人抗狂犬病抗体及其用途的制作方法

专利名称：：人抗狂犬病抗体及其用途的制作方法人抗狂犬病抗体及其用途相关信息本申请要求2005年2月2日提交的美国临时专利申请60/649,512的优先权，该专利申请的全部内容引入本文作为参考。在本说明书全文中引用的任何专利、专利申请和参考文献的内容均全文引入本文作为参考。
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：狂犬病是一种由弹状病毒科(狂犬病毒属(lyssavirus))的RNA病毒感染引起的急性进行性脑炎。尽管在发达国家中人类狂犬病死亡极少(在美国每年通常不到5例死亡)，但是在(例如)印度报告了相当多的死亡例数，在印度有50,000人死于该病，并且有超过500,000人得到治疗。甚至在美国，每年也有15,000到40,000人接受抗狂犬病治疗。一般来说，狗是该病的主要宿主，但是其他哺乳动物如浣熊、臭鼬、蝙蝠和狐狸也是常见的宿主。该病毒从动物宿主向人的传纟番通常是通过咬伤或抓伤穿过皮肤而发生的。由于狂犬病在人类中几乎总是致命的，甚至怀疑感染也必须用积极的接触后治疗方案来治疗。人类狂犬病的接触后治疗包括适当的伤口处理、抗狂犬病血清免疫球蛋白浸润到伤口内和伤口周围的局部给药、以及通常在几天和几周内给予多剂量的狂犬病疫苗(关于狂犬病预防的综述，参见，例如，Rupprecht和Gibbons等人，NEnglJMed351:25(2004))。适当的伤口处理可以减少存活的进入患者的病毒量。抗狂犬病血清免疫球蛋白浸润该区域可以与狂犬病病毒结合，并且有助于清除狂犬病病毒，由此减少病毒载量(通过被动免疫)。给予多剂量的狂犬病疫苗(主动免疫)的方式通常是在第一次给药后进行加强免疫，可使患者产生有效的主动免疫，包括体液和细胞应答。当前抗狂犬病血清免疫^求蛋白的来源是从被接种的人类供体的血液中获得的。抗狂犬病血清免疫球蛋白的其他来源，例如马或鼠，被认为是不可接受的。当前狂犬病疫苗的来源是在细胞系中产生以及化学灭活并冻干。尽管这些药剂如果及时施用是非常有效的，但是仍然存在一定的障碍。例如，这些抗狂犬病药剂的生产厂家极少，而且它们仍然较昂贵，特别是在最需要它们的发展中国家。另外，人抗狂犬病血清免疫球蛋白由于是从人类供体的血清中获得的，因此必须高度纯化以防止任何偶然物质的传播。而且，抗狂犬病疫苗需要劳动密集的细胞培养和大量的灭活和纯化步骤。因此，需要改进的治疗和预防狂犬病感染的免疫疗法。
发明内容本发明通过提供特异性结合广泛多种狂犬病病毒分离抹并且抑制该病毒感染细胞的能力的重组完全人类的抗狂犬病单克隆抗体解决了上述问题。在一个实施方案中，这通过所述抗体在体外中和(即抑制或阻断)狂犬病病毒的能力(例如通过RFFIT测定)得到了证明。在另一实施方案中，这通过抗体在受试者如动物或人体内抑制狂犬病病毒感染力的能力得到了证明。本发明的人单克隆抗体可以以实际上不受限制的量并且以高度纯化的形式高效制备。因此，这些抗体适合预测、诊断和/或治疗接触或怀疑已经接触狂犬病的个体。本发明的抗体特别有利于狂犬病的接触后预防(PEP),因为它们不需要人抗狂犬病血清免疫球蛋白的供体来源。这些抗体可以用本领域公知的用于制备人抗体的多种技术生产。例如，如在本文中例举的，这些抗体可以在表达人免疫球蛋白基因片段的转基因动物例如含有人Ig基因座的转基因小鼠中产生。而且，这些抗体可以单独施用，或者(例如)与抗狂犬病疫苗或其4也抗体联合施用，以提高感染狂犬病病毒的受试者(例如动物和人)的存活率。因此，本发明提供了几个优点，包括但不限于如下几点-完全人类重组抗狂犬病抗体，用于预测、-^断和/或治疗受试者中的狂犬病病毒或进4于狂犬病病毒接触后预防(PEP)，例如防止或抑制受试者中由狂犬病病毒介导的发病率或死亡率；-组合物(例如药物)和/或试剂盒，其中包含一种或多种完全人类重组抗狂犬病抗体，该抗体可以单独使用或者与商售疫苗联合使用，以治疗受试者的狂犬病感染和/或进行PEP;和-改进的被动免疫治疗方法，用于治疗感染狂犬病病毒(例如需要狂犬病病毒接触后预防(PEP))的受试者，该方法可以单独l吏用或者与主动免疫疗法(狂犬病疫苗)联合使用。在一个实施方案中，本发明的人单克隆抗体或其抗原结合部分与狂犬病病毒G糖蛋白特异性结合。特定抗体或其抗原结合部分与狂犬病病毒G糖蛋白N末端一半内的表位特异性结合。其他一些特定抗体或其抗原结合部分与狂犬病病毒C末端结构域内的表位特异性结合。这些表位可以存在于例如狂犬病病毒G糖蛋白的氨基酸1-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-524内，或其4壬意间隔、部分或范围内。在一个实施方案中，该抗体或其抗原结合部分特异性结合狂犬病病毒G糖蛋白的N末端一半内的表位，即大约在氨基酸残基19-422之间。在另一实施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位包含氨基酸残基336-442。在一个实施方案中，狂犬病G糖蛋白包含氨基酸残基336以及其变化，如耳又代或缺失。在一个相关实施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位包含线性表位、构象表位、不连续表位或这些表位的组合。在另一相关实施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位由抗原位点I、抗原位点II、抗原位点III、抗原位点次要A、或这些抗原位点的组合例如抗原位点III和次要位点A组成。在另外一些实施方案中，人单克隆抗体或其抗原结合部分的特征为以小于约10x10—6M的K。与狂犬病病毒特异性结合。在一个具体实施方案中，该抗体或其抗原结合部分以至少约10x10_7M、至少约10xl(TM、至少约10xl(T9M、至少约10x10—1DM、至少约10x10—"M或至少约10x10—"M的K。或甚至更有利的K。与狂犬病病毒(例如，狂犬病病毒G糖蛋白)特异性结合。