在包含植物蛋白水解产物的无血清细胞培养液中生产多肽的制作方法

专利名称：：在包含植物蛋白水解产物的无血清细胞培养液中生产多肽的制作方法在包含植物蛋白水解产物的无血清细胞培养液中生产多肽发明领域本发明涉及用于在无血清培养液中于真核细胞中生产目的多肽的改进方法。发明背景用于在真核细胞中大规模生产多肽例如凝血因子VII多肽的方法是本领域已知的，参见例如WO02/29083、WO02/29084和WO03/29442。在多肽例如凝血因子VII多肽的大规模生产中，出于经济原因希益。此外，设想在较长的时间段内更均匀的多肽生产速率将致使多肽批次更均一，因为认为对于"非应激的"细胞培养，翻译后过程(例如糖基化和Y-羧酸的形成)可更精确地进行。WO01/23527公开了用于无蛋白质和无血清细胞培养的细胞培养基。该培养基包含一定比例的大豆水解产物(大豆蛋白胨)。发明简述本发明涉及在培养过程中改变细胞培养液中的植物蛋白水解产物组分的浓度，以便，同时，1)在繁殖阶段期间实现最佳细胞生长，和2)在生产阶段中实现最佳的、长期的、关于性能的培养稳定性，并且从而增加所考虑的多肽例如凝血因子VII多肽的总产率。本发明的第一个方面涉及用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产多肽的方法，所述方法包括(i)所述细胞的繁殖阶段，其中使所述细胞在第一种细胞培养液中繁殖，和(ii)所述细胞的生产阶段，其中所述细胞存在于第二种细胞培养液中，其中所述细胞培养液各自包含植物蛋白水解产物，并且其中第一种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(d)和第二种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C2)之比为至少1.5:1(C1:C2)。本发明的第二个方面涉及用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述细胞的繁殖阶段，其中使所述细胞在第一种细胞培养液中繁殖，和(U)所述细胞的生产阶段，其中所述细胞存在于第二种细胞培养液中，其中所述细胞培养液各自包含植物蛋白水解产物，例如大豆蛋白水解产物，并且其中所述第二种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C2)为0.7-3.0g/L。附图简述图1举例说明了培养过程的流程图。图2的图表显示了来自在20L发酵罐中的微载体培养的结果，参照实施例1。图3的图表显示了来自在500L发酵罐中的微载体培养的结果，参照实施例2。发明详述如上所述，本发明的一个主要方面涉及用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产多肽的方法，所述方法包括(i)所述细胞的繁殖阶段，其中使所述细胞在第一种细胞培养液中繁殖，和(ii)所述细胞的生产阶段，其中所述细胞存在于第二种细胞培养液中，其中所述细胞培养液各自包含植物蛋白水解产物，并且其中第一种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(d)和第二种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C2)之比为至少1.5:1(C1:C2)。术语"大规模生产"指涉及至少IOOL的培养容器的生产。然而，在优选实施方案中，规模一般为至少250L，例如至少500L，例如至少1000L或甚至5000L或更大。术语"大规模，，可以与术语"工业规模"和"生产规模"互换使用。用于大规模生产多肽的方法一般在至少120小时例如1-26周的时间段内进行。本发明应被理解为迄今已知的用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产多肽的方法的改进。已知在此类方法中使用植物蛋白水解产物，但本发明提供了用于改进此类方法的结果的指导。本发明主要方面的方法的特征是，以使得繁殖阶段以及生产阶段最优化的方式控制细胞培养液中植物蛋白水解产物的含量。这是通过确保第一种细胞培养液(用于繁殖阶段)中植物蛋白水解产物的浓度(d)和第二种细胞培养液(用于生产阶段)中植物蛋白水解产物的浓度(C2)之比为至少1.5:1(d:C2)来完成的。通常，细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度为0.01-10.0g/L。在某些实施方案中，在繁殖阶段期间可以使用约5.Og/L的浓度(d)，然后减少浓度从而使得第二种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C2)在生产阶段开始时是例如l.Og/L。随后，在生产阶段期间，浓度可以维持在基本上固定的水平，或可以备选地在低和高值之间例如在l.Og/L和2.0g/L之间增加和减少，以便维持稳定的培养。这也就是说，比例d:C2优选为2:1-10:1,例如2.5:1-8:1或3:1-6:1。此外，浓度C2—般为0.2-3.5g/L，例如0.7-3.0g/L，例如0.9-2.5g/L,例如0.9-2.2g/L，和浓度C！一般为4.0-10.0g/L,例如4.5-8.0g/L。如上所述，在生产阶段过程中略微改变植物蛋白水解产物的浓度有时是有利的，例如，通过改变在上文给出的范围之一内的浓度，例如在O.2-3.5g/L的范围内，例如在O.7-3.0g/L的范围内，例如在O.9-2.5g/L的范围内，例如在O.9-2.2g/L的范围内的浓度。备选地，浓度保持在基本上固定的水平。植物蛋白水解产物可以从各种来源之一获得，例如商业来源。水解产物的一般类型是大豆蛋白水解产物、小麦蛋白水解产物、豌豆蛋白水解产物、水稻蛋白水解产物等。引入本文作为参考的W001/23527Al公开了大豆蛋白水解产物的制备和一般用途。优选地，植物蛋白水解产物是大豆蛋白水解产物。本发明一般不限于生产特定的多肽或使用特定的真核细胞。但是，下文还是提供了相关多肽和有用的真核细胞的举例说明性的实例。然而，在某些本发明的当前最令人感兴趣和优选的实施方案中，所述多肽是凝血因子VII多肽。此外，在此类实施方案中，真核细胞通常选自CH0、BHK、HEK293、骨髓瘤细胞等。因此，本发明主要方面的一个优选实施方案涉及用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述细胞的繁殖阶段，其中使所述细胞在第一种细胞培养液中繁殖，和(ii)所述细胞的生产阶段，其中所述细胞存在于第二种细胞培养液中，其中所述第一种细胞培养液包含浓度为4.0-10.0g/L的大豆蛋白水解产物，所述第二种细胞培养液包含浓度为0.2-3.5g/L的大豆蛋白水解产物，并且其中所述第一种细胞培养液中大豆蛋白水解产物的浓度(d)和所述第二种细胞培养液中大豆蛋白水解产物的浓度(c2)之比为至少1.5:1(d:C2)。本发明的另一方面涉及用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述细胞的繁殖阶段，其中使所述细胞在第一种细胞培养液中繁殖，和(ii)所述细胞的生产阶段，其中所述细胞存在于第二种细胞培养液中，其中所述细胞培养液各自包含植物蛋白水解产物，例如大豆蛋白水解产物，并且其中所述第二种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C2)为0.7-3.0g/L。优选地，浓度C2为0.9-2.5g/L，例如0.9-2.2g/L。在一个实施方案中，所述细胞培养液各自包含植物蛋白水解产物，并且其中第一种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(d)和第二种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C2)之比为至少1.5:1,例如2:1-10:1，例如2.5:1-8:1或3:1-6:1。优选地，浓度C!为4.0-10.0g/L，例如4.5-8.0g/L。到目前为止获得的结果表明，在生产阶段中植物蛋白水解产物浓度太高将不可逆地损害培养，从而导致相当短的有效生产阶段(参见，例如图2,,5.0g/L水解产物)，而植物蛋白水解产物浓度太低将不利于培养，但为可逆方式。