.NO7组成ag85B成熟肽基因。
将扩增的mpt64(190-198)-mtb8.4分别和ag85B全长基因以及成熟肽基因经酶切，连接后，形成重组新基因(ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4和Mag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4)，测序表明所插入序列和Gene Bank中H37Rv结核全基因组相应基因序列完全一致。
将重组好的基因ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4，克隆到原核生物一结核分支杆菌穿梭质粒PMV261(图4)，制备BCG感受态细胞，将带有重组基因的穿梭质粒通过电击转化到BCG中，形成重组BCG。重组BCG经由western-blot(图6)检测后，证明重组基因确实已转入到BCG中。
将重组BCG免疫C57/BL小鼠，对重组BCG进行一系列的免疫水平检测，包括运用ELISPOT方法对IFN-γ水平进行检测，ELISA方法检测IgG(H+L)，IgG1，IgG2a等抗体水平，并与BCG进行比较。
本发明将结核分枝杆菌三种具有明显免疫保护力的抗原基因连接在一起，形成新的重组基因.这种组合不是简单的叠加组合，而是选用Ag85B蛋白的基因与具CD8+T细胞表位的一段Mpt64抗原的肽段还有Mtb8.4抗原基因连接在一起，在大肠杆菌载体内进行克隆，并通过原核生物-结核分支杆菌穿梭质粒转入到BCG中，形成重组BCG。初步实验表明用这种重组BCG免疫的小鼠与用普通BCG免疫的小鼠相比，在细胞因子分泌水平上要好于BCG，而在抗体水平上，两者则相差不大。可见，该重组BCG将成为优于BCG的新型抗结核杆菌疫苗。
图1Ag85B基因克隆进大肠杆菌载体PET28a(+)。
M代表Marker1.质粒PET-28a-(+)2.ag85B基因组入质粒PET-28a(+)3.PET28a(+)质粒经酶切后产物4.PET28a(+)-ag85BPCR产物。
图2.mtp64(190-198)-mtb8.4基因克隆进质粒PET28a(+)中。
图3重组基因ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4克隆进入PET28a(+)质粒。
图4原核生物-结核分支杆菌穿梭质粒PMV261。
图5重组基因转入到穿梭质粒PMV261中。
图6Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4融合蛋白纯化。
M代表Marker1-3杂蛋白漂洗4-5目的蛋白洗脱。
图7 western方法检测重组BCG。
图8 ELISOPT方法检测检测IFN γ水平。
图9 ELISA方法检测抗Ag85B IgG(H+L)水平。
AMMAg85B-Mpt64190-198-Mtb8.4。
图10 ELISA方法检测抗Ag85B IgG1水平。
AMMAg85B-Mpt64190-198-Mtb8.4。
图11 ELISA方法检测抗Ag85B IgG2a水平。
AMMAg85B-Mpt64190-198-Mtb8.4。
具体实施例方式
1.重组基因ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4和Mag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4的构建1)首先设计引物扩增mpt64(190-198)-mtb8.4(简称8.4f)，上游ACAGTCGAC ATGAGGCTGTCGTTGAC说明双下划线代表编码mpt64(190-198)肽段的基因．单下划线代表Sal I酶切位点下游GCGAAGCTTTTAATAGTTGTTGCAGGAG说明单下划线Hind III酶切位点以结核杆菌标准毒株(H37Rv)DNA为模板，用以上两条引物进行扩增，PCR反应条件如下98℃预变性5分钟；98℃变性45秒，62℃复性45秒，72℃延伸2分30秒，30个循环；72℃延伸12分钟。PCR产物经纯化后，用Sal I和Hind III双酶切，克隆构建在质粒PET28a(+)中．2)扩增ag85B全长基因(ag85B)和成熟肽基因(Mag85B)上游TGGCCAATGACAGACGT说明单下划线代表Bal I酶切位点下游ATAGTCGACGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG说明单下划线代表Sal I酶切位点去掉信号肽的ag85B基因上游引物CGAATTCTTCTCCCGCCCGGCGCT说明单下划线代表EcoR I酶切位点以结核杆菌标准毒株(H37Rv)DNA为模板，用以上两条上游引物分别和下游引物进行扩增，PCR反应条件如下98℃预变性5分钟；98℃变性45秒，62℃复性45秒，72℃延伸2分30秒，30个循环；72℃延伸12分钟。PCR产物经纯化后，分别用Bal I和Sal I双酶切以及EcoRI和SalI双酶切，克隆构建在质粒PET28a(+)中。
3)将扩增的mpt64(190-198)-mtb8.4分别和ag85B全长基因以及成熟肽基因经酶切，连接后，形成重组新基因(ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4和Mag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4)，蛋白的制备(利用重组基因Mag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4)活化菌体，移入1升培养基中摇2-3h经IPTG(1mM)37℃诱导4h，10000rpm离心10’，分别将上清进行SDS-PAGE电泳检测，结果没有发现所需的目的重组蛋白，说明目的蛋白是以包涵体形式存在于沉淀中.利用传统的Ni-NTA Hisbind树脂柱进行分离纯化，效果不好，杂蛋白的洗脱效果不明显.于是用下列方法对包涵体进行分离.