在各种其他实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含可变重链区，该可变重链区包含与克隆17C7(SEQIDN0:1)、6G11(SEQIDNO:15)、5G5、2B10或1E5产生的抗体的可变重链区氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99°/。以上相同的氨基酸序列。在另外一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含可变轻链区，该可变轻链区包含与克隆17C7(SEQIDNO:2)、6G11(SEQIDNO:16)、5G5、2B10或1E5产生的抗体的可变轻链区氨基酸序列至少80%、85°/。、90%、95%、98°/。、99%或99°/。以上相同的氨基酸序列。在再另外一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含可变重链区和可变轻链区，该可变重链区包含与克隆17C7(SEQIDNO:l)、6G11(SEQIDNO:15)、5G5、2B10或1E5产生的抗体的可变重《连区氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的氨基酸序列，该可变轻链区包含与克隆17C7(SEQIDN0:2)、6G11(SEQIDNO:16)、5G5、2B10或1E5产生的抗体的可变轻链区氨基酸序列至少80%、85%、90%、95°/。、98%、99%或99%以上相同的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，该抗体或其抗原结合部分特异性结合与被克隆17C7、6G11、5G5、2B10或产生的抗体结合的表位重叠的表位，和/或与克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5产生的抗体竟争结合狂犬病病毒或其部分。该抗体或其抗原结合部分的可变重链和轻链区一般包括一个或多个互补决定区(CDR)。这些CDR包括CDR1、CDM和CDR3区。在特定实施方案中，可变重链CDR与克隆17C7(SEQIDN0s:3，4，5)、6G11(SEQIDNOs:17，18，19)、5G5、2B10或1E5产生的抗体的CDR(也示于表1中)至少80%、85%、90%、95%或99%或99°/。以上相同。在另外一些特定实施方案中，可变轻链CDR与克隆17C7(SEQIDN0s:6，7，8)、6G11(SEQIDN0s:20,21，22)、5G5、2B10或1E5产生的抗体的可变轻链区CDR(也示于表2中)至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同。因此，本发明的特定抗体或部分包含可变重链区和可变轻链区，该可变重链区包含与克隆17C7(SEQIDN0s:3，4,5)、6G11(SEQIDN0s:17,18,19)、5G5、2B10或1E5产生的抗体的可变重链区CDR至少80%、85%、90°/。、95°/。、98%、99%或99%以上相同的一个或多个互补决定区(CDR),该可变轻链区包含与克隆17C7(SEQIDN0s:6，7,8)、6G11(SEQIDN0s:20，21,22)、5G5、2B10或1E5产生的抗体的可变轻《连区CDR至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的一个或多个CDR。该抗体或其抗原结合部分的可变重链区也可以包括与克隆17C7(SEQIDN0s:3，4,5)、6G11(SEQIDNOs:17,18，19)、5G5、2B10或1E5产生的抗体的可变重链区的CDR至少80°/。、85°/。、90%、95%或99%或99。/。以上相同的全部三个CDR，和/或与克隆17C7(SEQIDN0s:6，7,8)、6G11(SEQIDN0s:20，21,22)、5G5、2B10或1E5产生的抗体的可变轻链区的CDR至少80%、85%、90%、9/。或99%或99%以上相同的全部三个CDR。在本发明的另一实施方案中，人抗体或其抗原结合部分(a)包括由人VH3-30-3或VH3-33基因编码(即，是其产物)或书f生的重链可变区；和/或(b)包括由选自VkL6、VkLll、VkL13、VkL15或VkL19的人vk基因编码或衍生的轻链可变区。本发明的人单克隆抗体包括全长抗体，例如包含效应结构域(例如Fc结构域)，以及抗体部分或片段，如单链抗体和Fab片段。该抗体还可以与多种治疗剂(例如抗病毒药或毒素)和/或标记物连接。在另一方面，本发明提供了包含杂交瘤克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5产生的抗体(在此也称作"17C7"，"6G11"，"5G5"，"2B10"和"1E5")的抗原结合部分的分离的多肽。在另一方面，本发明提供了如下分离的核酸，其包括编码与SEQIDN0s:13或23至少75°/。、80%、85%、90%、95%、99%或99°/。以上相同的抗体重链可变区的序列。本发明也提供了如下分离的核酸，其包括编码与SEQIDN0s:14或24至少75%、80°/。、85%、90%、95°/。、99%或99%以上相同的抗体轻链可变区的序列。本发明还提供了包括单独(例如从一个或多个载体表达)的任意上述核酸或其组合的表达载体，以及包含这种表达载体的宿主细胞。适合表达本发明的抗体的宿主细胞包括多种真核细胞，例如酵母细胞、哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、骨髓瘤细胞或植物细胞。在另一方面，本发明提供了组合物和试剂盒，其包括一种或多种如本文所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与狂犬病病毒特异性结合并且抑制该病毒感染哺乳动物细胞的能力。