在生产阶段中植物蛋白水解产物浓度太低可能导致细胞数目减少，从而减少产物浓度，但已显示这可以通过略微升高植物蛋白水解产物浓度来克服。不希望束缚于任何特定理论，认为植物蛋白水解产物浓度的特性有利地具有下列特性在所述繁殖阶段中的高浓度(d);在所述生产阶段中的低浓度-低水平A(C2A);在所述生产阶段中的低浓度-低水平B(C2B);在所述生产阶段中的低浓度-低水平A(C2A);在所述生产阶段中的低浓度-低水平B(C2B);等，其中C,〉C2B〉Cu，并且浓度C"和C2B在对于C2而指定的浓度范围内，并且其中当在例如2-5天内已观察到细胞数目逐渐减少时，进行从低水平A(C2A)至低水平B(C2B)的首次转换，和当细胞数目已恢复至大约相应于减少前水平的水平时，进行从低水平B(C2B)至低水平A(C2A)的后续转换。优选地，浓度Cu为0.2-2.0g/L，例如0.7-1.5g/L，例如0.9-1.3g/L,例如0.9-1.2g/L，和浓度C2B优选为1.0-3.5g/L,例如1.1-3.0g/L,.例如1.2-2.5g/L，例如1.2-2.2g/L。术语"培养液"意指在合适的液体介质中包含真核细胞培养物的液体。在一个重要的实施方案中，通过附着在固体微载体表面上或通过附着至或物理包载在大孔微栽体的内部结构中来固定细胞。这将在下文中进一步详细解释。^于义魂模政产^多农如上所述，本发明涉及与改进的真核细胞大规模培养有关的方法，所述真核细胞表达一种或多种目的蛋白，所述目的蛋白来自外源基因或在将编码该蛋白质的重组基因导入此类细胞中之后产生。这样的蛋白质包括，但不限于，凝血因子VII多肽；凝血因子VIII;凝血因子IX;凝血因子X;蛋白C;组织因子；凝乳酶；生长激素，包括人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；曱状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；a-l-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；心房钠尿肽；肺表面活性物质；纤溶酶原激活剂，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA);铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-a和-P;脑啡肽酶；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-a);血清白蛋白例如人血清白蛋白；苗勒抑制物质(mullerian-inhibitingsubstance);松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，例如P-内酰胺酶；DM酶；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子的受体；整合素；蛋白A或D;类风湿因子；神经营养因子例如骨源性神经营养因子(BDNF),神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子例如NGF-P，血小板衍生生长因子(PDGF);成纤维细胞生长因子例如a-FGF和P-FGF;表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF)例如TGF-a和TGF-P，胰岛素样生长因子-1和-II(IGF-I和IGF-II);CD蛋白例如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19;促红细胞生成素；骨资导因子(osteoinductivefactors);免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP);干扰素例如干扰素-a、-p和-y;集落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白介素(ILs);例如IL-1至IL-10;超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原例如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；抗体；和上述多肽中任何一种的片段。在本发明的优选实施方案中，所述多肽是凝血因子VII多肽。在关于这点的某些实施方案中，用于实践本发明的细胞是表达外源的凝血因子VII基因的人细胞。在这些细胞中，外源基因可以是完整的或可以已被原位修饰，或者在凝血因子VII基因之外的序列可以已被原位修饰以改变外源的凝血因子VII基因的表达。在关于这点的其他实施方案中，来自任何真核来源的细胞是经改造的以从重组基因表达人凝血因子VII。如本文所使用的，术语"凝血因子VII多肽"和"FVII多肽"表示包含野生型人凝血因子Vila(即，具有美国专利号4，784,950中/>开的氨基酸序列的多肽)的氨基酸序列1-406的任何蛋白质、其变体，以及凝血因子VII相关多肽、凝血因子VII衍生物和凝血因子VII缀合物。这包括显示出相对于野生型人凝血因子Vila来说基本上相同或改进的生物学活性的FVII变体、凝血因子VII相关多肽、凝血因子VII衍生物和凝血因子VII缀合物。术语"凝血因子VII"希望包括其未切割(酶原)形式的凝血因子VII多肽，以及已经经蛋白水解加工而产生它们各自的生物活性形式的那些，其可以称为凝血因子VIIa。通常，凝血因子VII在第152位和第153位残基之间切割而产生凝血因子VIIa。凝血因子VII的此类变体可以显示出相对于人凝血因子VII来说不同的性质，包括稳定性、磷脂结合、改变的比活性等。如本文所使用的，"野生型人FVIIa"是具有美国专利号4,784，950中公开的氨基酸序列的多肽。如本文所使用的，"凝血因子VII相关多肽"涵盖了这样的多肽，包括变体，其中凝血因子Vila的生物学活性相对于野生型凝血因子Vila的活性来说已经实质上进行了修饰，例如减少。这些多肽包括，酸序列改变的凝血因子VII或凝血因子VIIa。如本文所使用的，术语"凝血因子VII衍生物"意指显示出相对于野生型凝血因子VII来说基本上相同或改进的生物学活性的FVII多肽，其中亲本肽的一个或多个氨基酸已经采用遗传和/或化学和/或酶促的方法进行了修饰，例如通过烷化、糖基化、PEG化、酰化、酯形成或酰胺形成等。这包括但不限于PEG化的人凝血因子VIIa、半胱氨酸-PEG化的人凝血因子Vila及其变体。凝血因子VII衍生物的非限制性实例包括在WO03/31464和美国专利申请US20040043446、US20040063911、US20040142856、US20040137557和US20040132640(NeoseTechnologies,Inc.)中/>开的糖PEG化的FVII衍生物；在WO01/04287、美国专利申请20030165996、WO01/58935、WO03/93465(MaxygenApS)和WO02/02764、美国专利申请20030211094(UniversityofMinnesota)中7>开的FVII缀合物。术语"改进的生物学活性，，指i)与重组野生型人凝血因子Vila相比具有基本上相同或增加的蛋白水解活性的FVII多肽，或ii)与重组野生型人凝血因子VIla相比具有基本上相同或增加的TF结合活性的FVII多肽，或iii)与重组野生型人凝血因子Vila相比具有基本上相同或增加的在血浆中的半衰期的FVII多肽。术语"PEG化的人凝血因子Vila"表示具有与人凝血因子Vila多肽缀合的PEG分子的人凝血因子VIIa。应当理解，PEG分子可以连接至凝血因子Vila多肽的任何部分，包括凝血因子Vila多肽的任何氨基酸残基或糖部分。术语"半胱氨酸-PEG化的人凝血因子Vila"表示具有PEG分子的凝血因子Vila,所述PEG分子缀合至引入人凝血因子Vila中的半胱氨酸的巯基上。