专利名称：：一种微生物转化制备(r)-3-羟基丁酸乙酯的方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，属于生物催化
技术领域：
。(二)
背景技术：
3-羟基丁酸乙酯(ethy-3-hydroxybutyrate，EHB)是一种重要的药物中间体，分子中含有多功能基团，其手性单一对映异构体(R)-EHB和(S)"EHB羟基丁酸乙酯均是非常有前景的重要的手性砌块，例如(S)"EHB是熏衣草醇、食菌曱诱醇、核球壳菌、格哈菌素、卡包霉素和灰绿霉素前体等天然产物的手性源，(R—EHB也是合成L-肉碱、亚胺培南等碳青霉烯类抗生素等手性药物的重要中间体。由于乙酰乙酸乙酉旨(ethyl3-oxobutanoate/ethylacetoacetate，EOB)易于合成且价格低廉，以其为底物进行微生物催化的不对称还原反应获取手性EHB是非常经济有效的制备途径。而且反应产物(i)-EHB不易为微生物代谢利用，用微生物活细胞催化方法制备(i)-EHB非常有利。目前所知的从EOB还原为手性醇的方法主要有三条路径(1)化学法。化学法采用的主要是过渡金属配合物作为催化剂催化C-O基加氬生成产物。化学法可获得较高的产率，但主要缺点是反应的立体选择性偏低，且手性催化剂的制备比较困难。(2)直接利用醇脱氬酶催化乙酰乙酸乙酯。这种方法不仅要有酶蛋白参加反应，而且还要添加价格昂贵的辅酶因子，在实际应用中受到一定的限制。(3)孩史生物全细月包生物转4匕法(Biotransformation)。即通过完整的樣i生物细胞(如面包酵母)的立体选择性生物催化来实现，微生物细胞含有完整的酶系，例如酵母细胞中舍有醇脱氢酶系，可以实现辅酶的原位再生，不需要另外添加昂贵的辅酶因子，但现有已知可用于乙酰乙酸乙酯不对称还原制备C^)-EHB的菌种(如红酵母、产肮假丝酵母、活性干酵母假丝酵母等)，转化率普遍较低(低于50%)。
发明内容本发明即是为了提供一种产率高、所得产物光学纯度高、产物浓度高的微生物转化制备(R)-3-幾基丁酸乙酯的方法。为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，所述方法是以乙酰乙酉吏乙酉旨为底4勿,以膜醭毕赤酵母(尸/c/2/awem6n3wae/ac/e;w//awsew)纟田胞为酶源，进行微生物催化不对称还原反应，反应结束后转化液经分离纯化得到所述的(R)-3-羟基丁酸乙酯。所述膜醭毕赤酵母细胞来自膜醭毕赤酵母经发酵培养获得的发酵液或由发酵液过滤得到的湿菌体。可将湿菌体加入含有底物的溶液中，或直接按需要量将底物加入发酵液中，作为反应体系。所述的微生物细胞催化的不对称还原反应的反应温度为2050°C,反应时间为140小时。在此条件下所得的转化液采用气相色谱分析(GC)测定产物浓度，再结合产物的旋光测定得到产物e.e.值，表明已转化的主要组分为(i)-EHB。所述底物质量浓度为150%,加入发酵产物使湿菌体量为0.3~6g/g底物，所述不对称还原反应的反应温度为2050°C,反应时间为140小时。所述反应体系还可添加葡萄糖，添加量为0.1-25g/L。优选的，所述不对称还原反应在0.1M,pH8.0的磷酸緩冲液中进行。所述的发酵产物按如下方法制得在发酵培养基中接种膜醭毕赤酵母菌种，接种量体积比5~10%，温度2040。C，培养15天后，得发酵液、或将发酵液过滤得所述湿菌体。本发明中所用发酵培养基各组分终浓度为麦芽糖550g/L,酵母膏100~500g/L，NH4C11~10g/L、KH2P040.5~5g/L，K2HP040.5~5g/L,异于K+的金属离子0.11g/L,pH值49。所述异于K+的金属离子是指通常可应用于培养基的微量金属离子，如A1"、Ba2+、Cu2+、Co2+、Fe3+、Li+、Mn2+、Na+、Sn2+、Zn2+等，通常选用A1C13.6H20、BaCl2.2H20、CuCl22H20、CoCl2.6H20、Fe2(S04)3-6H20、Li2S04.H20、MnS04.7H20、NaMo04.2H20、MgS04.7H20、SnCl2'2H20、ZnS04.7H20等，优选为CoCl2.6H20、MnS04.7H20、NaMo04.2H20，最优选为MnS04'7H20。