该组合物或试剂盒还可以包括一种或多种与狂犬病病毒特异性结合的抗体(例如人单克隆或多克隆抗体)或其抗原结合部分。在一个实施方案中，多克隆抗体或其抗原结合部分与狂犬病病毒G糖蛋白特异性结合。在一个特定实施方案中，该组合物或试剂盒包括以下两者(a)与第一种狂犬病病毒分离抹特异性结合的分离的人单克隆抗体；和(b)与第二种狂犬病病毒分离抹特异性结合的分离的人单克隆抗体。本发明还提供治疗受试者的狂犬病病毒病的方法，包括以有效抑制狂犬病病毒病例如狂犬病病毒介导的症状或发病率的量，给受试者施用如本文所述的(即，与狂犬病病毒特异性结合的)分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分。本发明的人单克隆抗体或其部分(和包含该抗体或其部分的组合物)可以通过多种合适的方式给受试者给药，例如静脉内(IV)、皮下(SC)、优选肌肉内(IM)。该抗体或其抗原结合部分可以单独给药或与另外一种治疗剂例如第二种人单克隆抗体或其抗原结合部分联合给药。在一个实例中，该第二种人单克隆抗体或其抗原结合部分与第二种狂犬病病毒分离抹特异性结合，该第二种狂犬病病毒分离抹不同于与第一种抗体结合的分离抹。在另一实例中，该抗体与另外一种药物如抗病毒剂一起给药。在另一实例中，该抗体与多克隆Y-球蛋白(例如人Y-球蛋白)一起给药。在另一实例中，该抗体在狂犬病病毒疫苗之前、之后或同时给药。另一方面，本发明提供了制备与狂犬病病毒特异性结合的抗体或其抗原结合部分的方法。在一个实施方案中，该方法包括用包含狂犬病病毒例如活的或灭活的病毒的组合物免疫具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因非人动物，以及从该动物中分离抗体、抗体产生细胞或抗体编码核酸。狂犬病病毒可以通过(例如)化学处理和/或冻干来灭活。该方法可以进一步包括评价该抗体与狂犬病病毒或狂犬病病毒G糖蛋白的结合。本发明也提供了通过在宿主细胞中表达编码人抗体的核酸(例如编码抗体的抗原结合区部分的核酸)制备抗体或其抗原结合部分的方法。在另一方面，本发明提供了包含上述核酸的杂交瘤或转染瘤。本发明还提供了一种制备表达与狂犬病病毒特异性结合的抗体的杂交瘤的方法，包括用包含狂犬病病毒或狂犬病病毒G糖蛋白的组合物免疫具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因非人动物；从该动物中分离脾细胞；由该脾细胞产生杂交瘤；以及选择产生与狂犬病病毒或其狂犬病病毒蛋白质特异性结合的抗体的杂交瘤。用人单克隆抗体治疗人类具有几个优点。例如，这些抗体在人体中比非人抗体免疫原性更低。治疗也很迅速，因为该抗体一到达感染部位并直接中和致病的狂犬病病毒，即可发生狂犬病病毒灭活。人抗体也比非人抗体更有效地定位于人体内的适当部位。此外，该治疗对于狂犬病病毒是特异性的，是重组和高度純化的，并且与传统疗法不同，避免了污染偶发物质的潜在可能性。通过下面的详述和权利要求书，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。图1显示重组抗狂犬病人抗体(即克隆17C7)的重链和轻链可变区的氨基酸序列。这些序列分别对应于SEQIDNO:1和2。标出了各链的互补决定区(CDR),其对应于SEQIDNOs:3、4和5(重链)和6、7和8(轻链)。图2显示重组抗狂犬病人抗体(即克隆6G11)的重链和轻链可变区的氨基酸序列。这些序列分别对应于SEQIDNO:15和16。标出了各链的互补决定区(CDR),其对应于SEQIDNOs:17、18和19(重链)和20、21和22(轻链)。图3是狂犬病病毒G重组糖蛋白的示意图，示出了为表位作图研究而分析的片段。通过免疫沉淀和免疫印迹法测定，确定人抗体17C7与氨基酸残基19-422内的表位结合。图4显示通过RFFIT测定，与人血清(MIG)相比较，当HuMab17C7从1:5连续稀释到1:390625时，中和狂犬病病毒。图5，ERA-N和ERA-CO糖蛋白在293T细胞中表达，在密码子优化时容易表达(A),在细胞表面上表达时能够被l冗7结合(B-D)。图6显示HuMab17C7识别狂犬病G外功能区(A),在非还原条件下(B)以及对于ERA抹的G蛋白(C)识别。图7显示根据ELISA(A)和免疫印迹法(B),HuMabl冗7识别N336K和N336D突变ERA糖蛋白。图8显示HuMab17C7中和细胞的ERA假病毒感染(A-B),以及ERAG蛋白的各种突变在17C7结合方面的后果(C-D)。图9显示ERAG蛋白的各种突变在17C7结合方面的后果(A-B)。发明详述为了清楚地理解说明书和权利要求书，下面提供了如下定义。定义本文使用的术语"狂犬病病毒"是指由狂犬病病毒的RNA编码的病毒体或其部分，例如蛋白质部分，如狂犬病病毒G糖蛋白。术语"抗狂犬病病毒抗体，，是与狂犬病病毒或狂犬病病毒产生的或相关的蛋白质、碳水化合物、脂质或其他成分相互作用(例如结合)的抗体。"狂犬病病毒G糖蛋白抗体，，是与狂犬病病毒的G糖蛋白或其片段结合的抗体。抗狂犬病病毒或G糖蛋白抗体可以结合表位，例如构象或线性表位，或该病毒或其組分的部分或片段。术语"人抗体"是具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本文所述的人抗体可以包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。抗狂犬病病毒抗体或其抗原结合部分可以单独施用或与第二种药剂联合施用。受试者可以是感染了或怀疑感染了狂犬病病毒或具有狂犬病病毒介导的疾病的症状(例如神经病理状况、脑脊髓炎、或抗狂犬病免疫球蛋白血清滴度)的患者。这种治疗可以用来治愈、康复、减轻、緩解、改变、矫正、改善、緩和、好转或影响感染和与感染有关的疾病、疾病的症状或患该病的倾向。对于狂犬病病毒感染的临床处理，"治疗，，通常^皮理解为在发病之前预防或防止可能产生的感染。