菌体沉淀用不加尿素的bufferB溶解(不加尿素的bufferB0.1MNaH2PO4，0.01MTris-Cl，PH8.0)经超声破碎(超声破碎1s，间隔一秒，持续时间0.5h，超声功率不超过300w)，10000rpm，离心40min，沉淀重悬于6M尿素中(PH8.5)，4℃，10000rpm离心15min，沉淀用含8M尿素的bufferB溶解，离心后取上清.电泳结果显示，目的蛋白已经得到分离.将上清装入透析袋中，分别用6M，4M，2M，1M，0.5M尿素洗液(每种尿素洗液中均含5mMTris-Cl)各洗一次，最后用0M尿素(含Tris-Cl 0.6057g)洗两次，将透析液用30KD的超滤管10000rpm，40min离心收集.
2、重组BCG的构建1)将重组好的基因ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4，克隆在原核生物-结核分支杆菌穿梭质粒PMV261中，通过电击转入到BCG中。
a.BCG感受态细胞的制备在7H9培养基中(干粉0.49g，甘油0.2ml，Tween800.05ml水90ml，121℃灭菌10min后，待培养基冷却至45℃左右，加入ADC10ml，从而配成100ml培养基)培养BCG(约2-3周)，将培养好的BCG冰浴1小时后，6000rpm(4000g)，4℃离心10min收集菌体；菌团用预冷的10％甘油洗3-4次，重悬于10％的甘油中。
b.电击转化BCG取200μl BCG感受态细胞，加入50μl重组质粒，冰浴30min，小心地将菌液转入预冷的2mm电穿孔杯中，电转条件是电压1.25kV，电容25μF，电阻1000欧姆。电转后，冰浴10min后，与等体积的2×7H9培养基混合，37℃静止培养1天。
2)将静止培养一天的重组BCG涂在含有卡那抗性(卡那霉素终浓度为15μg/ml)的7H10固体平板上(干粉4.9g，甘油0.5ml，水90ml，121℃灭菌10min后，待培养基冷却至45℃左右，加入ADC10ml，从而配成100ml固体培养基)，37℃倒置培养。
2、重组BCG的鉴定1)培养好的重组BCG经由热诱导，即45℃水浴1h，后在37℃烘箱放置1h，再在45℃水浴1h后，37℃过夜。将热诱导过夜的重组BCG，12000rpm离心15min后，收集培养上清；沉淀用dH2O处理重悬后，超声(超声步骤超声时间1s，间隔时间2s，超声次数90次)，离心收集超声上清。
2)Western-blot检测首先将上步骤得到的经过热诱导处理过的菌体培养上清，超声上清，超声沉淀在Tris-Gly系统下进行蛋白电泳，电泳结束后，剪好PVDF膜(大小要正好能够包含胶上所有样品)，并在甲醇溶液浸湿后，与取下的胶，以及海绵，滤纸，western板子均放入转移缓冲液(3.03gTris，14.4g甘氨酸，200ml甲醇，加水至1L)中15-30min，从下到上依次按照western负板(黑色)，海绵，四层滤纸，胶，膜，四层滤纸，海绵，western正板(白色)顺序，在缓冲液中仔细的摆好，注意不要出现气泡。装好western装置，并将其放在冰上，恒压100v，1h或恒流400mA，2h。结束后，取下膜，并将其放入封闭液(100mMTris-HCL，0.9％NaCL，0.1％Tween20，5％脱脂奶粉，pH7.5)4℃过夜。一抗(兔抗Ag85B蛋白)用10ml封闭液稀释1000倍后，将膜放入含有稀释一抗的封闭液中，37℃ 1h。TTBS(100mMTris-HCL，0.9％NaCL，0.1％Tween20，pH7.5)洗膜4次，每次5min。将二抗(碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG)用封闭液以1∶5000稀释，37℃，1h，TTBS洗膜4次，每次5min；最后用PBS洗15min，加入碱性磷酸酶显色液显色。
3、鉴定好的重组BCG进行菌落计数a)鉴定好的重组BCG的收集将菌体经过10000rpm，5min离心收集，菌体沉淀用20％的甘油洗2-3次后，用20％甘油重悬沉淀，分装入EP管中。
b)菌落计数将上述用20％甘油重悬的菌体分别以20倍，400倍，8000倍，16000倍稀释，稀释好之后，均匀涂布在含有卡那霉素抗性的7H10固体平板上，37℃倒置培养。
4、计好数的重组BCG与普通BCG免疫C57BL小鼠免疫计量106cfu，免疫时间3周，5、检测用BCG和重组BCG免疫后的小鼠的细胞免疫和体液免疫水平。
