专利名称：仔猪水肿病大肠杆菌基因突变株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及的是基因工程制品的制作方法，具体地说是利用定点突变和同源重组技术对编码类志贺氏毒素II型变异体蛋白的SLT-IIe基因进行改造的方法。
背景技术：
仔猪水肿病是断奶仔猪常发的一种细菌性传染病，本病发病率不高，但死亡率很高，尤其是对健康状况好的仔猪发病较多，给养殖户造成巨大损失，但目前市场上的水肿疫苗仍是以常规灭活疫苗为主。因在疫苗的灭活过程中常常会影响疫苗的免疫原从而使疫苗的免疫保护性降低。因此，研制更加安全有效的疫苗成为目前十分迫切的需要。
(三)发明目的本发明的目的在于提供一种利用定点突变及同源重组技术构建仔猪水肿病大肠杆菌基因突变株及其构建方法。
本发明的目的是这样实现的类志贺氏毒素II型变异体是由SLT-IIe基因编码，该基因含有1236个碱基，编码410个氨基酸残基，其167位的谷氨酸和170位的精氨酸两个氨基酸是整个基因的活性部位，分别突变为谷氨酰胺和亮氨酸后，突变体失去了原基因的致病性而保留了其免疫原性，可以刺激机体产生特异性抗体。
仔猪水肿病大肠杆菌(0139)SLT-IIe基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列为
1 ATG AAG TGT ATA TTG TTA AAG TGG ATA CTG TGT CTG TTA CTG GGT TTT TCT TCG GTA TCC1M K C I L L K W I L C L L L G F S S V S61 TAT TCC CAG GAG TTT ACG ATA GAC TTT TCG ACT CAA CAA AGT TAT GTA TCT TCG TTA AAT21 Y S Q E F T I D F S T Q Q S Y V S S L N121 AGT ATA CGG ACA GCG ATA TCG ACC CCT CTT GAA CAT ATA TCT CAG GGA GCT ACA TCG GTA41 S I R T A I S T P L E H I S Q G A T S V181 TCC GTT ATT AAT CAT ACA CCA CCA GGA AGT TAT ATT TCC GTA GGT ATA CGA GGG CTT GAT61 S V I N H T P P G S Y I S V G I R G L D241 GTT TAT CAG GAG CGT TTT GAC CAT CTT CGT CTG ATT ATT GAA CGA AAT AAT TTA TAT GTG81 V Y Q E R F D H L R L I I E R N N L Y V301 GCT GGA TTT GTT AAT ACG ACA ACA AAT ACT TTC TAC AGA TTT TCA GAT TTT GCA CAT ATA101 A G F V N T T T N T F Y R F S D F A H I361 TCA TTG CCC GGT GTG ACA ACT ATT TCC ATG ACA ACG GAC AGC AGT TAT ACC ACT CTG CAA121 S L P G V T T I S M T T D S S Y T T L Q421 CGT GTC GCA GCG CTG GAA CGT TCC GGA ATG CAA ATC AGT CGT CAC TCA CTG GTT TCA TCA141 R V A A L E R S G M Q I S R H SL V S S481 TAT CTG GCG TTA ATG GAG TTC AGT GGT AAT ACA ATG ACC AGA GAT GCA TCA AGA GCA GTT161 Y L A L M E F S G N T M T R D A S R A V541 CTG CGT TTT GTC ACT GTC ACA GCA GAA GCC TTA CGG TTC AGG CAA ATA CAG AGA GAA TTT181 L R F V T V T A D A L R F R Q I Q R E F601 CGT CTG GCA CTG TCT GAA ACT GCT CCT GTT TAT ACG ATG ACG CCG GAA GAC GTG GAC CTC201 R L A L S E T A P V Y T M T P E D V D L661 ACT CTG AAC TGG GGG AGA ATC AGC AAT GTG CTT CCG GAG TAT CGG GGA GAG GCT GGT GTC221 T L N W G R I S N V L P E Y R G E A G V721 AGA GTG GGG AGA ATA TCC TTT AAT AAT ATA TCA GCG ATA CTT GGT ACT GTG GCC GTT ATA241 R V G R I S F N N I S A I L G T V A V I781 CTG AAT TGC CAT CAT CAG GGC GCG CGT TCT GTT CGC GCC GTG AAT GAA GAG AGT CAA CCA261 L N C H H QG A R S V R A V N E E S Q P841 GAA TGT CAG ATA ACT GGC GAC