所述的转化液分离纯化步骤为用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层脱水、脱色后，回收溶剂，得到得所述(R)-3-羟基丁酸乙酯。具体的，所述的方法按如下步骤进行(1)斜面培养接种膜醭毕赤酵母菌株，斜面于28。C培养17天，作为斜面活化种子；(2)种子培养接入斜面活化种子，20~40°C,摇床转速100~250r/min,培养1~5天，作为种子液；(3)发酵培养接种种子液，接种量5~10%体积比，20~40°C，摇床转速100~250r/min,培养1~5天，得发酵液；(4)微生物转化将发酵液或发酵液离心收集的湿菌体，用O.lM，pH8.0的磷酸盐緩冲液清洗后，将湿菌体转入0.1M,pH8.0的磷酸盐緩沖液中，同时加入底物乙酰乙酸乙酯使底物质量浓度为1~50%,湿菌体用量为0.3~6g/g底物，并添加终浓度0.125g/L的葡萄糖，2050°C、100250r/min反应1~40小时,反应结束，离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，再脱水、脱色，蒸发回收溶剂，得所述(R)-3-羟基丁酸乙酯。所用斜面培养基、种子培养基、发酵培养基均可采用适合于酵母菌生长的常规培养基。优选的，所述方法按如下步骤进行(1)斜面培养培养基各组分终浓度为麦芽汁10g/L,酵母粉3g/L,蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L,pH6.5，121。C灭菌20分钟，灭菌后冷却、制成斜面、接种膜醭毕赤酵母菌抹，20~40°C培养17天，作为斜面活化种子；(2)种子培养培养基各组分终浓度为麦芽糖30g/L,酵母膏2g/L,NH4Cl5g/L,KH2P04lg/L,K2HP04lg/L,MnS04.7H200.5g/L,pH6.5，120。C灭菌20分钟，灭菌后冷却、接入斜面活化种子，20~40°C,摇床转速100~250r/min,培养1~5天，作为种子液；(3)发酵培养培养基各组分终浓度为麦芽糖30g/L,酵母膏2g/L,NH4C15g/L,KH2P04lg/L,K2HP04lg/L,MnS04.7H200.5g/L，pH6.5，120。C灭菌20分钟，灭菌后冷却、接种种子液，接种量5~10%体积比，20~40°C,摇床转速100~250r/min，培养15天，得发酵液；(4)微生物转化将发酵液离心、收集菌体，用0.1M,pH8.0的磷酸盐緩冲液清洗后，将湿菌体转入0.1M,pH8.0的磷酸盐緩冲液中，同时加入底物乙酰乙酸乙酯使底物质量浓度为150%，湿菌体用量为0.3~6g/g底物，并添加终浓度0.125g/L的葡萄糖，2050°C、100~250r/min反应1~40小时，反应结束，离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，再脱水、脱色，蒸发回收溶剂，得所述(R)-3-羟基丁酸乙酯。底物EOB与产物EHB的气相色i普(GC)测定反应结束后，用适量的乙酸乙酯萃取，用GC112A气相色谱分析。3会测条件检测器为FID,色谱柱(HP-19091Z-233)大小30mx0.25mmxl.Onm,填料为二曱基聚硅氧烷，载气为氮气，载气流量、空气流量和氢气流量分别为4.0(11.21ml/min)，6.5(304ml/min)和4.5(29.25ml/min)，色谱柱、进样器和检测器的温度分别为70°C、220。C和250°C。以正十二烷为内标。进样0.2(il，内标保留时间为8.90min。产物EHB对映异构体过量值)测定方法如下反应结束后取反应液20ml,加入5ml乙酸乙酯萃耳又两次，再离心(4500r/min)10min使两相分层;将有机相小心移入i走光管充满，测定旋光度A值。从已测定旋光值的有机相中取样1ml，加2(il十二烷(内标物)，混匀后取liil进行气相色i昝分析。根椐3-EHB、十二烷的出峰峰高和事先测出的相对校正因子计算出旋光管中3-EHB的浓度C。3-EHB的比旋光度由下式计算I|=X100式中，1为旋光管的长度(dm),C为3-EHB的浓度(每100毫升中所含的克数)。