质粒dna的纯化方法

文档序号:431808阅读:2324来源:国知局
专利名称:质粒dna的纯化方法
技术领域
本发明涉及从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的一种方法,所述方法包括(a)裂解含有超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞,形成宿主细胞溶胞产物;和(b)通过絮凝宿主细胞碎片来澄清步骤(a)中所述的溶胞产物。裂解微生物宿主细胞可以在溶菌酶存在下或者在没有溶菌酶存在的情况下进行。在本发明的一个实施方案中宿主细胞碎片用聚乙二醇(PEG)进行絮凝。用于澄清细胞溶胞产物的絮凝剂,包括但不仅限于聚乙二醇,可以作为溶解缓冲液(例如标准STET缓冲液)的一个组成成份包括在内,或者在裂解细胞后再加入溶胞产物中。絮凝的宿主细胞碎片能以如沉降、倾倒或离心的方法,包括但不限于连续离心,从宿主细胞溶胞产物中除去,最后得到澄清的溶胞产物。在去除絮凝的细胞碎片后,澄清后的细胞溶胞产物中的超螺旋质粒DNA用下游纯化工艺可进一步从残留污染物中纯化出来。因此,本发明的一个实施方案涉及使用此处描述的上游纯化工艺生产含超螺旋质粒DNA的澄清的宿主细胞溶胞产物的一种方法。
本发明还涉及从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的一种方法,所述方法包括(a)裂解含超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞,形成宿主细胞溶胞产物;(b)调节步骤(a)中得到的宿主细胞溶胞产物至碱性pH,然后再中和;(c)通过絮凝宿主细胞碎片,来澄清步骤(b)所述的pH调节后的细胞溶胞产物。在此描述的调至碱性pH然后再中和的步骤有助于制备宿主细胞溶胞产物来用于絮凝过程;不过,所述的溶胞产物的pH调节既可在加入絮凝剂之前进行,也可以在加入之后进行。在本发明的一个实施方案中,用一定浓度的碱溶液将最初细胞溶胞产物的pH值调至碱性(比如,大概12-13),使可溶的宿主细胞染色质DNA能够变性。然后将已调至碱性的细胞溶胞产物加入一定浓度的酸溶液中和至接近初始裂解缓冲液的pH值,优选使细胞溶胞产物的pH介于8-9之间。因此,本发明的一个实施方案涉及到一种从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法,所述方法包括(a)在生理缓冲液中裂解含有超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞,形成宿主细胞溶胞产物;(b)将步骤(a)的宿主细胞溶胞产物调节至碱性pH值,即向所述的溶胞产物中加入碱,升高其pH值至约12至约13之间;(c)中和步骤(b)中碱化的细胞溶胞产物,使其pH值大约为细胞裂解时的生理缓冲液的pH;(d)通过加入絮凝剂,包括但不仅限于PEG,絮凝宿主细胞碎片,澄清所述的碱化又中和后的溶胞产物。
应用本发明所述的上游裂解和溶胞产物澄清技术后,能进行多种下游的纯化过程,包括但不仅限于(i)使用阳离子去垢剂,包括但不仅限于CTAB,来从澄清后的溶胞产物中沉淀质粒DNA;(ii)用盐溶液溶解质粒;(iii)用水合硅酸钙吸附残留杂质;(iv)在进行最后临床级质粒制备前,使用聚乙二醇或醇来沉淀纯化的质粒DNA。
本发明还涉及一种从大规模发酵方案中提取临床级质粒DNA的新型下游纯化工艺,即使用最后的浓缩/精加工步骤得到粉状的质粒DNA产品。本发明的下游纯化工艺的作用是,从前期纯化所得到的富含超螺旋质粒DNA的溶胞产物中除去残留杂质。因此,本发明涉及一种从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法,所述方法包括(a)沉淀所述的超螺旋质粒DNA;(b)用切向流过滤模式的微孔过滤浓缩所述的沉淀后的超螺旋质粒DNA。在步骤(a)中沉淀超螺旋质粒DNA可用大家熟知的方法,使用聚乙二醇或醇类包括但不仅限于乙醇、甲醇和异丙醇。步骤(b)中的微孔过滤可直接替代在质粒DNA纯化工艺中最后浓缩/交换缓冲液过程中常用的超滤法,能减小循环率、滤膜面积以及整个批次的体积。