a)细胞免疫水平的检测运用ELISPOT方法对细胞因子IFNγ进行检测将经过BCG和重组BCG免疫3周后的小鼠，先进行眼眶取血后，脱颈处死；取出小鼠脾脏，在200目筛网上研磨后，PBS(NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4-12H2O 1.923g；KH2PO40.24g，配成1L溶液，pH7.4)重悬后，加入等体积的淋巴细胞分离液，2300rpm，离心20min；小心取出淋巴细胞层，用PBS洗涤两次，分别在2100rpm，1800rpm条件下，离心各10min；最后一遍用1640细胞培养液洗涤，1500rpm，离心10min。最后用1ml1640培养液重悬，取出部分进行细菌计数；调整细胞浓度至1×107/ml，根据ELISPOT标准流程进行以下步骤，细胞终浓度为5×106/ml，刺激蛋白分别为，结核菌素PPD(刺激浓度10μg/ml)，Ag85B蛋白(刺激浓度2μg/ml)，Mpt64190-198合成肽段(0.6μg/ml)，重组蛋白Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4(2μg/ml)。
b)体液免疫水平检测Ag85B蛋白溶解于PBS中(终浓度5μg/ml)，然后将该溶液加入96孔板中(100μl/孔)4℃过夜。将板洗干净后，加入含1％的小牛血清(BSA)的PBS封闭板(200μl/孔).待检血清(重组BCG免疫的小鼠，眼眶取血所得血清)用PBS稀释100倍，再连续对倍稀释，加入板中(200μl/孔)孵育，37℃，1.5h。洗板后分别加稀释10000倍酶标羊抗鼠IgG(H+L)，稀释1000倍的酶标兔抗鼠IgG1或IgG2a，37℃孵育2h。板子加入邻苯二胺溶液(含0.03％过氧化氢，pH5.0)，用2mol/LH2SO4终止反应。测OD492。根据OD492≥阴性OD492二倍以上者，判定为阳性，再根据呈现阳性反应的抗体溶液稀释最大倍数的倒数判断其效价。
结果显示重组BCG疫苗rBCG-Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4能有效刺激γ-IFN表达，分泌量比BCG有所增高。rBCG-AMM疫苗引起对Agg5B蛋白的IgG1反应比BCG高，而引起的IgG2a反应要低于BCG，整体IgG水平两者接近。
序列表SEQ ID NOlATGACAGACG TGAGCCGAAA GATTCGAGCT TGGGGACGCC GATTGATGAT CGGCACGGCAGCGGCTGTAG TCCTTCCGGG CCTGGTGGGG CTTGCCGGCG GAGCGGCAAC CGCGGGCGCGTTCTCCCGCC CGGGGCTCCC GGTTGAGTAC CTGCAGGTGC CGTCGCCGTC GATGGGCCGCGACATCAAGG TTCAGTTCCA GAGCGGTGGG AACAACTCAC CTGCGGTTTA TCTGCTCGACGGCCTGCGCG CCCAAGACGA CTACAACGGC TGGGATATCA ACACCCCGGC GTTCGAGTGGTACTACCAGT CGGGACTGTC GATAGTCATG CCGGTCGGCG GGCAGTCCAG CTTCTACAGCGACTGGTACA GCCCGGCCTG CGGTAAGGCT GGCTGCCAGA CTTACAAGTG GGAAACCTTCCTGACCAGCG AGCTGCCGCA ATGGTTGTCC GCCAACAGGG CCGTGAAGCC CACCGGCAGCGCTGCAATCG GCTTGTCGAT GGCCGGCTCG TCGGCAATGA TCTTGGCCGC CTACCACCCCCAGCAGTTCA TCTACGCCGG CTCGCTGTCG GCCCTGCTGG ACCCCTCTCA AGGGATGGGGCCTAGCCTGA TCGGCCTCGC GATGGGTGAC GCCGGCGGTT ACAAGGCCGC AAACATGTGGGGTCCCTCGA GTGACCCGGC ATGGGAGCGC AACGACCCTA CGCAGCAGAT CCCAAAGCTGGTCGCAAACA ACACCCGGCT ATGGGTTTAT TGCGGGAACG GCACCCCGAA CGAGTTGGGCGGTGCCAACA TACCCGCCGA GTTCTTGAAG AACTTCGTTC GTAGCAGCAA CCTGAAGTTCCAGGATGCGT ACAACGCCGC GGGCGGGCAC AACGCCGTGT TCAACTTCCC GCCCAACGGCACGCACAGCT GGGAGTACTG GGGCGCTCAA CTCAACGCCA TGAAGGGTGA CCTCCAGAGT