有效治疗狂犬病病毒感染的抗狂犬病病毒抗体的量或"治疗有效量，，是在单剂量或多剂量施用于受试者后有效抑制受试者的狂犬病病毒感染、疾病或其后遗症的抗体量。该抗体或抗体片段的治疗有效量可能根据诸如疾病状态、创伤部位、狂犬病病毒林或分离抹、狂犬病病毒的动物载体、个体的年龄、性别和体重、以及该抗体或抗体部分在个体中引发所需应答的能力等因素而不同。治疗有效量也是抗体或抗体部分的治疗有益效果超过任何毒性或不利效果的量。抗体抑制可测量参数的能力可以在用于预测在人体中的效力的动物模型系统中评价。例如，如实施例中所述，抗狂犬病病毒抗体^f呆护仓鼠免遭狂犬病病毒致死性攻击的能力可以预测其在人体中的效力。或者，也可以通过技术人员7>知的试验在体外#r测该化合物调节狂犬病病毒/细胞相互作用例如结合、感染、毒力等的能力来评价抗体或抗体组合物的这种性质。体外试验包括结合试验如ELISA和中和试一验。抗狂犬病病毒抗体有效预防疾病的量或该抗体的"预防有效量，，是指在单剂量或多剂量施用于受试者后有效预防或延緩狂犬病病毒发病或复发或抑制其症状的量。但是，如果需要较长的保护间期，可以施用增加的剂量或更频繁的给药。例如表示两种状态之间量的差异的术语"拮抗"、"诱导"、"抑制"、"加强"、"提高"、"增加，，、"降低"等是指两种状态之间的差异，例如统计学或临床显著的差异。术语"特异性结合"或"与...特异性结合"是指抗体与狂犬病病毒或其部分以至少1x10-6M的亲和力结合的能力，和/或与狂犬病病毒或其部分以至少两倍于对非特异性抗原的亲和力的亲和力结合的能力。"抗体，，是包含至少一个或两个重(H)链可变区(在此缩写为VH)和至少一个或两个轻(L)链可变区(在此缩写为VL)的蛋白质。VH和VL区可以进一步再分为高变区，称为"互补决定区"(CDR)，高变区散布在被称为"构架区，，(FR)的更加保守的区域中。构架区和CDR的范围已经准确定义(参见，Kabat,E,A.等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,證PublicationNo.91-3242,1991,和Chothia,C.等，J.Mol.Biol.196:901-917，1987，引入本文作为参考)。优选地，每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端到羧基端以如下顺序排列FR1,CDR1，FR2，CDR2,FR3，CDR3,FR4。抗体的VH或VL区还可包括全部或部分重链或轻链恒定区。在一个实施方案中，该抗体是两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体，其中免疫球蛋白重链和轻链例如通过二硫4建《连间连接。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链和轻链的可变区包含与抗体相互作用的结合结构域。抗体的恒定区一般介导该抗体与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统第一成分(Clq))的结合。术语"抗体"包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及它们的亚型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是k或X型。术语"免疫球蛋白"是指由基本由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽组成的蛋白质。公认的人免疫球蛋白基因包括K、入、a(IgAl和IgA2)、y(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、sUgD)、"IgE)和n(IgM)恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白"轻链"(约25乙和214个氨基酸)的NH广末端(约110个氨基酸)由可变区基因编码，COOH-末端由K或X恒定区基因编码。全长免疫球蛋白"重链"(约50K。和446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和上述其他恒定区基因之一如y(编码约330个氨基酸)编码。术语"免疫球蛋白，，包括具有来自人或非人来源的CDR的免疫球蛋白。免疫球蛋白的构架可以是人、人源化或非人的构架，例如经修饰降低了在人体中的抗原性的鼠构架，或合成构架例如共有序列。成熟的免疫球蛋白/抗体可变区一般不含前导序列。免疫球蛋白/抗体根据它们的恒定区可以进一步区别为不同类别(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)和亚类或同种型(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)。本文使用的术语抗体的"抗原结合部分"(或简称为"抗体部分"或"部分，，)是指与狂犬病病毒或其组分(例如G糖蛋白)特异性结合的抗体的一部分，例如这样一种分子其中一条或多条免疫球蛋白链不是全长的，但是其与狂犬病病毒或其组分特异性结合。术语抗体的"抗原结合部分"中所包括的结合部分的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab，)2片段，即包含在铰链区处通过二硫键连接的两条Fab片段的双价片段；Uii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域組成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature341:544-546，1989);和(vi)分离的互补决定区(CDR),其具有足以特异性结合(例如)可变区的抗原结合部分的构架。