在本发明的一个实施方案中,作为在此公布的新型下游浓缩/精加工纯化工艺的第一步骤,使用PEG将超螺旋质粒DNA从富含它的澄清细胞溶胞产物(即通过上游工艺和前期的下游纯化工艺富集超螺旋质粒DNA的宿主细胞溶胞产物)中沉淀出来。然后将所述的沉淀质粒DNA进行切向流过滤模式下的微孔过滤。因此,本发明的一个实施方案涉及一种从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法,所述方法包括(a)使用PEG沉淀所述的超螺旋质粒DNA;(b)使用切向流过滤模式下的微孔过滤浓缩该沉淀后的超螺旋质粒DNA。本发明提涉的微孔过滤可能是一种分级过滤工艺的一部分。因此,在本发明的一个实施方案中,上述PEG沉淀的超螺旋质粒DNA通过一种分级过滤工艺得以浓缩,该分级过滤工艺包括第一个过滤步骤,其中使用微孔过滤和后续的透析过滤浓缩沉淀的质粒DNA浆液,并清除残留的RNA和杂质。第二个过滤步骤用乙醇置换DNA沉淀中的聚乙二醇,并进一步浓缩质粒DNA,最后得到一种脱水质粒DNA的湿品,其可干燥后获得细粉状质粒DNA。该第二步过滤可以在一种过滤干燥设备中进行,在搅动细胞的操作下(如,单板Nutsche过滤干燥器)允许加压过滤和真空干燥。因此本发明涉及一种从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法,所述方法包括(a)使用PEG沉淀所述的超螺旋质粒DNA;和(b)用分级过滤工艺,包括切向流过滤模式下的微孔过滤,浓缩所述的沉淀后超螺旋质粒DNA。所述的分级过滤工艺包括(a)第一个过滤浓缩步骤,包括切向流过滤模式下的微孔过滤;(b)第一个透析过滤步骤,使用含有PEG的透析过滤缓冲液进行透析过滤,该透析过滤缓冲液中含有足够浓度的PEG和任选盐以保持所述的超螺旋质粒DNA的沉淀状态;(c)脱水步骤,加入乙醇对沉淀的超螺旋质粒DNA进行部分脱水;(d)第二次的过滤浓缩步骤;和(e)第二次的透析过滤步骤,用100%(v/v)乙醇进行透析过滤。在其它实施方案中,第二次的过滤和透析过滤,步骤(d)和步骤(e),是在一个过滤干燥器中,包括但不仅限于单板Nutsche过滤干燥器,以加压和搅动细胞模式进行的。
本发明涉及从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法,所述方法包括(a)使用醇类,包括但不仅限于乙醇、甲醇和异丙醇,沉淀超螺旋质粒DNA;(b)使用切向流过滤模式下的微孔过滤来浓缩所述沉淀的质粒DNA。在本发明该部分的一个实施方案中,所述微孔过滤浓缩步骤是一个分级过滤工艺的一部分,包括(a)第一次过滤浓缩步骤,包括切向流过滤模式下的微孔过滤;(b)使用乙醇溶液进行第一次透析过滤步骤,其中该溶液的乙醇浓度足以保持所述超螺旋质粒DNA的沉淀状态;(c)第二次过滤浓缩步骤;和(d)使用100%(v/v)乙醇进行第二次透析过滤步骤。在另一个实施方案中,第二次过滤和透析过滤,步骤(c)和步骤(d),是在一个过滤干燥器中,包括但不仅限于单板Nutsche过滤干燥器,以加压和搅动细胞模式进行的。
作为本处可交替使用的术语“临床级质粒DNA”和“药用级质粒DNA”指从宿主细胞中分离制备的质粒DNA,其纯度能够达于用于人体进行任何已知的预防和治疗的要求,包括但不仅限于基因治疗和/或多聚核苷酸疫苗的应用。
这里使用的“非超螺旋质粒DNA”指任何不是超螺旋质粒DNA的DNA,包括任何其它形式的,比如缺刻的、开环的、线性的质粒DNA,以及宿主基因组DNA。