3-EHB的ee值按下式计算本发明方法相对于传统的化学不对称合成法、面包酵母氧化还原方法或用添加辅酶NADH/NAD+的酶催化不对称还原方法具有以下优点①生成的(/)-EHB对映体过量值高，达到99。/。e.e.以上；②生物催化剂为微生物菌体，可以自行发酵制备，质量稳定，成本低廉；③在整个反应过程中不需要外加辅酶；④反应条件温和，环境友好。本发明通过自行筛选，采用膜醭毕赤酵母CP/c/z/amew6ra"ae///a"w")作为产酶菌抹，在单一水相体系中催化不对称还原EOB生成的("-EHB对映体过量值达到99。/。e.e.,且获得产物光学纯度高、浓度高，具有重大应用前景。(四)图1为不同的菌体量对转化的影响；图2为不同的葡萄糖加量对转化的影响；图3为转化时间曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此实施例l:产羰基还原酶微生物菌林的筛选取膜醭毕赤酵母-218(由浙江工业大学提供)、红酵母-2.102(由浙江工业大学提供)、产朊假丝酵母1257-2.12(由浙江工业大学提供)、活性干酵母(哈尔滨马利酵母有限公司提供)、热带假丝酵母104(由浙江工业大学提供)菌种，分别按如下方法进行培养及转化反应斜面培养培养基组成为(终浓度)麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L,葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，pH6.5,12rC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种，菌种为表1所示的各种微生物菌林，28。C培养2天，作为斜面活化种子。种子培养培养基组成为(终浓度)麦芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH4C15g/L,KH2P04lg/L，K2HP04lg/L，MgS04.7H200.4g/L,pH6.5,装液量为250ml三角并瓦装液75ml,120。C灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，置旋转式摇床，200rpm,30。C培养1天，作为种子液；发酵培养培养基组成为(终浓度)麦芽糖30g/L,酵母膏2g/L,NH4C15g/L,KH2P04lg/L,K2HP04lg/L,MgS04.7H200.4g/L,pH6.5，装液量为250mL三角瓶装液75mL,120。C灭菌20分钟，灭菌后冷却接种种子液(接种量10%体积比)，置旋转式摇床，200rpm,3(TC培养1天，得发酵液；发酵液中湿菌体量约为10g/100mL,离心10分钟(5000转/分钟)收集菌体，用磷酸钠緩冲液(0.1M,pH8.0)洗涤两次，将菌体转入20ml相同组成的緩冲液中，同时加入0.6g底物(EOB),于30。C，200转/分钟下反应。反应结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，过滤后进行气相色谙分析(i)-EHB含量与对映体过量值。结果如表1:表l:产羰基还原酶微生物菌抹的筛选<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>用月莫醭毕赤酵母-218(P/c/H'flwewZ)ra""e/ac^"s//a"化"-218),4要实例1方法进行培养，20mL反应体系中含底物EOB量为0.6g,将种子培养基和发酵培养基中MgS(V7H20置换为其他金属离子，舍量分別为0.05g/L和0.5g/L，其他转化反应条件同实施例1,反应2h后取样，进行分析，结果如表2。表2:不同金属离子对酶活的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结论金属离子CoCl2、MnS04、NaMo04对R-EHB的生物合成有促进作用，特别是添加MnSQ4，可使酶活提高9.7%。而添加其他金属离子反而不利于产酶。实施例3:用月莫醭毕赤酵母-218CP/c/z/awew6ra"ae/ac/em//araew-218),才安实例1方法发酵培养24小时后，发酵酶液中湿菌体量为10g/100mL，称取湿菌体加于250mL三角瓶装0.1M,pH8.0磷酸钠盐緩冲液20mL中，使湿菌体浓度为10140g/L,起始底物EOB量为0.6g/瓶(湿菌体量为0.22.8g/瓶，即0.34.7g/g底物)，于30。