轻链可变区的抗原结合部分和重链可变区的抗原结合部分，例如Fv片段的两个结构域VL和VH，可以利用重组方法通过合成连接体连接在一起，该连接体使它们能够形成一条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参见，例如Bird等(1988)Science242:423-426;和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:58"-S883)。这样的单链抗体也包括在术语抗体的"抗原结合部分"内。这些抗体部分用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些部分进行实用性筛选。术语"单特异性抗体"是指对特定靶标例如表位表现出单一结合特异性和亲和力的抗体。该术语包括"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"，后者在本文使用时是指具有单一分子组成的多种抗体或其部分的制剂。本文使用的术语"重组"抗体是指通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体，例如用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库中分离的抗体，从人免疫球蛋白基因转基因动物(例如小鼠)中分离的抗体，或通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任意其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组抗体包括人源化、CDR移植的、嵌合、体外(例如通过噬菌体展示)产生的抗体，并且可以任选地包含来源于人种系免疫球蛋白序列的恒定区。术语"基本相同"(或"基本同源")是指第一氨基酸或核苷酸序列含有足够数目的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同(例如具有相似的侧链，例如保守氨基酸置换)的氨基酸残基或核苷酸，从而该第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似的活性。对于抗体来说，第二抗体与第一抗体具有相同的特异性并且具有第一抗体的至少50%的亲和力。两个序列之间"同源性"的计算如下进行。为了最佳比较目的将这些序列进行比对(例如为了最佳比对可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个中引入空位，并且为了比较目的可以忽略非同源序列)。为了比较目的而比对的参比序列的长度至少为参比序列长度的50%。然后比较相应氨基酸位点或核苷酸位点处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位点被与第二序列中相应位点处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，这些分子在该位点处相同(此处所用的氨基酸或核酸"同一性，，等同于氨基酸或核酸"同源性，，)。考虑为了两个序列之间进行最佳比对所需要引入的空位的数目和每个空位的长度后，两个序列之间的百分同一性是这两个序列共有的相同位点的数目的函数。两个序列之间的序列比较和百分同一性的确定可以用数学算法来实现。两个氨基酸序列之间的百分同一性用已经整合入GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48:444—453，1970的算法进行确定，其中使用Blossum62评分矩阵，空位罚分为12,空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。本文使用的术语"在低严格性、中严格性、高严格性或极高严格性条件下杂交，，描述了杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指南可见CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons,N.Y.6.3.1-6.3.6，1989,在此引用作为参考。该文献中描述了水性和非水性方法，可以使用其中任意一种。此处所指的具体杂交条件如下1)低严格性杂交条件约45。C下6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后至少在50。C下用0.2XSSC，0.1%SDS洗涤两次(对于低严格性条件，洗涤温度可以提高至55°C);2)中严格性杂交条件约45。C下6XSSC，然后在60。C下用0.2XSSC，0.1%SDS洗涤一次或多次；3)高严格性杂交条件约45。C下6XSSC,随后在65°C下用0.2XSSC,0.1%SDS洗涤一次或多次；4)极高严格性杂交条件在65°C下0.5M磷酸钠，7%SDS,随后在65。C下用0.2XSSC,1%SDS洗涤一次或多次。守或非:、需氨基酸置换:这对多肽:能没有实质性i响:、具体置换是否被耐受，即是否不会不利地影响需要的生物学性质如结合活性，可以如Bowie等，Science,247:1306-1310,1990所述确定。"保守氨基酸置换"是指将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已经定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、色氨酸)、(3-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、笨丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。"非必需"氨基酸残基是可能相对于多肽如结合剂如抗体的野生型序列而改变，但基本不改变生物活性的残基，而"必需"氨基酸残基则导致这样的改变。