与重组野生型人凝血因子Vila相比具有基本上相同或增加的蛋白水解活性的凝血因子VII变体的非限制性实例包括S52A-FVIIa、卩60A-FVIIa(Lino等人，Arch.Biochem.Biophys.352:182-192，1998);在美国专利号5，580，560中公开的显示出增加的蛋白水解稳定性的FVIIa变体；已经在第290位和第291位残基之间或在第315位和第316位残基之间经蛋白水解切割的凝血因子Vila(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.48:501—505，1995);凝血因子Vila的氧化形式(Kornfelt等人，Arch.Biochem.Biophys.363:43-54，1999);在PCT/DK02/00189(相应于W002/077218)中公开的FVII变体；和在W002/38162(ScrippsResearchInstitute)中/>开的显示出增加的蛋白水解稳定性的FVII变体；在WO99/20767、美国专利US6017882和US6747003、美国专利申请20030100506(UniversityofMinnesota)和WO00/66753、美国专利申i青US20010018414、US2004220106和US200131005、美国专利US6762286和US6693075(UniversityofMinnesota)中公开的FVII变体，其具有经修饰的Gla-结构域并显示出增强的膜结合；和在WO01/58935、美国专利US6806063、美国专利申请20030096338(MaxygenApS)、WO03/93465(MaxygenApS)、WO04/029091(MaxygenApS)、WO04/083361(MaxygenApS)和WO04/111242(MaxygenApS)以及WO04/108763(CanadianBloodServices)中乂〉开的FVII变体。与野生型FVIIa相比具有增加的生物学活性的FVII变体的非限制性实例包括，在WO01/83725、WO02/22776、WO02/077218、PCT/DK02/00635(相应于WO03/027147)、丹麦专利申请PA200201423(相应于WO04/029090)、丹麦专利申请PA200101627(相应于WO03/027147)、WO02/38162(ScrippsResearchInstitute)中公开的FVII变体；和在JP2001061479(Chemo-Sero-TherapeuticResInst.)中公开的具有增强的活性的FVIIa变体。凝血因子VII的变体的实例包括，但不限于，L305V-FVII,L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII,F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII,V158D/E296V/M298Q-FVII,K337A-FVII,M298Q-FVII,V158D/M298Q-FVII,L305V/K337A-FVI1，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII,V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII,K157A-FVII,E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII,和S336G-FVII，L305V/K337A-FVI1，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVI1，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII,L305V/K337A/V158T-FVI1，L305V/K337A/M298Q-FVI1，L305V/K337A/E296V-FVII,L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q-FVI1，L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/K337A-FVI1，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII:U05V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/K316Q-FVII,S314E/L305V-FVILS314E/E296V-FVILK316H/L305V-FVII:K316H/E296V-FVII:K316Q/L305V-FVII:K316Q/E296V-FVILS314E/L305V/K337A-S314E/V158D-FVIIS314E/V158T-FVIIK316H/V158D-FVIIK316H/V158T-FVIIK316Q/V158D-FVIIK316Q/V158T-FVI1S314E/K316H-FVI1S314E/K337A-FVIIS314E/M298Q-FVIIK316H/K337A-FVIIK316H/M298Q-FVI1K316Q/K337A-FVIIK316Q/M298Q-FVI1-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314E/L305V/E296V-FVII，S314E/L305V/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVIIS314E/L305V/K337A/E296V-FVII,S314E/L305V/K337A/V158D-FVIIS314E/L305V/V158D/M298Q-FVI1，S314E/L305V/V158D/E296V-FVIIS314E/L305V/V158T/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V-FVIIS314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVI1，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVn，S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVI1，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVI1，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVI1，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVI1，K316H/L305V/V158D-FVI1，K316H/L305V/E296V-FVI1，K316H/L305V/M298Q-FVI1，K316H/L305V/V158T-FVI1，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII,K316H/L305V/K337A/M298Q-FVn，K316H/L305V/K337A/E296V-FVIIK316H/L305V/K337A/V158D-FVII,K316H/L305V/V158D/M298Q-FVIIK316H/L305V/V158D/E296V-FVII，K316H/L305V/V158T/M298Q-FVIIK316H/L305V/V158T/E296V-FVII，K316H/L305V/E296V/M298Q-FVIIK316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVI1，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVI1，K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVI1，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVI1，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/U05V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII,K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V—FVII，K316Q/L305V/M298Q—FVII，K316Q/L305V/V158T-FVII,K316Q/L305V/K337A/V158T-FVI1，K316Q/L305V/K337A/M298Q—FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII,K316Q/L305V/K337A/V158D-FVI1，K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V-FVI1，K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVI1，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVI1，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVIIK316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVIIK316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVI1K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVI1K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVIIK316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVIIK316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337AK316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337AF374Y/V158D-FVI1，F374Y/E296V-FVII,F374Y/V158T-FVII,F374Y/S314E-FVI1，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVIIF374Y/L305V/E296V-FVII,F374Y/L305V/M298Q-FVIIF374Y/L305V/V158T-FVII，F374Y/L305V/S314E-FVIIF374Y/K337A/V158T-FVIIF374Y/K337A/E296V-FVIIF374Y/V158D/S314E-FVIIF374Y/V158D/E296V-FVIIF374Y/V158T/M298Q-FVIIF374Y/E296V/S314E-FVIIF374Y/E296V/M298Q-FVI1FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII,FVII，FVII，F374Y/K337A-FVn，F374Y/M298Q-FVII,F374Y/L305V-FVII,F374Y/K337A/S314E-FVIIF374Y/K337A/M298Q-FVI1F374Y/K337A/V158D-FVIIF374Y/V158D/M298Q-FVIIF374Y/V158T/S314E-FVIIF374Y/V158T/E296V-FVI1F374Y/S314E/M298Q-FVIIF374Y/L305V/K337A/V158DF374Y/L305V/K337A/M298Q-FVI1F374Y/L305V/K337A/S314E-FVIIF374Y/L305V/V158D/M298Q-FVIIF374Y/L305V/E296V/M298Q-FVIIF374Y/L305V/E296V/S314E-FVIIF374Y/L305V/M298Q/S314E-FVIIF374Y/K337A/S314E/V158T-FVIIF374Y/K337A/S314E/E296V-FVI1F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVIIF374Y/K337A/M298Q/E296V-FVIIF374Y/K337A/E296V/V158D-FVIIF374Y/V158D/S314E/E296V-FVIIF374Y/V158T/S314E/E296V-FVIIF374Y/V158T/M298Q/E296V-FVIIF374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E.F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E'F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E'F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337AF374Y/L305V/E296V/M298Q/S314EF374Y/V158D/E296V/M298Q/K337AF374Y/V158D/E296y/M298Q/S314EF374Y/L305V/V158D/K337A/S314EF374Y/V158D/M298Q/K337A/S314EF374Y/V158D/E296V/K337A/S314EF374Y/L305V/V158D/E296V/M298QF374Y/L305V/V158D/M298Q/K337AF374Y/L305V/V158D/E296V/K337AF374Y/L305V/V158D/M298Q/S314EF374Y/L305V/V158D/E296V/S314EF374Y/L305V/K337A/V158T-FVIIF374Y/L305V/V158D/E296V-FVIIF374Y/L305V/V158D/S314E-FVIIF374Y/L305V/E296V/V158T-FVIIF374Y/L305V/M298Q/V158T-FVIIF374Y/L305V/V158T/S314E-FVIIF374Y/K337A/S314E/M298Q-FVIIF374Y/K337A/S314E/V158D-FVIIF374Y/K337A/V158T/E296V-FVIIF374Y/K337A/M298Q/V158D-FVIIF374Y/V158D/S314E/M298Q-FVIIF374Y/V158D/M298Q/E296V-FVIIF374Y/V158T/S314E/M298Q-FVIIF374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII國FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVIIF374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVI1，F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVI1，F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVI1，F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVI1，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVI1，F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVn，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVI1，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVn,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVI1，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVI1，S52A-凝血因子VII，S60A-凝血因子VII;R152E-凝血因子VII，S344A-凝血因子VII，T106N-FVII,K143N/N145T-FVI1，V253N-FVII，R290N/A292T-FVI1，G291N-FVII,R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII;以及在233Thr-240Asn的氨基酸序列中具有置换、添加或缺失的FVII;在304Arg-329Cys的氨基酸序列中具有置换、添加或缺失的FVII;和在15311e-223Arg的氨基酸序列中具有置换、添加或缺失的FVII。