C，200rpm下进行转化反应。16小时后反应结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgS04干燥，过滤后进行气相色谙分析(R)-EHB含量与对映体过量值，结果见图1。结论从图l可以看出，产物得率随着转化液中细胞量的增加而增大，当细胞量达到100g/L(即3.3g/g底物)，产物得率可达94.8%,而对映体过剩量也可达到99%。当细胞量继续增加到140g/L(即4.7g/g底物)，产物得率和对映体过剩量分别为95.0%和99%,与细胞量为100g/L的转化结果相近，因此我们选用100g/L(即3.3g/g底物)为生物转化反应的细胞浓度。实施例4:用膜醭毕赤酵母-218CP/c/z/awemZ)ra"ae/ac/era//a"w"-218)，按实例1方法发酵培养24小时后，发酵酶液中湿菌体量为10g/100mL,称取湿菌体加入装有20ml的0.1M,pH8.0磷酸钠緩冲液的250ml三角瓶中，使湿菌体量为100g/L，底物EOB量为0.6g/瓶，添加终浓度025g/L的葡萄糖，于3(TC,200rpm下进行转化反应。16小时后反应结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgS04干燥，过滤后进行气相色谱和旋光仪分析(R)-EHB含量与对映体过量值，结果见图2。结论从图2可以看出，葡萄糖的最佳浓度为10g/L。实施例5:用膜醭毕赤酵母-218(尸/c/z/amew6ra加e/ac/msi/a""w-218),按实例l方法发酵，20ml反应体系中含底物EOB量为0.6g,其他转化反应条件同实施例1。于反应不同时间取样，进行气相色谱分析(7,-EHB含量并计算转化产率，用旋光仪测定旋光度并计算e.e.值，结果见图3。结论从图3中可以发现，反应进行到16h左右时基本已经完成，产率可达95%左右，e.e.值保持在99。/o左右。因此确定最佳反应时间为16h。权利要求1.一种微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，所述方法是以乙酰乙酸乙酯为底物，以膜醭毕赤酵母(PichiamembranaefaciensHansen)细胞为酶源，进行微生物催化不对称还原反应，反应结束后转化液经分离纯化得到所述的(R)-3-羟基丁酸乙酯。2.如权利要求1所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述膜醭毕赤酵母细胞来自膜醭毕赤酵母经发酵培养获得的发酵液或由发酵液过滤得到的湿菌体。3.如权利要求1或2所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述底物质量浓度为150%，加入发酵产物使湿菌体量为0.3~6g/g底物，所述不对称还原反应的反应温度为20~50°C,反应时间为140小时。4.如权利要求3所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于反应体系中添加有葡萄糖，添加量为0.125g/L。5.如权利要求4所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述不对称还原反应在0.1M,pH8.0的磷酸緩冲液中进行。6.如权利要求1所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的发酵产物按如下方法制得在发酵培养基中接种膜醭毕赤酵母菌种，接种量体积比5~10%，温度2040。C,培养15天后，得发酵液、或将发酵液过滤得所述湿菌体。7.如权利要求6所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的发酵培养基各组分终浓度为麦芽糖5~50g/L，酵母膏100~500g/L，NH4C11~10g/L、KH2P040.5-5g/L，K2HPO40.5~5g/L,异于K+的金属离子0.1lg/L，pH值49。8.