除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的同样的含义。尽管下面描述了合适的方法与材料，但是在本发明的实践或试验中也可以使用与此处所述相似或等同的方法与材料。如有沖突，以本说明书包括定义为准。另外，这些材料、方法和实施例都只是说明性的，不是限制性的。概述狂犬病病毒是引起人类致死性脑炎的RNA病毒。本文提供了用于治疗和预防狂犬病病毒感染的动物、特别是人类受试者、更特别的是需要接触后狂犬病治疗或接触后预防(PEP)的人的方法和组合物。该组合物包括识别狂犬病病毒的蛋白质和其他分子组分(例如脂质、碳水化合物、核酸)的抗体，包括识别狂犬病病毒G糖蛋白的抗体或其部分。特别是提供了重组完全人类单克隆抗体。在某些实施方案中，在表达人免疫球蛋白基因区段的小鼠中产生这些人单克隆抗体(下文描述)。也提供了抗狂犬病病毒抗体的组合。新方法包括给受试者施用可与狂犬病病毒结合的抗体(及其抗原结合部分)，以抑制受试者的狂犬病病毒介导的疾病。例如，本文所述的人单克隆抗狂犬病病毒抗体能够中和狂犬病病毒并且抑制终末期狂犬病感染和脑炎。在其他实例中，可以施用抗狂犬病病毒抗体(例如抗狂犬病病毒G糖蛋白单克隆抗体)的组合，以抑制狂犬病病毒介导的疾病。人单克隆抗体可以在狂犬病感染的创伤部位局部给药(浸润)，任选地随后给予抗狂犬病疫苗。1.抗体的产生免疫原通常，用狂犬病病毒和/或狂犬病病毒表达的抗原免疫动物，以产生抗体。为了产生抗狂犬病病毒抗体，一4是用灭活的狂犬病病毒免疫动物。例如，可以通过化学处理和/或冻干来灭活狂犬病病毒，几种狂犬病病毒疫苗可以购买到。结合和中和狂犬病病毒的抗狂犬病病毒抗体能够与狂犬病病毒的特定表位例如狂犬病病毒G糖蛋白相互作用。例如，抗狂犬病病毒G糖蛋白抗体能够结合狂犬病病毒G糖蛋白的N末端区或C末端区或其蛋白质或片段的内部区域内的表位(参见实施例4和图5)或其组合。在一个实例中，结合和中和狂犬病病毒的抗体与狂犬病病毒G辟唐蛋白的氨基酸19-422内的表位例如线性表位结合。在另一实例中，鉴定了一种抗体，该抗体与狂犬病病毒G糖蛋白的氨基酸19-422内的线性表位和/或构象表位结合。如本文所述，这些表位也可以用来鉴定其他与狂犬病结合的抗体。在HuMAb小鼠中产生人单克隆抗体可以用无法用于多克隆抗体的方法产生单克隆抗体。多克隆抗血清在动物与动物之间不同，而单克隆制剂则表现出均一的抗原特异性。鼠系统可用于产生单克隆抗体，免疫方案、分离和融合脾细胞的技术和产生杂交瘤的方法和试剂是众所周知的。单克隆抗体可以用多种才支术产生，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,Nature,256:495,1975的标准体细胞杂交技术。总的参见Harlow，E.和Lane,D.Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1988。虽然这些标准技术是已知的，但是希望使用人源化或人抗体而不是鼠抗体来治疗人类受试者，因为人体会对来自小鼠和其他物种的抗体产生免疫应答。对鼠抗体的免疫应答^皮称为人抗鼠抗体或HAMA应答(Schroff，R.等，CancerRes.，45,879-885，1985),是在人体中？1起血清病并且导致鼠抗体从个体循环中被快速清除的情况。已经证明人体中的免疫应答是针对鼠免疫球蛋白的可变区和恒定区的。对于人体施用，人单克隆抗体比来源于其他动物的抗体和人多克隆抗体更安全。产生人单克隆抗体的一种有用的动物是表达人免疫球蛋白基因而不是其自身鼠免疫球蛋白基因的转基因小鼠。这种转基因小鼠，例如"HuMAb"小鼠，含有编码非重排的人重链(p和Y)和K轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(minilocus)，并且具有使内源p和K链基因座失活的定向突变(参见，例如，Lonberg，N.等，Nature368(6474):856-859，1994，和美国专利5，770，429)。因此，该小鼠表现为小鼠IgM或K表达降低，而响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，产生高亲和力的人IgGK单克隆抗体(Lonberg，N.等，见上；综述见Lonberg，N.HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101，1994;Lonberg,N.和Huszar,D.，Intern.Rev.Immunol.,13:65-93,1995，和Harding,F.和Lonberg，N.，Ann.N,Y.Acad.Sci,，764:536—546，1995)。该转基因小鼠的制备详细描述于下面的文献中Taylor,L.等，NucleicAcidsResearch,20:6287-6295,1992;Chen,J.等，InternationalImmunology5:647-656,1993;Tuaillon等,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA90:3720-3724,1993;Choi等，NatureGenetics,4:117-123,1993;Chen,J.等,EMB0J.，12:821—830,1993;Tuaillon等,J.Immunol.,152:2912-2920,1994;Taylor,L.等，InternationalImmunology,6:579—591,1994;和Fishwild,D.等，NatureBiotechnology,14:845-851，1996。进一步参见，美国专利5,545,806;美国专利5，569,825,美国专利5，625，126,美国专利5，633,425,美国专利5,661,016,美国专利5，770,429,美国专利5，789，650，美国专利5,814，318，美国专利5，874，299和美国专利5,877，397,均属于Lonberg和Kay,以及PCT公布WO01/14424，W098/24884，W094/25585，W093/1227,和W092/03918。