因此，凝血因子VII多肽中的置换变体包括但不限于在位置PIO、K32、L305、M306、D309、L305、L305、F374、V158、M298、V158、E296、K337、M298、M298、S336、S314、K316、K316、F374、S52、S60、R152、S344、T106、K143、N145、V253、R290、A292、G291、R315、V317处的置换，以及在从T233至N240或从R304至C329;或从1153至R223的氨基酸序列中的置换、添加或缺失，或它们的组合，特别是变体例如P10Q、K32E、L305V、M306D、D309S、L305I、L305T、F374P、V158T、M298Q、V158D、E296V、K337A、M298Q、M298K、S336G、S314E、K316H、K316Q、F374Y、S52A、S60A、R152E、S344A、T106N、K143N、N145T、V253N、R290N、A292T、G291N、R315N、V317T,以及从T233至N240,或从R304至C329，或从1153至R223的氨基酸序列中的置换、添加或缺失，或它们的组合。在某些实施方案中，凝血因子VII多肽是人凝血因子Vila(hFVIIa),优选重组制备的人凝血因子Vila(rhVIIa)。在其他实施方案中，凝血因子VII多肽是凝血因子VII序列变体。在某些实施方案中，凝血因子VII多肽具有不同于野生型人凝血因子VII的糖基化。勿應在实施本发明中，所述细胞是真核生物细胞，更优选已建立的真核生物细胞系，包括但不限于CHO(例如ATCCCCL61)、C0S-1(例如ATCCCRL1650)、幼仓鼠肾(BHK)和HEK293(例如ATCCCRL1573;Graham等人，/.Ce/.K/ro厶36:59-72，1977)细胞系。优选的BHK细月包系是tk—tsl3BHK细月包系(Waechter和Baserga，户roc.#"7.C2'.yW79:1106-1110，1982),下文中称为BHK570细胞。BHK570细胞系可从美国典型培养物保藏中心，12301ParklawnDr.，Rockville，MD20852，在ATCC登记号CRL10314下获得。tk-tsl3BHK细胞系还可以从ATCC在登记号CRL1-632下获得。优选的CHO细胞系是可从ATCC在登记号CC161下获得的CH0Kl细胞系。其他合适的细胞系包括但不限于RatHepI(大鼠肝瘤；ATCCCRL1600)，RatHepII(大鼠肝瘤；ATCCCRL1548),TCMK(ATCCCCL139)，人肺(ATCCHB8065)，NCTC1469(ATCCCCL9.1);DUKX细胞(CH0细胞系)(Urlaub和Chasin，Jcad.M」77:4216-4220，1980)(DUKX细胞也称为訓ll细胞),和DG44(CHO细胞系)(Ce//，33:405,1983，和So肌〃cCe//#o/ec"73i"(7e/e〃"12:555，1986)。同样可以使用的是3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其他细胞的融合细胞。在一些实施方案中，细胞可以是突变细胞或重组细胞，例如表达与它们所源自的细胞类型相比在性质或数量上不同的酶i瞽的细胞，其中所述酶催化蛋白质的翻译后修饰(例如，糖基化酶如糖基转移酶和/或糖普酶，或者加工酶，例如前肽)。合适的昆虫细胞系还包括但不限于鳞翅目昆虫细胞系，例J(口草地夜蛾(5^odo/^era/Vi^i'/erc^)细月包或粉纟丈夜蛾(7y/c/op/^/a/n')细胞(参见，例如US5,077,214)。在某些实施方案中，用于实施本发明的细胞能够在悬浮培养中生长。如本文所使用的，悬浮-胜任性细胞(suspension-competentcell)是可以在悬浮液中生长而不形成大的、牢固的聚集体的细胞，即为单分散的或在每个聚集体中只有少数细胞的松散聚集体中生长的细胞。悬浮-胜任性细胞包括，但不限于，无需适应或处理即可在悬浮液中生长的细胞(例如，造血细胞或淋巴样细胞)，和通过使附着依赖性细胞(例如，上皮细胞或成纤维细胞)逐渐适应悬浮生长而制成悬浮-胜任性状态的细胞。用于实施本发明的细胞可以是粘附细胞(也称为贴壁依赖性或附着依赖性细胞)。如本文所使用的，粘附细胞是需要将其自身粘附或锚定至合适表面以进行增殖和生长的那些细胞。在本发明的一个实施方案中，所使用的细胞是粘附细胞。在这些实施方案中，繁殖阶段和生产阶段包括微载体的使用。所使用的粘附细胞应当能够在繁殖阶段期间迁移到载体上(并且如果使用大孔栽体，则迁移到载体的内部结构中)，并且当转移至生产生物反应器中时迁移至新载体。如果粘附细胞没有足够的能力通过自身迁移至新载体，那么可以通过使包含细胞的微载体与蛋白水解酶或EDTA接触来将它们从载体中释放出来。所使用的介质(特别是当不含动物来源组分时)应进一步包含适合于支持粘附细胞的组分；用于培养粘附细胞的合适的介质可从供应商例如Sigma获得。细胞还可以是悬浮-适应性或悬浮-胜任性细胞。如果使用此类细胞，那么可以在悬浮液中进行细胞的繁殖，因此微载体只在生产培养容器本身中的最后繁殖阶段中和在生产阶段中使用。在悬浮-适应性细胞的情况下，所使用的微载体通常是大孔载体，其中细胞通过物理包载在载体的内部结构中而附着其上。在这样的实施方案中，真核细胞一般选自CH0、BHK、HEK293、骨髓瘤细胞等。本发明的方法通常在搅拌培养容器中进行，并且优选采用基于微载体的方法类型。在基于微载体的方法中，细胞已迁移至载体(大孔载体)的内部结构中或已将其自身附着至载体(固体载体)表面，或两者。在基于微载体的方法中，最初将真核细胞、微载体和细胞培养液置于培养容器中。在接下来的几天里，如果培养体积没有达到开始时容器的最终工作体积，那么可以加入额外的细胞培养液。在接下来的时间内，定期收获包含产物的培养物上清液并用新的培养液替换，直至培养最终结束。当收获包含产物的上清液时，停止搅动例如搅拌培养物，并在允许包含细胞的载体沉淀后取出包含产物的细胞培养物上清液部分。为了改进程序的总体结果，优选地可以在收获包含产物的上清液之前应用冷却步骤，参见，例如W003/029442。在某些实施方案中，在允许载体沉淀之前将培养液冷却至约18°C-约32°C，或约20°C-约30。C，或约22°C-约28。C的温度。细胞培养程序的其他可应用的变化形式公开于WO02/29084中。繁殖步骤在达到其中有规律地收获包含产物的培养物上清液以用于进一步下游处理的生产阶段前，根据可能适合于所考虑的特定细胞的任何方案或规程来繁殖细胞。繁殖阶段可以是单步骤或多步骤的程序。在单步骤的繁殖程序中，从贮库中取出细胞并直接接种至其中将进行生产的包含微栽体的培养容器中。在多步骤的繁殖程序中，从贮库中取出细胞，并通过逐渐增加尺寸的多个培养容器进行繁殖，直至到达其中将进行生产的包含微载体的最终培养容器。在繁殖步骤期间，细胞在对于生长来说进行了优化的条件下生长。培养条件，例如温度、pH、溶解氧张力(tension)、溶解C02浓度等是已知对于特定细胞来说是最优的那些，并且对于本领域技术人员来说将是显而易见的(参见，1"列i口，爿/z/迈a7Ce//Cw/fwre..^户racf/ca/JpproacA岸二成，Rickwood:D.和Hames，B.D.，编者，OxfordUniversityPress,NewYork(1992))。在一种方法中，细胞培养过程在一个培养容器中进行将细胞直接接种到其中将进行生产的包含微载体的培养容器中；让细胞进行繁殖直至达到适合的细胞密度，并开始生产阶段。