AGG CCC GTT ATA AAA ATA AAC AAT ACA TTA TGG GAA AGT281 E C Q I T G D R P V I K I N N T L W E S901 AAT ACA GCA GCA GCG TTT CTG AAC AGA AAG TCA CAG TCT TTA TAT ACA ACT GGT GAA TGA301 N T A A A F L N R K S Q S L Y T T G E -961 AAG GAG TTA AGA ATG AAG AAG ATG TTT ATA GCG GTT TTA TTT GCA TTG GTT TCT GTT AAT321 K E L R M K K M F I A V L F A L V S V N1021GCA ATG GCG GCG GAT TGT GCT AAA GGT AAA ATT GAG TTT TCC AAG TAT AAT GAG GAT AAT341 A M A A D C A K G K I E F S K Y N E D N1081ACC TTT ACT GTG AAG GTG TCA GGA AGA GAA TAC TGG ACG AAC AGA TGG AAT TTG CAG CCA361 T F T V K V S G R E Y W T N R W N L Q P
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(10)重组质粒pCVD442::SLT-IIe*转化到SM10λpir大肠杆菌中；(11)诱导仔猪水肿病大肠杆菌(0139)的萘啶酮酸抗性，方法如下接种100μl过夜培养的仔猪水肿病大肠杆菌(0139)到液体LB试管中，37℃振荡培养到对数生长期，加入萘啶酮酸至终浓度为20μg/ml，继续培养过夜。进行稀释后，涂布于含20μg/ml萘啶酮酸的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单个单菌落接种于5ml液体LB试管中，37℃振荡培养到对数生长期，再加入萘啶酮酸至终浓度为50μg/ml，继续培养过夜。进行稀释后，涂布于含50μg/ml萘啶酮酸的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。挑取单个菌落接种于5ml液体LB培养基中，并加入萘啶酮酸至终浓度为50μg/ml，37℃振荡培养后保存菌种，此菌株即诱导出了NalR，记为0139(NalR)。
(12)0139(NalR)与含pCVD442::SLT-IIe*质粒的SM10λpir大肠杆菌共培养筛选出重组子。
本发明产生的SLT-IIe*突变大肠杆菌是在成功克隆出SLT-IIe基因的基础上，利用定点突变技术对SLT-IIe基因的第167和170位氨基酸进行突变产生了突变体SLT-IIe*，进而经过同源重组技术成功构建了SLT-IIe*突变大肠杆菌新菌株。
利用本发明的方法生产的产品可用于作为口服疫苗的候选菌株制备疫苗，防制仔猪水肿病。
本发明的产品优点体现在①作为安全的口服疫苗候选菌株，用于仔猪水肿病的防治，与该病自然感染模式相同。
②可在肠道内存在，既可刺激机体产生局部的细胞免疫又可刺激机体产生全身的体液免疫。
毒力基因突变后的菌株失去了对仔猪的致病性，但仍保留免疫原性，因此可以诱导机体产生特异性免疫。与目前使用的灭活疫苗相比，用该菌株制备口服疫苗免疫仔猪，感染途径与自然感染途径相同，疫苗菌在肠道定居后能刺激机体产生局部免疫和全身免疫，能更好地提高免疫保护率。该突变菌株的构建将为仔猪水肿病口服疫苗的研制提供良好的候选菌株。
(四)具体实施方案(1)设计扩增编码编码类志贺氏毒素II型变异体蛋白的SLT-IIe基因及其左侧翼序列的特异性引物(L*15’--3，AGT GGT GAG AGC GAG CGA CTCATA；L*25’--3’CCT GAACAGTAA GGCCTGTGC TGT G；R*15’--3’A GCACAGGCCTTACTGTTC AGG CAA；R*25’--3’TCA GTT AAA CTT CAC CTG GGC AAA GC)；(2)通过PCR扩增获得编码类志贺氏毒素II型变异体蛋白的SLT-IIe基因及左侧翼基因；(3)对SLT-IIe基因及左侧翼L-SLT-IIe基因序列进行克隆、测序鉴定；(4)重新设计4对用于定点突变的特异性引物(L*15’--3’AGT GGT GAGAGC GAG CGA CTC ATA；L*25’--3’CCT GAACAGTAA GGCCTGTGC TGT G；R*15’--3’A GCACAGGCC TTACTGTTC AGG CAA；R*25’--3’TCA GTT AAA CTT CAC CTGGGC AAA GC)；(5)通过PCR扩增两个含突变点的基因片断，将两个片断分别进行克隆、测序鉴定；(6)通过PCR反应将两个含突变点的基因片断连接起来，连接后的突变基因SLT-IIe*进行克隆、测序鉴定；(7)将SLT-IIe*基因亚克隆至自杀质粒pCVD442载体上；(8)重组质粒pCVD442::SLT-IIe*转化到SM10λpir大肠杆菌中；