为了产生针对一种抗原的完全人类单克隆抗体，可以如Lonberg，N.等Nature,368(6474):856—859，1994、Fishwild，D.等,NatureBiotechnology,14:845-851,1996和W098/24884所述用免疫原免疫HuMAb小鼠。优选地，小鼠在第一次免疫时为6-16周龄。例如，可以用灭活狂犬病病毒的纯化制剂腹膜内免疫HuMAb小鼠。为了产生针对狂犬病病毒蛋白质、脂质和/或碳水化合物分子的抗体，可以用活的、杀死的或不存活的灭活的和/或冻干的狂犬病病毒免疫小鼠。在另一实施方案中，狂犬病病毒G糖蛋白或其一个或多个片段可以用作免疫原。当最初使用在弗氏完全佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫，接着隔周用在弗氏不完全佐剂中的抗原腹膜内免疫(最多共六次)时，HuMAb转基因小鼠产生最佳应答。免疫应答可以在免疫方案进程中用眼眶后取血获得的血浆样品进行监测。例如可以通过ELISA或流式细胞术筛查血浆，具有足够效价的抗狂犬病病毒人免疫球蛋白的小鼠可用于融合。用抗原对小鼠静脉内加强免疫，3天后处死，并且取出脾脏。预期每种抗原可能需要进行多个融合。每种抗原一般免疫数只小鼠。分离小鼠脾细胞，按照标准程序用PEG将其与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后对得到的杂交瘤进行抗原特异性抗体产生的筛选。例如，使用50%PEG,将来自被免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数目的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融合。细胞以大约2xl()5接种于平底微量滴定板中，接着在含有20%胎克隆血清、18%"653"条件培养基、5%Origen(IGEN)、4mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mMHEPES、0.055mM2-巯基乙醇、50单位/毫升青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和lxHAT(Sigma;HAT在融合24小时后加入)的选择性培养基中培养两周。两周后，在用HT替换了HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA对各孔的上清液进行人抗狂犬病病毒单克隆IgM和IgG抗体的筛选。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，如果对于人IgG仍然是阳性，则通过有限稀释将抗狂犬病病毒单克隆抗体亚克隆至少两次。然后体外培养稳定的亚克隆，在组织培养基中产生少量抗体用于表征。在一个实施方案中，用来产生抗狂犬病病毒人抗体的转基因动物含有至少一个、一般2-10个、有时25-50个或更多拷贝的WO98/24884实施例12所述的转基因(例如pHCl或pHC2),与含有一个拷贝的WO98/24884实施例5、6、8或14所述轻链转基因的动物繁育，其后代与WO98/24884实施例10所述的JH缺失的动物繁育，所述专利的内容在此引用作为参考。对于这三种性状中的每一个来说，这些动物培育为纯合的。这些动物具有下列基因型单拷贝(每个染色体单倍体组)的未重排的人重链小基因座(WO98/24884的实施例12描述)，单拷贝(每个染色体单倍体组)的未重排的人K轻链构建体(WO98/24884的实施例14描述)，和除去所有功能性JH区段的每个内源小鼠重链基因座处的缺失(WO98/24884的实施例IO描述)。这些动物与对于JH区段缺失而言纯合的小鼠(WO98/24884的实施例10描述)繁育，产生对于JH区段缺失而言为纯合的而对于人重链和轻链构建体而言为半合的后代。给产生的动物注射抗原，用于产生针对这些抗原的人单克隆抗体。从该动物中分离的B细胞对于人重链和轻链是单特异性的，因为它们只含有一个拷贝的每种基因。此外，它们对于人或小鼠重链是单特异性的，因为由于如WO98/24884实施例9和12所迷引入的5夸过Jh区的缺失，两个内源小鼠重链基因拷贝都无功能性。而且，大部分B细胞对于人或小鼠轻链是单特异性的，因为一个拷贝的重排人K轻链基因的表达将等位地和同型地排除在大部分B细胞中内源小鼠K和人链基因的重排。在一个实施方案中，转基因小鼠将表现为产生具有重要的所有组成成分(repertoire)的免疫球蛋白，理想地基本类似于原始小鼠。因此，例如，在内源Ig基因已经灭活的实施方案中，总免疫球蛋白水平将为约0.1-10mg/ml血清，例如0.5-5mg/ml或至少约1.0mg/ml。当向转基因小鼠中引入能够实现从IgM到IgG的转换的转基因时，成年小鼠血清IgG与IgM的比例优选为约10:1。在未成熟的小鼠中IgG与IgM的比例将更低。通常，超过约10%，例如约40-80%的脾和淋巴结B细胞将只表达人IgG蛋白质。转基因小鼠中的所有组成成分理想地接近于非转基因小鼠中所显示的，通常高达至少约10%,优选25-50°/。或更高。通常产生至少约一千种不同的免疫球蛋白(理想地为IgG),优选104-106或更多种，这主要取决于引入小鼠基因组中的不同V、J、D区的数目。一般地，免疫球蛋白对预先选择的抗原表现出至少约10—6M、10—7M、10—8M、10—9M、10_1。M、10—1!M、10—]2M、10_'3M、10—"M或更高、例如可达1(T15M或更高的亲和力。HuMAb小鼠能够产生通过转基因内转换重组而经历类别转换(顺式转换)并且表达对该狂犬病病毒具有反应性的免疫球蛋白的B细胞。