在另一种方法中，细胞培养过程在至少2个不同的培养容器中进行一个或多个种子培养容器(第一繁殖步骤)，随后为生产培养容器(最后的繁殖步骤，随后为生产阶段)。在第一繁殖步骤中，将表达所需多肽的细胞接种到包含培养基的种子培养容器中，并进行繁殖直至细胞到达最小交叉移种密度(minimumcross-seedingdensity)。随后，将繁殖的种子培养物转移至包含(a)培养基和(b)微载体的生产培养容器中。在这个培养容器中，在细胞迁移至固体载体的表面或大孔载体的内和外表面上的条件下培养细胞，并且它们在该最后的繁殖步骤中持续生长直至载体完全被细胞占据。在该最后的繁殖步骤期间，通过允许微载体下沉至培养容器底部来进行介质更换，之后取出预定罐体积百分比的介质并向容器中加入相应罐体积百分比的新鲜介质。然后，将微载体重悬浮于介质中，并且以预定的时间间隔，例如每24小时重复这一取出介质和替换的过程。所替换的介质的量取决于细胞密度，并且一般可以是罐体积的10-95%,优选25%-80%,如下表1中所示。应当理解，在其中繁殖阶段是多步骤程序的方法中，繁殖可以在逐渐增加尺寸的培养容器中进行，直至获得足够数目的细胞用于进入最终的培养容器。例如，可以顺次使用一个或多个5L、50L、100L或500L的培养容器。种子培养容器一般具有5L至1000L的容量。通常，以约0.2-0.4x1(T细胞/mL的初始密度将细胞接种到种子培养容器中，并进行繁殖直至培养物达到约1.Gx1()6细胞/mL的细胞密度。通常，最小交叉移种密度为约0.8-约1.5x1(T细胞/mL。适合于生产所需多肽例如凝血因子VII的一些设定点(set-point)不一定必需适合于细胞的最初生长(在种子培养中或在微载体上)。例如，所述两个阶段的温度、溶解氧张力、溶解C02浓度和pH可以不同。在繁殖过程中进行介质更换以使细胞保持存活和生长，而不收获培养物上清液用于下游处理。在下面的表1中概括了用于在最终培养容器(包含微载体)中的最后繁殖步骤的可能培养条件。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>-在下列时才几更换在l.0—12.Ox10'在l.0-12.Ox106在2.0-10x106细在2.0—10x106细的培养基的％细胞/mL时更换60细胞/mL时更换80月^/mL时更换80%月&AnL时更换80%-90%的培养基%的培养基的培养基的培养基生产阶段除了对于本发明方法而限定的特征和措施外，需要采取许多其他措施用于生产以得到令人满意的结果，如下文中将进行描述的。当细胞密度达到适合于开始生产阶段(即适合于对包含产物的培养物上清液进行下游处理)的值时，每24小时收获60-95%的培养物上清液，优选80%。这个细胞密度值一般为1-12x1(T细胞/mL。设定点可以在这时进行改变，并且设定在适合于生产所需多肽的值上。通过允许微载体下沉至罐底部来进行介质更换，之后取出所选罐体积百分比的介质并向罐中加入相应罐体积百分比的新鲜介质。一般替换25-90%的罐体积；优选地，用新鲜介质替换80%的罐体积。然后，将微载体重悬浮于介质中，并且一般每10-48小时，优选地每24小时重复这一取出介质和替换的过程。该过程的这个方面的概述显示于表2中。表2设定点范围优选范围优选值C优选值D溶解C。2浓度80-200ramHg100-環mmHg120-180mmHg120-160mmHg6-86.6_7.6对于CHO为7.0,和对于B服为6.7-6.9对于CHO为7.0,和对于BHK为6.7-6.9温度26-40'C30-37。C36。C36'C溶解氧张力10-90%饱和20-80%饱和50%50%-更换的培养基的％每10-48小时更换25-90%的培养基每10-48小时更换80%的培养基每24小时更换80%的培养基每24小时更换80%的培养基任选地，当进入生产阶段时和在生产阶段过程中可以采用培养的温度设定点的下降。当进入生产阶段时，通常将温度、溶解氧张力、溶解C02浓度、工作pH和介质更换频率改变为对于生产来说最佳的值。从表1和表2中可以分别看出生长和生产阶段中的温度范围和值的实例。在生产阶段期间，对于CH0细胞系来说优选约36X:的温度。微裁谬如本文所使用的，微载体是足够小以允许它们在悬浮培养(以对细胞不引起明显剪切损害的搅拌速率)中使用的颗粒。它们是固体的、多孔的，或具有在表面上有涂层的固体核。微载体可以例如，但不限于，是基于纤维素或葡聚糖的，并且它们的表面(在多孔载体的情况下是内和外表面)可以是带正电的。进一步的细节可以在W002/29083和"Microcarriercel1culture，principlesandmethods.AmershamPharmaciaBiotech.18-1140—62.EditionAA"中找到。在一系列实施方案中，微载体具有约150-350um的总体颗粒直径；并且具有约0.8-2.Omeq/g的正电荷密度。在一系列实施方案中，微栽体是固体载体。有用的固体微载体包括，但不限于，Cytodex1和Cytodex2(GEHealthcare)。固体载体特别适合于粘附细胞(贴壁依赖性细胞)。在另一系列实施方案中，微栽体是大孔载体。如本文所使用的，大孔载体是颗粒，例如基于纤维素的，其具有下列性质(a)它们足够小以允许它们在悬浮培养(以对细胞不引起明显剪切损害的搅拌速率)中使用；和(b)它们具有足够大小的孔和内部空间以允许细胞迁移至颗粒的内部空间中。在一个实施方案中，它们的表面(内和外)可以是带正电的。在一系列实施方案中，所述载体(a)具有约l50-350um的总体颗粒直径；(b)具有平均孔开^:直径(poreopeningdiameter)为约15-约40um的孔；和(c)具有约0.8-2.0meq/g的正电荷密度。在某些实施方案中，通过DEAE(N，N，-二乙基氨基乙基)基团提供正电荷。有用的大孔载体包括，但不限于，Cytoporel和Cytopore2(GEHealthcare)。特别优选的是Cytopore1载体，它具有230um的平均颗粒直径，30um的平均孔大小，和1.1meq/g的正电荷密度。义说一#培#务伴如本文所使用的，大规模培养容器具有至少约100L的容量，优选至少约500L，更优选至少约1000L,和最优选至少约5000L。在细胞培养过程在至少2个不同的培养容器中进行运作的情况下，例如一个或多个种子培养容器(第一繁殖步骤)，随后为生产培养容器(最后的繁殖步骤，随后为生产阶段)，该过程一般包括将约50L经增殖的种子培养物(约1.Ox1()6细胞/mL)转移至包含150L培养基的500L培养容器中。在适当的例如温度、pH、溶解氧张力(DOT)、溶解C()2浓度和搅动速率条件下维持大规模培养，并且通过向培养容器中加入介质而逐渐增加体积。在微载体方法的情况下，培养容器还包括相应于I-IOg/L的最终微载体浓度的微载体量。转移后，细胞通常在最初24小时内迁移至载体的表面上或的栽体的内部中。术语"细胞培养液"和"培养基"(或简单地称为"介质")指用于培育真核细胞的营养液，它一般提供至少一种来自一个或多个下列类别的组分(1)促成介质重量摩尔渗透压浓度的盐，例如钠、钾、镁和钙；(2)能量来源，通常为碳水化合物的形式例如葡萄糖；(3)所有必需氨基酸，并且通常为基本的那一组20种氨基酸；(4)以低浓度需要的维生素和/或其他有机化合物；和(5)微量元素，其中微量元素被定义为一般以极低浓度需要的，通常处于微体积摩尔浓度范围内的无机化合物。所述营养液可以任选补充有一种或多种来自下列任一类别的组分(a)激素及其他生长因子，例如胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子；和(b)蛋白质和组织的水解产物。优选地，细胞培养基不包含任何源自动物的组分。重要地，细胞培养液包含如上文进一步限定的植物蛋白水解产物。本发明包括在缺乏动物来源组分的介质中培养真核细胞。如本文所使用的，"动物来源"组分是在完整动物中产生的(例如，从血清中分离和纯化的蛋白质)或通过使用在完整动物中产生的组分来生产的(例如，通过使用从动物中分离和纯化的酶来水解植物来源的材料而制得的氨基酸)任何组分。相反地，具有动物蛋白序列(即具有动物基因组来源)但在介质中于体外在细胞培养中(例如在重组酵母或细菌细胞中，或在重组或非重组的已建立的连续真核细胞系中)产生的蛋白质不是"动物来源"组分，所述介质缺乏在完整动物中产生并从中分离和纯化出的组分，(例如，在酵母或细菌细胞中产生的胰岛素，或在已建立的哺乳动物细胞系例如CH0、BHK或HEK细胞中产生的胰岛素，或在Namalwa细胞中产生的干扰素)。