(9)诱导仔猪水肿病大肠杆菌(0139)的萘啶酮酸抗性，方法如下接种100μl过夜培养的仔猪水肿病大肠杆菌(0139)到液体LB试管中，37℃振荡培养到对数生长期，加入萘啶酮酸至终浓度为20μg/ml，继续培养过夜。进行稀释后，涂布于含20μg/ml萘啶酮酸的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单个单菌落接种于5ml液体LB试管中，37℃振荡培养到对数生长期，再加入萘啶酮酸至终浓度为50μg/ml，继续培养过夜。进行稀释后，涂布于含50μg/ml萘啶酮酸的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。挑取单个菌落接种于5ml液体LB培养基中，并加入萘啶酮酸至终浓度为50μg/ml，37℃振荡培养后保存菌种，此菌株即诱导出了NalR，记为0139(NalR)。
(10)0139(NalR)与含pCVD442::SLT-IIe*质粒的SM10λpir大肠杆菌共培养筛选出重组子。
类志贺氏毒素II型变异体是由SLT-IIe基因编码，该基因含有1236个碱基，编码410个氨基酸残基，其167位的谷氨酸和170位的精氨酸两个氨基酸是整个基因的活性部位，分别突变为谷氨酰胺和亮氨酸后，突变体失去了原基因的致病性而保留了其免疫原性，可以刺激机体产生特异性抗体。
序列表仔猪水肿病大肠杆菌(0139)SLT-IIe基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列为1 ATG AAG TGT ATA TTG TTA AAG TGG ATA CTG TGT CTG TTA CTG GGT TTT TCT TCG GTA TCC1M K C I L L K W I L C L L L G F S S V S61 TAT TCC CAG GAG TTT ACG ATA GAC TTT TCG ACT CAA CAA AGT TAT GTA TCT TCG TTA AAT21 Y S Q E F T I D F S T Q Q S Y V S S L N121 AGT ATA CGG ACA GCG ATA TCG ACC CCT CTT GAA CAT ATA TCT CAG GGA GCT ACA TCG GTA41 S I R T A I S T P L E H I S Q G A T S V181 TCC GTT ATT AAT CAT ACA CCA CCA GGA AGT TAT ATT TCC GTA GGT ATA CGA GGG CTT GAT61 S V I N H T P P G S Y I S V G I RG L D241 GTT TAT CAG GAG CGT TTT GAC CAT CTT CGT CTG ATT ATT GAA CGA AAT AAT TTA TAT GTG81 V Y Q E R F D H L R L I I E R N N L Y V301 GCT GGA TTT GTT AAT ACG ACA ACA AAT ACT TTC TAC AGA TTT TCA GAT TTT GCA CAT ATA101 A G F V N T T T N T F Y R F S D F A H I361 TCA TTG CCC GGT GTG ACA ACT ATT TCC ATG ACA ACG GAC AGC AGT TAT ACC ACT CTG CAA121 S L P G V T T I S M T T D S S Y T T L Q421 CGT GTC GCA GCG CTG GAA CGT TCC GGA ATG CAA ATC AGT CGT CAC TCA CTG GTT TCA TCA141 R V A A L E R S G M Q I S R H S L V S S481 TAT CTG GCG TTA ATG GAG TTC AGT GGT AAT ACA ATG ACC AGA GAT GCA TCA AGA GCA GTT161 Y L A L M E F S G N T M T R D A S R A V541 CTG CGT TTT GTC ACT GTC ACA GCA GAA GCC TTA CGG TTC AGG CAA ATA CAG AGA GAA TTT181 L R F V T V T A E A L R F R Q I Q R E F601 CGT CTG GCA CTG TCT GAA ACT GCT CCT GTT TAT ACG ATG ACG CCG GAA GAC GTG GAC CTC201 R L A L S E T A P V Y T M T P E D V D L661 ACT CTG AAC TGG GGG AGA ATC AGC AAT GTG CTT CCG GAG TAT CGG GGA GAG GCT GGT GTC221 T L N W G R I S N V L P E Y R G E A G V721 AGA GTG GGG AGA ATA TCC TTT AAT AAT ATA TCA GCG ATA CTT GGT ACT GTG GCC GTT ATA241 R V G R I S F NN I S A IL G T V A V I781 CTG AAT TGC CAT CAT CAG GGC GCG CGT TCT GTT CGC GCC GTG AAT GAA GAG AGT CAA CCA261 L N C H H Q G A R S V R A V N E E S Q P841 GAA TGT CAG ATA ACT GGC GAC AGG CCC GTT ATA AAA ATA AAC AAT ACA TTA TGG GAA AGT281 E C Q I T G D R P V I K I N N T L W E S901 AAT ACA GCA GCA GCG TTT CTG AAC AGA AAG TCA CAG TCT TTA TAT ACA ACT GGT GAA TGA301 N T A A A F L N R K S Q S L Y T T G E-961AAG GAG TTA AGA ATG AAG AAG ATG TTT ATA GCG GTT TTA TTT GCA TTG GTT TCT GTT AAT321 K E L R M K K M F I A V L F A L V S V N
