专利名称：：人卵巢癌耐药细胞株及其培养方法
技术领域：
：本发明涉及一种选择人卵巢癌细胞株SK0V3作为亲代细胞，选用临床常用抗癌药物拓扑替康作为诱导剂，以反复大剂量冲击方式间歇用药，建立了拓扑替康耐药细胞株SK0V3/T0P的人卵巢癌耐药细胞株及其培养方法。卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤之一，目前以紫杉醇与铂类联合作为卵巢癌的一线化疗方案、拓扑替康与铂类联合作为二线化疗方案广泛用于临床。然而，常遇到对这些药物耐药的问题。目前有关耐药的研究多采用浓度梯度递增法在体外诱导耐药细胞株，但这种方法与临床化疗反复、间歇用药的特点相差甚远。
发明内容本发明的目的是利用人卵巢癌细胞株SK0V3作为亲代细胞，选用临床常用抗癌药物拓扑替康作为诱导剂，以反复大剂量冲击方式间歇用药，建立拓扑替康耐药细胞株SK0V3/T0P。本发明的细胞株是用如下方法培养的(1)药物选择拓扑替康(TOP);(2)药剂量根据公式[(60XD)/(5000)]X2X10顺,其中60为平均成人体重(kg)，D临床用药剂量(mg.kg—1,d—'),5000为平均成人血容量(ml),2为除以血细胞比积50%,10'i将mg换成ug,参照卵巢癌病人临床化疗剂量，TOP1.2mg/m2,以临床大剂量冲击疗法的用药剂量为常用剂量的3倍为标准，TOP的终浓度为2160ng/ml3作为大剂量冲击用量；(3)亲代细胞培养人卵巢上皮癌细胞株SK0V3细胞生长于含15%小牛血清的RPMI1640培养基中，置入5%C02、37°C培养箱中培养；(4)卵巢癌耐药细胞株诱导取对数生长期细胞，0.25%的胰酶消化后计数，以5X10Vml细胞接种于培养瓶(以每瓶5ml接种)，24小时后细胞贴壁，再加入终浓度为2160ng/ml的TOP作用2小时，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，更换新鲜培养液，待细胞恢复生长再进行第二次冲击。如此反复作用，T0P共加药冲击13次，历时10个月建成人卵巢癌耐药细胞株SK0V3/T0P，所有耐药性实验均在细胞稳定生长后2个月后进行，细胞冻存3个月后复苏。细胞株SK0V3/T0P保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1217。耐药性的测定以MTT法测耐药指数，绘制细胞生长曲线，流式细胞仪测定细胞的凋亡率及细胞周期分布；透射电镜观察细胞的超微结构的改变。1.细胞耐药指数(RI):SK0V3/T0P耐药指数为10.67(代O.01)，对米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、长春新碱(VCR)有明显的交叉耐药。见表l。表lSK0V3/T0P细胞耐药谱<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>尸O.Ol，'尸<0.052细胞生长曲线和群体倍增时间细胞生长曲线及细胞周期显示，两种耐药细胞的生长增殖较亲本细胞明显减慢(PO.Ol)，见图l。3.P-170糖蛋白功能检测结果耐药细胞株SK0V3/T0P中的P-170糖蛋白含量明显增高(户O.Ol)，与其耐药指数相符。见表3、5及图2-3。表3.SK0V3细胞检测结果曰期23-Nov-04<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表5.SKOV3/TOP细胞检测结果日期23-Nov-04<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>图l细胞生长曲线图2SK0V3细胞P-170糖蛋白流式细胞测定图3SK0V3/T0P细胞P-170糖蛋白流式细胞测定具体实施方式实施例1以拓扑替康(TOP)药物诱导SK0V3细胞，建立SK0V3/TOP耐药细胞株。药物拓扑替康(TOP)为贵州汉方制药有限公司产品。(1)用药剂量根据公式[(60XD)/(5000)]X2X103,其中60为平均成人体重(kg)，D临床用药剂量(mg.kg—1,d—'),5000为平均成人血容量(ml),2为除以血细胞比积50%,103将mg换成ug,参照卵巢癌病人临床化疗剂量，TOP1.2mg/m2，以临床大剂量冲击疗法的用药剂量为常用剂量的3倍为标准，采用TOP的终浓度为2160ng/ml作为大剂量冲击用量；(2)亲代细胞培养人卵巢上皮癌细胞株SK0V3细胞生长于含15%小牛血清的RPMI1640培养基中，置入5%0)2、37。C培养箱中培养。(3)卵巢癌耐药细胞株诱导取对数生长期细胞，0.25%的胰酶消化后计数，以5XlO'Vml细胞接种于培养瓶(以每瓶5ml接种)，24小时后细胞贴壁，再加入终浓度为2160ng/ml的T0P作用2小时，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，更换新鲜培养液，待细胞恢复生长再进行第二次冲击，如此反复作用，T0P共加药冲击13次，历时10个月建成人卵巢癌耐药细胞株SK0V3/T0P。所有耐药性实验均在细胞稳定生长后2个月后进行，细胞冻存3个月后复苏，其耐药性仍然稳定。S丽3/T0P耐药指数为10.67(代O.01)，除对TOP耐药外，对米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、长春新碱(VCR)有明显的交叉耐药。保藏该生物材料样品的单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址北京市海淀区中关村北一条13号保藏日期2004.09.02保藏编号CGMCCNo.1217分类命名卵巢癌耐药细胞株。权利要求1.一种人卵巢癌耐药细胞株，其特征在于细胞株名为SKOV3/TOP，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1217。全文摘要本发明涉及一种人卵巢癌TOP耐药细胞株及其培养方法，保藏号为CGMCCNo.1217，是选择人卵巢癌细胞株作为亲代细胞，将该细胞置于含15％小牛血清的RPMI1640培养基中，置入5％CO<sub>2</sub>、37℃培养箱中培养；取对数生长期细胞，0.25％的胰酶消化后计数，以5×10<sup>5</sup>/ml细胞接种于培养瓶，以每瓶5ml接种，24小时后细胞贴壁，TOP的终浓度为2160ng/ml作用2小时，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液洗3遍，更换新鲜培养液，待细胞恢复生长再进行第二次冲击，如此反复作用，共加药冲击13次，历时10个月建成，细胞耐药指数为细胞10.67，与敏感细胞相比P＜0.01，除对TOP耐药外，对米托蒽醌、喜树碱、长春新碱有明显的交叉耐药。文档编号C12N5/08GK101255406SQ20061015251公开日2008年9月3日申请日期2005年4月22日优先权日2005年4月22日发明者周友珍,张素梅,李红霞,魏丽惠申请人:李红霞