例如，具有动物蛋白序列(即具有动物基因组来源)但在缺乏动物来源组分的介质中于重组细胞中产生的蛋白质(例如，在酵母或细菌细胞中产生的胰岛素)不是"动物来源组分"。因此，缺乏动物来源组分的细胞培养基是可以包含重组产生的动物蛋白的细胞培养基；然而，这样的培养基不包含例如动物血清或者从动物血清中纯化的蛋白质或其他产物。这样的培养基可以例如包含一种或多种来源于植物的组分。可以使用在本发明的条件下支持细胞生长和维持的任何细胞培养基，特别是缺乏动物来源组分的细胞培养基。通常，培养基包含水、重量摩尔渗透压浓度调节剂、緩冲液、能量来源、氨基酸、无机或重组的铁源、一种或多种合成或重组的生长因子、维生素和辅助因子。在一个实施方案中，培养基缺乏动物来源组分并缺乏蛋白质("无蛋白质的")。缺乏动物来源组分和/或蛋白质的培养基可从供应商例如Sigma、SAFCBiosciences、Gibco和Gemini获得。除了常规组分外，适合于生产凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的介质包含维生素K,其是凝血因子VII中的谷氨酸残基的Y-羧化作用所必需的，浓度为约0.l-50mg/L，优选约0.5-25mg/L，更优选约1-10mg/L，和最优选约5mg/L。适合于在本发明中使用的介质可从供应商例如Gibco和SAFCBiosciences获得。在一个实施方案中，介质如表3a中所示构成。下表(表3a)是适合于在本发明中使用的介质的组成。表3a<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>在一个实施方案中，介质如表3b中所示构成。下表(表3b)是适合于在本发明中使用的介质的组成。表3b<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>介质优选是缺乏动物来源组分的介质。在一个实施方案中，介质是商购可得的、缺乏动物来源组分的、无蛋白质的CHO介质(SAFCBiosciences)。在某些实施方案中，在本发明实施中使用的细胞适应于在缺乏动物来源组分的介质，例如缺乏血清的介质中悬浮生长。这样的适应程序4笛述于，j:i口Scharfenberg，等人,」//迈a/Ce//Tec力/2o/o^K"e7e/o/7/z7e/^5"fo『ar^51f力eCe//^r/,E.C.Beuvery等人(编者)，KluwerAcademicPublishers,第619—623页，1995(BHK和CH0细月包)；Cruz,"/Wec/wo/.7bc力.11:117—120,1997(昆虫细胞)；Keen,Cj^c^ec力"o/.17:203-211，1995(骨髓瘤细胞)；Berg等人，A/Wec力//《"^14:972-978，1993(人肾293细胞)中。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞是BHK21或CH0或HEK293细胞，它们已被改造成表达人凝血因子VII，并且已适应在不存在血清或动物来源组分的情况下生长。在本发明中可用的培养容器可以例如基于常规的搅拌罐式反应器(CSTR)，其中搅动通过常规叶轮类型而获得，或者气升式反应器，其中搅动通过从容器底部导入空气而获得。一般控制在特定界限内的进一步的参数包括pH、溶解氧张力(DOT)、溶解C0,浓度和温度。溶解氧张力可以通过例如喷射纯氧来维持。溶解C02浓度可以通过喷射空气来维持。温度控制媒介物一般是水，必要时加热或冷却。水可以流过围绕容器的夹套或流过浸入培养物中的盘管。术语"培养容器"可以与"罐"、"反应器"、"发酵罐"和"生物反应器"互换使用。下游处理一旦将介质从培养容器中取出，就可对其实施一个或多个处理步骤以获得所需蛋白质，包括，但不限于，离心或过滤以去除没有固定在载体中的细胞；亲和色谱，疏水相互作用色谱；离子交换色谱；大小排阻色谱；电泳程序(例如制备型等电聚焦(IEF)电泳)，差异溶解度(例如，硫酸铵沉淀)，或提取等。一般可参见，Scopes,尸rofe//7尸wW/7ca〃叫Springer-Verlag,NewYork,1982;和户rc^e/"尸wr/Z7ca〃0/，J._C.Janson和LarsRyden，编者,VCHPublishers，NewYork,1989。凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的纯化可以涉及，例如在抗凝血因子VII抗体柱上的亲和色谱(参见，例如，Wakabayashi等人，/."/o人C力e瓜261:11097，1986;和Thim等人，"/oc力e瓜27:7785，1988)，和通过蛋白水解切割而激活，其中使用凝血因子XIIa或具有胰蛋白酶样特异性的其他蛋白酶，例如凝血因子IXa、激肽释it酵、凝血因子Xa和凝血酵原、。参见，伊J^t口0sterud等人，^'oc力e瓜11:2853(1972);Thomas,美国专利号4，456，591;和Hedner等人，/.//^eW.71:1836(1983)。备选地，凝血因子VII可以通过使其经过离子交换色谱柱，例如MonoQ(Pharmacia)等，来激活。下列实施例旨在作为本发明的非限制性的举例说明。实施例实施例1:无血清地生产凝血因子VII(小型中试规模培养)进行下列实验以在小型中试规模培养(20L)中生产凝血因子VII。图1中显示了培养过程的流程图。该过程的生产部分是高细胞密度(HCD)过程，其中细胞借助于微载体而保留在发酵罐中。从FVII生产性细胞系的细胞库中解冻出细胞。该FVII生产性细胞系是CH0K1细胞系，其用编码凝血因子VII的基因转染，并且适应于在不存在动物来源组分的情况下在无血清悬浮液中生长。解冻后，细胞顺次在增加尺寸的旋转瓶中在无动物来源组分的液体介质中繁殖。用于繁殖的介质含有浓度为约5.0g/L的大豆蛋白水解产物。随着细胞数目增加，通过添加新介质来逐渐增加体积。所使用的介质不含血清及其他动物来源组分。当体积达到4L，并且细胞数目达到《0.8x107ml时，将旋转瓶的内容物转移至20L搅拌罐式反应器(小型中试规模生产发酵罐)中。该生产发酵罐包含大孔Cytopore载体(GEHealthcare)，并且在将细胞转移至生产发酵罐中后，将细胞在24小时内固定在载体中。随着细胞数目增加，通过添加新介质来逐渐增加生产发酵罐中的体积。几天后，当体积达到20L时，开始生产阶段。在生产发酵罐中使用的介质含有浓度为1.25g/L(实施方案a)或5.0g/L(参照)的大豆蛋白水解产物。在生产阶段期间，每24小时进行介质更换停止搅动以允许载体沉淀，随后收获约80%的培养物上清液并用新介质替换。将收获的培养物上清液转移以用于下游处理。在生产阶段中该过程以这种方式进行数周。在生产发酵罐中的培养物在约36。C的温度，约50%用空气饱和的溶解氧水平，和约100-150mmHg的溶解C02水平下维持。在生产阶段期间，细胞密度达到1-2x1(T细胞/ml，并且在每日收获物中的FVII浓度达到10-20mg/L。pH维持在6.70以上。图2中的图表显示了来自在20L发酵罐(小型中试规模发酵罐)中的微载体培养的结果。该图表举例说明了，当在生产发酵罐中使用1.25g/L大豆水解产物代替5.0g/L大豆水解产物时，与凝血因子VII生产率有关的稳定性的差异。实施例2:无血清地生产凝血因子VII(大型中试规模培养)从FVII生产性细胞系的细胞库中解冻出细胞。该FVII生产性细胞系是CH0K1细胞系，其用编码凝血因子VII的基因转染，并且适应于在不存在动物来源组分的情况下在无血清悬浮液中生长。解冻后，细胞顺次在增加尺寸的旋转瓶中在无动物来源组分的液体介质中繁殖。用于繁殖的介质含有浓度为约5.0g/L的大豆蛋白水解产物。随着细胞数目增加，通过添加新介质来逐渐增加体积。所使用的介质不含血清及其他动物来源组分。当体积达到4L，并且细胞数目达到《0.8x107ml时，将旋转瓶的内容物转移至50L搅拌罐式反应器(种子发酵罐)中。在50L发酵罐中用于繁殖的介质含有浓度为约5.0g/L的大豆蛋白水解产物。随着细胞数目增加，通过添加新介质来逐渐增加体积。所使用的介质不含血清及其他动物来源组分。