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权利要求
1.一种仔猪水肿病大肠杆菌基因突变株，其特征是突变后的SLT-IIe*基因特征为完整的SLT-IIe*基因有两个开放阅读框，共1236个碱基，编码410个氨基酸残基，与野生的仔猪水肿病大肠杆菌0139编码类志贺氏毒素II型变异体的SLT-IIe仅有3个碱基的变异，共有2个氨基酸残基的变异。
2.根据权利要求1所述的仔猪水肿病大肠杆菌基因突变株，其特征是猪大肠杆菌SLT-IIe基因的突变基因SLT-IIe*基因序列为1 ATG AAG TGT ATA TTG TTA AAG TGG ATA CTG TGT CTG TTA CTG GGT TTT TCT TCG GTA TCC1M K C I L L K W I L C L L L G F S S V S61 TAT TCC CAG GAG TTT ACG ATA GAC TTT TCG ACT CAA CAA AGT TAT GTA TCT TCG TTA AAT21 Y S Q E F T I D F S T Q Q S Y V S SL N121 AGT ATA CGG ACA GCG ATA TCG ACC CCT CTT GAA CAT ATA TCT CAG GGA GCT ACA TCG GTA41 S I R T A I S T P L E H I S Q G A T S V181 TCC GTT ATT AAT CAT ACA CCA CCA GGA AGT TAT ATT TCC GTA GGT ATA CGA GGG CTT GAT61 S V I N H T P P G S Y I S V G I R G L D241 GTT TAT CAG GAG CGT TTT GAC CAT CTT CGT CTG ATT ATT GAA CGA AAT AAT TTA TAT GTG81 V Y Q E R F D H L R L I I E R N N L Y V301 GCT GGA TTT GTT AAT ACG ACA ACA AAT ACT TTC TAC AGA TTT TCA GAT TTT GCA CAT ATA101 A G F V N T T T N T F Y R F S D F A H I361 TCA TTG CCC GGT GTG ACA ACT ATT TCC ATG ACA ACG GAC AGC AGT TAT ACC ACT CTG CAA121 S L P G V T T I S M T T D S S Y T T L Q421 CGT GTC GCA GCG CTG GAA CGT TCC GGA ATG CAA ATC AGT CGT CAC TCA CTG GTT TCA TCA141 R V A A L E R S G M Q I S R H S L V S S481 TAT CTG GCG TTA ATG GAG TTC AGT GGT AAT ACA ATG ACC AGA GAT GCA TCA AGA GCA GTT161 Y L A L M E F S G N T M T R D A S R A V541 CTG CGT TTT GTC ACT GTC ACA GCA CGA GCC TTA CTG TTC AGG CAA ATA CAG AGA GAA TTT181 L R F V T V T A Q A L L F R Q I Q R E F601 CGT CTG GCA CTG TCT GAA ACT GCT CCT GTT TAT ACG ATG ACG CCG GAA GAC GTG GAC CTC201 R L A L S E T A P V Y T M T P E D V D L661 ACT CTG AAC TGG GGG AGA ATC AGC AAT GTG CTT CCG GAG TAT CGG GGA GAG GCT GGT GTC221 T L N W G R I S N V L P E Y R G E A G V721 AGA GTG GGG AGA ATA TCC TTT AAT AAT ATA TCA GCG ATA CTT GGT ACT GTG GCC GTT ATA241 R V G R I S F N N I S A I L G T V A V I781 CTG AAT TGC CAT CAT CAG GGC GCG CGT TCT GTT CGC GCC GTG AAT GAA GAG AGT CAA CCA261 L N C H H Q G A R S V R A V N E E S Q P841 GAA TGT CAG ATA ACT GGC GAC AGG CCC GTT ATA AAA