这里使用“NTU”指标准化浊度单位。浊度定义为使用一种光学领域的液面下探头对液体中颗粒的“计数”。溶液浊度能用基于激光的光散射装置进行测定。
这里使用的“PEG”指聚乙二醇。
这里使用的“OD600”是600nm处的光密度值,由一种光散射分光光度计测定的每毫升细胞数。
这里使用的“L.O.D.”指检测极限。
这里使用的“MW”是道尔顿分子量。
这里使用的“LRATM”指除脂试剂TM 这里使用的“CTAB”指溴化十六烷基三甲铵或西曲溴铵。
这里使用的“hcCaSiO3”指水合结晶硅酸钙。
这里使用的“IPA”指异丙醇。
这里使用的“MF”指微孔过滤。
这里使用的“UF”指超滤。
这里使用的“STET缓冲液”指含有约50mM Tris-HCl(pH 7.0-9.0)、约50-100mM EDTA、约8%蔗糖以及约2%

-X-100的缓冲液。



图1展示了沉降超过两天的大肠杆菌溶胞产物。在瓶1中的溶胞产物是用STET缓冲液(本处定义的)重悬细胞并与溶菌酶(500U/mL)在20℃孵育得到。瓶2中的溶胞产物与瓶1中的相似,只是在用溶菌酶孵育后,先加碱将pH调至pH 12,再加酸中和。瓶3中的溶胞产物用含3%PEG 3000的STET缓冲液重悬细胞并与溶菌酶在20℃孵育得到。瓶4中的溶胞产物与瓶3中相似,只是像瓶2描述那样,先后加入碱和酸进行碱化后再中和。本图显示了PEG作为絮凝剂从碱性溶胞产物中絮凝细胞碎片的潜力。
图2展示了装有不同细胞溶胞产物的50ml离心管,这些溶胞产物的起始OD600都是45,然后在16,000×g下离心了5min。管1中的溶胞产物是用STET缓冲液重悬细胞并与溶菌酶在20℃孵育得到。管2中的溶胞产物与管1中相同,只是与溶菌酶孵育后进行了碱化再中和(如图1中所述)。管3中的溶胞产物是用含3%PEG 3000的STET缓冲液重悬细胞并与溶菌酶在20℃孵育得到。管4中溶胞产物与管3中相同,只是与溶菌酶孵育后进行了碱化再中和。管5中的溶胞产物与管2中的相同,只是在碱化再中和步骤后加入了PEG。管6中的溶胞产物与管2中的相同,只是在碱性pH调节/中和步骤后加入了终浓度为5%的PEG 3000。
图3显示了图2中展示的溶胞产物的浊度测量值。
图4A和图4B显示了PEG分子量和絮凝大肠杆菌细胞碎片的效果。细胞与溶菌酶孵育后,进行碱性pH调节/酸中和。将不同分子量(PEG 400-6000)的PEG贮液分别加入10ml等份试样的溶胞产物中,得到PEG终浓度大概介于1.0%至15.0%之间。所得混合物在室温下沉降大约16小时,然后测定各OD600值(图4A)。图4B显示了只用PEG3000时OD600依赖性与溶液中DNA浓度的相关曲线。
图5显示了对于溶菌酶/pH调节后的溶胞产物中提高的PEG 6000浓度(0-8%w/v),质粒DNA沉降曲线。
图6A和6B对比了大规模质粒DNA纯化工艺中两种终浓缩/精加工步骤的一般过程流程图。
图7A和7B描述了DNA在不同PEG溶液中的溶解性。图7A显示在PEG 8000溶液中,当PEG浓度大于2%w/v时,DNA的溶解性将大幅下降。但在所研究范围内,溶液温度和DNA浓度则对DNA的溶解性没有影响。图7B显示,在所研究范围内,DNA完全溶于400分子量的PEG中;而随着分子量的增加,沉淀DNA所需PEG的临界质量降低。
图8描述了在PEG 8000中DNA沉淀的动力学。图8显示了5分钟后,初始DNA有大于99%的都发生了沉淀。
图9A和9B显示了质粒DNA在水-乙醇混合物中的溶解性数据。NaCl浓度是基于无乙醇时的浓度。图9A显示了NaCl浓度从1.8到3.4M时对质粒的溶解性几乎没有什么影响。在图9B中,对低浓度的NaCl与几种不同浓度的乙醇一起进行了研究。虚线表示质粒的浓度,如没有沉淀,在每个溶液中都应出现。
图10显示了在不同浓度的乙醇中NaCl的溶解性。
图11显示了在两个IPA浓度不同的IPA-NaCl系统中,“盐析”和“盐溶”的极限。