如权利要求1所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的转化液分离纯化步骤为用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层脱水、脱色后，回收溶剂，得到所述(R)-3-羟基丁酸乙酯。9.如权利要求1所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的方法按如下步骤进行(1)斜面培养接种膜醭毕赤酵母菌抹，斜面于28t:培养1~7天，作为斜面活化种子；(2)种子培养接入斜面活化种子，20~40°C,摇床转速100~250r/min,培养15天，作为种子液；(3)发酵培养接种种子液，接种量5~10%体积比，20~40°C,摇床转速100~250r/min,培养1~5天，得发酵液或湿菌体；(4)微生物转化将发酵液或发酵液离心收集的湿菌体，用0.1M,pH8.0的磷酸盐緩冲液清洗后，将湿菌体转入0.1M，pH8.0的磷酸盐緩冲液中，同时加入底物乙酰乙酸乙酯使底物质量浓度为1~50%,湿菌体用量为0.36g/g底物，并添加终浓度0.125g/L的葡萄糖，20~50°C、100~250r/min反应1~40小时，反应结束，离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，再脱水、脱色，蒸发回收溶剂，得所述(R)-3-羟基丁酸乙酉旨。10.如权利要求1所述的微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行(1)斜面培养培养基各组分终浓度为麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L,蛋白胨5g/L,葡萄糖10g/L，琼脂20g/L,pH6.5,121°C灭菌20分钟，灭菌后冷却、制成斜面、接种膜醭毕赤酵母菌抹，2040。C培养l7天，作为斜面活化种子；(2)种子培养培养基各组分终浓度为麦芽糖30g/L，酵母膏2g/L,NH4C15g/L，KH2P04lg/L，K2HP04lg/L，MnS047H200.5g/L,pH6.5,120。C灭菌20分钟，灭菌后冷却、接入斜面活化种子，20~40°C,摇床转速100~250r/min，培养1~5天，作为种子液；(3)发酵培养培养基各组分终浓度为麦芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH4CI5g/L,KH2P04lg/L,K2HP04lg/L,MnS04,00.5g/L,pH6.5,12(TC灭菌20分钟，灭菌后冷却、接种种子液，接种量5~10%体积比，20~40°C,摇床转速100~250r/min,培养15天，得发酵液；(4)微生物转化将发酵液离心、收集菌体，用0.1M,pH8.0的磷酸盐緩沖液清洗后，将湿菌体转入0.1M,pH8.0的磷酸盐緩冲液中，同时加入底物乙酰乙酸乙酯使底物质量浓度为150%,湿菌体用量为0.36g/g底物，并添加终浓度0.125g/L的葡萄糖，2050。C、100~250r/min反应1~40小时,反应结束，离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，再脱水、脱色，蒸发回收溶剂，得所述(R)-3-羟基丁酸乙酯。全文摘要本发明提供了一种微生物转化制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，所述方法是以乙酰乙酸乙酯为底物，以膜醭毕赤酵母(PichiamembranaefaciensHansen)的发酵产物为酶源，进行微生物催化的不对称还原反应，反应结束后转化液经分离纯化得到所述的(R)-3-羟基丁酸乙酯。本发明通过自行筛选采用膜醭毕赤酵母作为产酶菌株，在单一水相体系中催化不对称还原EOB生成(R)-EHB的产率达到95％，对映体过量值(e.e.)达到99％，即获得产物光学纯度高、浓度高，具有重大应用前景。文档编号C12P7/62GK101210258SQ200610155720公开日2008年7月2日申请日期2006年12月31日优先权日2006年12月31日发明者何军邀,莺周,欧志敏,普王申请人:浙江工业大学