TCGTTAGGCG CCGGCTAG....(酶切位点) SEQ ID NO2TTCGCAGTCACGAACGACGGGGTGATTSEQ ID NO3ATGAGGCTGTCGTTGACCGCATTGAGCGCCGGTGTAGGCGCCGTGGCAATGTCGTTGACCGTCGGGGCCGGGGTCGCCTCCGCAGATCCCGTGGACGCGGTCATTAACACCACCTGCAATTACGGGCAGGTAGTAGCTGCGCTCAACGCGACGGATCCGGGGGCTGCCGCACAGTTCAACGCCTCACCGGTGGCGCAGTCCTATTTGCGCAATTTCCTCGCCGCACCGCCACCTCAGCGCGCTGCCATGGCCGCGCAATTGCAAGCTGTGCCGGGGGCGGCACAGTACATCGGCCTTGTCGAGTCGGTTGCCGGCTCCTGCAACAACTATTAASEQ ID NO4ACAGTCGACTTCGCAGTCACGAACGACGGGGTGATTATGAGGCTGTCGTTGACSEQ ID NO5GCGAAGCTTTTAATAGTTGTTGCAGGAGSEQ ID NO6TGGCCAATGACAGACGTSEQ ID NO7ATAGTCGACGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAGSEQ ID NO8CGAATTCTTCTCCCGGCCGGGGCT
权利要求
1.一种结核杆菌重组卡介苗，其特征在于由ag85B基因，mpt64的第190-198位的氨基酸序列所对应的核苷酸序列以及mtb8.4基因连在一起，克隆进大肠杆菌载体而获得重组基因；再由该重组基因经过原核生物一结核分支杆菌穿梭质粒电击转入到BCG中，从而获得所述结核杆菌重组卡介苗记为rBCG-Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4；其中BCG为现有的卡介苗，ag85B的序列为SEQ.ID.N01，mpt64190-198序列为SEQ.ID.NO2，mtb8.4为SEQ.ID.NO3。
2.一种如权利要求1所述的结核杆菌重组卡介苗的制备方法，其特征在于具体步骤如下ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4的构建首先设计引物扩增mpt64(190-198)-mtb8.4上游ACAGTCGAC ATGAGGCTGTCGTTGAC说明双下划线代表编码Mpt64(190-198)肽段的基因，单下划线代表Sal I酶切位点，下游GCGAAGCTTTTAATAGTTGTTGCAGGAG说明单下划线HindIII酶切位点，以结核杆菌标准毒株H37RvDNA为模板，用以上两条引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后，用Sal I和HindIII双酶切，克隆构建在质粒PET28a(+)中；其次扩增ag85B基因上游TGGCCAATGACAGACGT，说明单下划线代表Bal I酶切位点，下游ATAGTCGACGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG，说明单下划线代表Sal I酶切位点，将扩增的mpt64(190-198)-mtb8.4和ag85B经酶切，连接后形成重组新基因，测序表明所插入序列和Gene Bank中H37Rv结核全基因组相应基因序列完全一致；将重组好的基因，克隆到原核生物一结核分支杆菌穿梭质粒PMV261，制备BCG感受态细胞，将带有重组基因的穿梭质粒通过电击转入到BCG中，形成重组BCG；重组BCG经由western-blot检测后，证明重组基因确实已转入到BCG中。
全文摘要
本发明属医药技术领域，具体为一种新型的结核杆菌重组卡介苗。该重组卡介苗为rBCG－Ag85B－Mpt6文档编号C12N15/09GK101024077SQ20061014766
公开日2007年8月29日 申请日期2006年12月21日 优先权日2006年12月21日
发明者王洪海, 郄亚卿, 王九玲, 祝秉东, 徐颖, 王庆忠, 陈嘉臻 申请人:复旦大学