图12A与12B描述了质粒在含有氯化钠和醋酸钠的25%(A)或67%(B)IPA中的溶解度。
图13显示了质粒DNA从3M NaCl溶液中沉淀(0.22μm的纤维素膜,2.1cm2的过滤面积,20in.Hg真空)死端式过滤数据的Vmax曲线。该过滤数据首先从初始浓度为40%的乙醇中校准,然后再增加乙醇至50%浓度。在t/V对V的关系曲线上,相对直的线性表明了一个几乎不可压缩的滤饼。在50%乙醇中,可以观察到过滤效率显著增高。
图14A显示了沉淀质粒的微孔过滤期间随时间变化收集到的渗透体积。对每个数据组都出示了沉淀悬浊液的初始DNA浓度;初始悬浊液体积为500ml。在整个实验过程中没有降低渗透流出量并在过滤时一直维持压力读数为10psig,悬浊液可以很容易地以15mL/min流速进行过滤。图14B显示了沉淀质粒的80%v/v乙醇悬浊液在进行透析过滤时乙醇和NaCl的浓度。
图15A-C显示了在切向流过滤模式(TFF)条件下的微孔过滤时进行三种连续乙醇沉淀的尝试,在过滤期间使用Masterflex size 14(5/16″)管输送和加入乙醇。图15A显示了使用100kD PES膜和40%v/v乙醇沉淀进行连续沉淀/微孔过滤研究的结果。输送至滤筒的流速大约为30ml/min。大约收集到200ml渗透液时,流量需下降至初始值的20%。图15B显示了使用0.1微米PVDF膜和40%v/v乙醇沉淀进行连续沉淀/微孔过滤研究的结果。输送流速也大约为30ml/min,但在容器和滤器之间含1分钟延迟时间。图15C显示了一个与图15B相似实验的结果(0.1微米PVDF膜,1分钟延迟时间),但使用了50%的乙醇而不是40%的乙醇来进行质粒DNA的沉淀。在用40%v/v乙醇尝试时,渗透液流量的下降程度轻微减弱(图15B),但压力的升高使过滤实验难以连续进行超过30分钟。
图16A和16B显示了使用TFF模式的微孔过滤所进行的两种连续乙醇沉淀的尝试,在过滤期间使用HPLC管道输送和加入乙醇。图16A显示了使用40%浓度乙醇进行的连续沉淀/微孔过滤并没有延迟时间。
图17A和17B显示了使用实施例8所述的质粒DNA纯化工艺的两个纯化流程中的过程产量(A)和杂质含量(B)。每个质粒的纯化都开始于由17.5-18.6L的发酵液处理出来的75-80L OD600=70的大肠杆菌溶胞产物。图17A比较了在纯化艺中的不同阶段超螺旋质粒DNA质量数(“scDNA(g)”)和超螺旋DNA百分比(“%scDNA”)细胞溶胞产物(“Lys”);通过絮凝宿主细胞碎片后的澄清溶胞产物(“CL”);由硅酸钙第一次吸附和过滤后的DNA浆(“LRA1F”);由硅酸钙第二次吸附和过滤后的DNA浆(“LRA2F”);重悬在PEG沉淀和后续微孔过滤步骤中成为干粉的DNA(“FRB”)。图17B在图17A描述的纯化工艺的同一阶段比较了内毒素的量(log EU/mL),蛋白含量(%)和RNA含量(%)。
图18显示了用BCA法测定在PEG 6000絮凝的细胞溶胞产物经最终CTAB沉淀后的蛋白含量,这里的CTAB是由加入含2%(w/v)CTAB的40mM NaCl溶液的方式引入的。
发明详述 本发明涉及一种纯化临床级质粒DNA的可调节的方法学,该方法可降低生产成本并提高生产工艺的稳定性。通常认为质粒DNA纯化的主要单元操作包括细胞溶解、过滤(微孔过滤/超滤)以及色谱分离。然而,在大规模分离药用级质粒DNA时,所述的被确认为是主要单元操作的方法一定要适应生产目标,即高产量和最低单位成本下的高质量。比如,原材料的花费,如树脂和缓冲液,在应用于大规模质粒DNA纯化工艺时,已发现多步层析造成了高昂单位成本以及低下的生产量。在最近公开的一份美国专利申请No.09/875,379(美国
发明者D·B·博伊德, A·J·克里斯托佩特, R·J·兰德, J·C·墨菲, M·A·温特斯 申请人:默克公司
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