当体积达到50L，并且细胞数目达到a1.0xl0Vml时，将50L发酵罐的内容物转移至500L搅拌罐式反应器(大型中试规模生产发酵罐)中。该生产发酵罐包含大孔Cytopore载体(GEHealthcare)，并且在将细胞转移至生产发酵罐中后，将细胞在24小时内固定在载体中。随着细胞数目增加，通过添加新介质来逐渐增加生产发酵罐中的体积。几天后，当体积达到450L时，开始生产阶段。在生产发酵罐的繁殖阶段中使用的介质含有浓度为5g/L的大豆蛋白水解产物，而在生产阶段中使用的介质含有浓度为1g/L的大豆蛋白水解产物(实施方案a)。在参照运行中，介质在繁殖阶段中含有的大豆蛋白水解产物的浓度与在生产阶段中一样。在生产阶段期间，每24小时进行介质更换停止搅动以允许载体沉淀，随后收获约80%的培养物上清液并用新介质替换。将收获的培养物上清液转移以用于下游处理。在生产阶段中该过程以这种方式进行数周。在生产发酵罐中的培养物在约36。C的温度，约50%用空气饱和的溶解氧水平，和约100-150mmHg的溶解0)2水平下维持。在生产阶段期间，细胞密度达到1-2x1()7细胞/ml,并且在每日收获物中的FVII浓度达到10-20mg/L。pH维持在6.70以上。图3中的图表显示了来自在500L发酵罐(大型中试规模发酵罐)中的微载体培养的结果。该图表举例说明了，当在生产发酵罐的生产阶段中使用1g/L大豆水解产物代替5g/L大豆水解产物时，与凝血因子VII生产率有关的稳定性的差异。实施例3:无血清地生产凝血因子VII(大规模)从FVII生产性细胞系的细胞库中解冻出细胞。该FVII生产性细胞系是CHO细胞系，其用编码凝血因子VII的基因转染，并且适应于在无血清悬浮液中生长。解冻后，细胞顺次在增加尺寸的旋转瓶中繁殖。随着细胞数目增加，通过添加新介质来逐渐增加体积。所使用的介质不含血清及其他动物来源组分。最后，将4L旋转培养物转移至第一个种子发酵罐步骤(50L发酵罐)。随着细胞数目增加，将种子发酵罐中的体积逐渐增加至50L。然后将50L种子培养物转移至第二个种子发酵罐步骤(500L发酵罐)。随着500L种子发酵罐中的细胞数目增加，将体积逐渐增加至500L。生产发酵罐(5000L)包含大孔Cytopore栽体(GEHealthcare)，并且在将细胞转移至生产发酵罐中后，将细胞在24小时内固定在载体中。随着细胞数目增加，通过添加新介质来逐渐增加生产发酵罐中的体积。旋转瓶、种子发酵罐和生产发酵罐的繁殖阶段中的介质含有浓度(d)为约5g/L的大豆水解产物。几天后，当体积达到4500L时，开始生产阶段。在生产阶段期间，每24小时进行介质更换停止搅动以允许载体沉淀，随后收获约80%的培养物上清液并用新介质替换。生产阶段中的介质含有浓度(C2)为约1g/L的大豆水解产物。将收获的培养物上清液转移以用于下游处理。在生产阶段中该过程以这种方式进行数周。在生产发酵罐中的培养物在约36。C的温度，约50%用空气饱和的溶解氧水平，和在100-180mmHg例如100-150miiiHg范围内的溶解C02水平下维持。安装好所有生物反应器(50L、500L、5000L)以控制温度、溶解氧(通过微量喷射器喷射氧)、搅动速率、顶部空间通气速率和pH(通过向顶部空间添加C02气体向下调控，而不通过添加碱向上调控)。此外，安装好生产发酵罐(5000L)以控制溶解的C02。借助于YSI8500CO广装置进行在线COr测量。根据0)2信号，通过经由管将大气空气喷射到液体中来控制co2水平。当co2浓度在设定点或以下时，将喷射速率设定为0L/分钟/L培养液，和当C02浓度处于设定点以上时，将喷射速率设定为0.01-0.05L/分钟/L培养液。在生产阶段期间，细胞密度达到1-2x107细胞/ml,并且在每日收获物中的FVII浓度达到10_20mg/L。pH维持在6.70以上。权利要求1.用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产多肽的方法，所述方法包括(i)所述细胞的繁殖阶段，其中使所述细胞在第一种细胞培养液中繁殖，和(ii)所述细胞的生产阶段，其中所述细胞存在于第二种细胞培养液中，其中所述细胞培养液各自包含植物蛋白水解产物，并且其中第一种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C1)和第二种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C2)之比为至少1.5∶1(C1∶C2)。2.根据权利要求l的方法，其中所述比例C1:&为2:1-10:1。3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述浓度G为0.2-3.5g/L。4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述浓度d为4.0-10.0g/L。5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述植物蛋白水解产物是大豆蛋白水解产物。6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述多肽是凝血因子VII多肽。7.用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述细胞的繁殖阶段，其中使所述细胞在第一种细胞培养液中繁殖，和(ii)所述细胞的生产阶段，其中所述细胞存在于第二种细胞培养液中，其中所述第一种细胞培养液包含浓度为4.0-10.0g/L的大豆蛋白水解产物，所述第二种细胞培养液包含浓度为0.2-3.5g/L的大豆蛋白水解产物，并且其中所述笫一种细胞培养液中大豆蛋白水解产物的浓度(c,)和所述第二种细胞培养液中大豆蛋白水解产物的浓度(c2)之比为至少1.5:1(d:C2)。8.用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述细胞的繁殖阶段，其中使所述细胞在第一种细胞培养液中繁殖，和(ii)所述细胞的生产阶段，其中所述细胞存在于第二种细胞培养液中，其中所述细胞培养液各自包含植物蛋白水解产物，例如大豆蛋白水解产物，并且其中所述第二种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C2)为0.7-3.0g/L。9.根据权利要求8的方法，其中所述浓度C2为0.9-2.5g/L。10.根据权利要求8-9中任一项的方法，其中所述细胞培养液各自包含植物蛋白水解产物，并且其中所述第一种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(d)和所述第二种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C2)之比为至少1.5:1。11，根据权利要求10的方法，其中所述浓度d为4.0-10.0g/L。12.根据权利要求l-6、7和8-11中任一项的方法，其中所述植物蛋白水解产物的浓度具有下列特性在所述繁殖阶段中的高浓度(d);在所述生产阶段中的低浓度-低水平A(C2A)在所述生产阶段中的低浓度-低水平B(C2B)在所述生产阶段中的低浓度-低水平A(C2A)在所述生产阶段中的低浓度-低水平B(C2B);等，其中d》C2B〉C"，并且浓度Cu和"在对于C2而指定的浓度范围内，并且其中当观察到细胞数目减少时，进行从低水平A(Cu)至低水平B(C2B)的首次转换，和当细胞数目已恢复至大约相应于减少前水平的水平时，进行从低水平B(C2B)至低水平A(C2A)的后续转换。全文摘要本发明涉及用于在包含在无血清培养液中的真核细胞中大规模生产多肽的方法，所述方法包括(i)所述细胞的繁殖阶段，其中细胞在第一种细胞培养液中繁殖，和(ii)所述细胞的生产阶段，其中细胞存在于第二种细胞培养液中，其中所述细胞培养液各自包含植物蛋白水解产物，并且其中第一种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C₁)和第二种细胞培养液中植物蛋白水解产物的浓度(C₂)之比为至少1.5∶1(C₁∶C₂)。文档编号C12P21/02GK101120085SQ200680004744公开日2008年2月6日申请日期2006年2月6日优先权日2005年2月11日发明者I·M·克努德森申请人:诺和诺德医疗保健公司