ATA AAC AAT ACA TTA TGG GAA AGT281 E C Q I T G D R P V I K I N N T L W E S901 AAT ACA GCA GCA GCG TTT CTG AAC AGA AAG TCA CAG TCT TTA TAT ACA ACT GGT GAA TGA301 N T A A A F L N R K S Q S L Y T T G E -961 AAG GAG TTA AGA ATG AAG AAG ATG TTT ATA GCG GTT TTA TTT GCA TTG GTT TCT GTT AAT321 K E L R M K K M F I A V L F A L V S V N1021GCA ATG GCG GCG GAT TGT GCT AAA GGT AAA ATT GAG TTT TCC AAG TAT AAT GAG GAT AAT341 A M A A D C A K G K I E F S K Y N E D N1081ACC TTT ACT GTG AAG GTG TCA GGA AGA GAA TAC TGG ACG AAC AGA TGG AAT TTG CAG CCA361 T F T V K V S G R E Y W T N R W N L Q P1141TTG TTA CAA AGT GCT CAG CTG ACA GGG ATG ACT GTA ACA ATC ATA TCT AAT ACC TGC AGT381 L L Q S A Q L T G M T V T I I S N T C S1201 TCA GGC TCA GGC TTT GCC CAG GTG AAG TTT AAC TGA401 S G S G F A Q V K F N -
3.一种仔猪水肿病大肠杆菌基因突变株的构建方法，其特征为(1)设计扩增编码编码类志贺氏毒素II型变异体蛋白的SLT-IIe基因及其左侧翼序列的特异性引物( L*1 5’--3’AGT GGT GAG AGC GAG CGA CTCATA；L*25’--3’CCT GAACAGTAA GGCCTGTGC TGT G；R*15’--3’A GCACAGGCCTTACTGTTC AGG CAA；R*25’--3’TCA GTT AAA CTT CAC CTG GGC AAA GC )；(2)通过PCR扩增获得编码类志贺氏毒素II型变异体蛋白的SLT-IIe基因及左侧翼基因；(3)对SLT-IIe基因及左侧翼L-SLT-IIe基因序列进行克隆、测序鉴定；(4)重新设计4对用于定点突变的特异性引物(L*15’--3’AGT GGT GAGAGC GAG CGA CTC ATA；L*25’--3’CCT GAACAGTAA GGCCTGTGC TGT G；R*15’--3’A GCACAGGCC TTACTGTTC AGG CAA；R*25’--3’TCA GTT AAA CTT CAC CTG GGCAAA GC )；(5)通过PCR扩增两个含突变点的基因片断，将两个片断分别进行克隆、测序鉴定；(6)通过PCR反应将两个含突变点的基因片断连接起来，连接后的突变基因SLT-IIe*进行克隆、测序鉴定；(7)将SLT-IIe*基因亚克隆至自杀质粒pCVD442载体上；(8)重组质粒pCVD44 2::SLT-IIe*转化到SM10λpir大肠杆菌中；(9)诱导野生0139大肠杆菌的萘啶酮酸抗性，方法如下接种100μl过夜培养的野生0139大肠杆菌到液体LB试管中，37℃振荡培养到对数生长期，加入萘啶酮酸至终浓度为20μg/ml，继续培养过夜，进行稀释后，涂布于含20μg/ml萘啶酮酸的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单个单菌落接种于5ml液体LB试管中，37℃振荡培养到对数生长期，再加入萘啶酮酸至终浓度为50μg/ml，继续培养过夜。进行稀释后，涂布于含50μg/ml萘啶酮酸的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种于5ml液体LB培养基中，并加入萘啶酮酸至终浓度为50μg/ml，37℃振荡培养后保存菌种，此菌株即诱导出了NalR，记为0139(NalR)；(10)0139(NalR)与含pCVD442::SLT-IIe*质粒的SM10λpir大肠杆菌共培养筛选出重组子。
全文摘要
本发明提供仔猪水肿病大肠杆菌基因突变株及其构建方法。设计扩增编码类志贺氏毒素II型变异体基因及其左侧翼序列的特异性引物；通过PCR扩增获得编码类志贺氏毒素II型变异体基因及其左侧翼序列，分别进行克隆、测序鉴定；设计两对针对基因进行定点突变的突变引物；PCR扩增两个突变片断，分别克隆、测序鉴定；利用二重PCR将两个突变片断连接起来，并克隆、测序鉴定；将突变的基因亚克隆至自杀质粒pCVD442中；诱导致水肿病的0139大肠杆菌的萘啶酮酸抗性；利用突变菌株无Amp及蔗糖抗性，而具有萘啶酮酸抗性，并且其基因PCR产物可特异性的被Stu I核酸内切酶切开成功筛选出完成同源重组的0139大肠杆菌突变株。可以为仔猪水肿病的常规预防提供一种较好的疫苗后备菌株。
文档编号C12N15/31GK1995331SQ20061015121
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月29日 优先权日2006年12月29日
发明者师东方, 付海兵 申请人:东北农业大学