该免疫球蛋白可以是人序列抗体，其中重链和轻链多肽由人转基因序列编码，该序列可包括通过体细胞突变和V区重组连接产生的序列，以及种系编码序列。这些人序列免疫球蛋白可以被称为与人VL或VH基因区段和人JL或JL区段编码的多肽序列基本相同，尽管由于体细胞突变和不同的V-J和V-D-J重组连接而可能存在其他非种系序列。对于这些人序列抗体，每条链的可变区一般至少80%由人种系V、J基因区段编码，对于重链，由D基因区段编码。通常，至少85%的可变区由存在于转基因上的人种系序列编码。通常90%或95%或更多的可变区序列由存在于该转基因上的人种系序列编码。但是，由于通过体细胞突变和VJ和VDJ连接引入了非种系序列，人序列抗体通常具有一些不由人V、D或J基因区段编码的可变区序列(较不常见地，恒定区序列)，如在小鼠种系中的人转基因中所见到的。一般地，这些非种系序列(或各个核苷酸位点)将在CDR中或CDR附近聚簇，或者在已知体细胞突变聚集的区域中聚簇。与狂犬病病毒结合的人序列抗体可以由同种型转换产生，从而产生含有人序列Y链(如yl、y2或y3)和人序列轻链(如k)的人抗体。这些同种型转换的人序列抗体通常含有一个或多个体细胞突变，一般位于可变区中，通常在CDR的约10个残基之中或之内，这是抗原攻击，特别是接着进行第二(或后续)抗原攻击引起的B细胞亲和成熟和选择的结果。这些高亲和力人序列抗体具有至少约1x10—9M、一般至少5xl(T9M、通常高于lxl(T10M、有时为5xl(T1。M至1x10—11M或更高的结合亲和力抗狂犬病病毒抗体也能够在包括非转基因小鼠、人、兔和山羊的其他哺乳动物中产生。抗狂犬病病毒抗体与狂犬病病毒特异性结合的人单克隆抗体包括本文所述的克隆17C7、6G11、5G5、2B10和1E5产生的抗体(分别称为抗体克隆17C7、6G11、5G5、2B10和1E5)。具有与17C7、6G11、5G5、2B1G或1E5的可变重链和轻链区至少80%相同的可变重链区和可变轻链区的抗体也可以与狂犬病病毒结合。在有关实施方案中，抗狂犬病病毒抗体包含，例如，与17C7、6G11、5G5、2B10或1E5的可变重链和/或可变轻链的CDR至少80%相同的互补决定区(CDR)。这些抗体克隆的可变重链区的CDR在下面的表1中显示。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>CDR是免疫球蛋白中决定对特定抗原的特异性的部分。在某些实施方案中，具有序列变化(例如保守置换)的对应于表1和表2中CDR的CDR可以与狂犬病病毒结合。例如，与狂犬病病毒结合的抗体(或其抗原结合部分)中可以存在其中CDR中的1、2、3、4或5个残基或少于总残基的20%被置换或缺失的CDR。类似地，抗狂犬病病毒抗体可以具有含有共有序列的CDR，因为在多种抗体之间保守的基序可能对于结合活性至关重要。例如，本发明提供一种或多种CDR区或公开的CDR的衍生物的用途。这些^f汙生CDR来源于公开的CDR或其部分，任选地在一个以上的氨基酸位置处改变。改变包括一个或多个如本文所述的氨基酸添加、缺失或取代。用于改变的残基位置的例子包括确定为比其他氨基酸位置经历更多变异的氨基酸位置，例如，本领域公知的经历体细胞突变的位置。或者，可以通过比较两个或多个已知具有所需结合活性的序列，以及确定变化的CDR残基和恒定的CDR残基，来确定这些位置。例如，以下列出了17C7和6G11重链和轻链可变区的比较(表3-4),并示出了可以由此确定的CDR衍生或共有序列(表5-6)。表3.重链可变区的比较比较17c7H-126aa6G11H-125aa使用矢巨阵文件BLOSUM50,空位罚分—14/-4在125个氨基酸的重叠中同一性为87.2"得分731102030405060STKGPSEQ工DNO:STKGPSEQ工DNO:表4.轻链可变区的比较比较17c7L-107aa6G11Ij-106aa使用矩阵文件blosum50,空位罚分-14/-4在106个氨基酸重叠中同一性为71.7。《；得分527<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>CDR衍生或共有序列的例子在下面给出。表5.重链CDR衍生物<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表6.轻链CDR衍生物<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>应当理解，本文公开的一个或多个CDR(包括CDR衍生或共有序列)可以用于鉴定适合与狂犬病病毒表位结合的天然存在的CM。这些CDR也可以在可变区之间组合或交叉克隆，例如轻链CDR可以导入重链可变区中，重链CDR可以导入轻链可变区中，并进行筛查，以确保保留特异性结合。人抗狂犬病病毒抗体可包含产生自或来源于特定人免疫球蛋白基因的可变区。例如，该抗体可包含产生自或来源于人VH3-30-3或VH3-33基因的可变重链区(参见，例如，Acc.No.:AJ555951，GINo.:29836865;Acc.N。.AJ556080,GINo.:29837087;Acc.No.:AJ556038,GINo.:29837012，和GenBank⑧4是供的其他人VH3-33重排基因片段)。该抗体也可以(或者另外)包含产生自或来源于人vkL6、VkLll、VkL13、VkL15或VkL19基因的轻链可变区(关于重排人VkL19基因片段的部分序列，参见，例如，GenBankAcc.No.:AJ556049、GINo.:29837033)。如本领域所知和上文该章节所述，通过向编码该区域的基因组区段中引入变异性的体内重组方法衍生重组抗体的可变免疫球蛋白区。因此，来源于人VH或VL基因的可变区可包含与非淋巴样组织中所见基因不同的核苷酸。这些核苷酸的差异一般集中在CDR中。而且，上述抗体表现出与狂犬病病毒的结合活性，特别是，与一个或多个狂犬病G糖蛋白表位的结合活性。这些抗体还表现出狂犬病病毒中和活性和对狂犬病后遗症的体内保护效果，这在下文和实施例中进一步描述。2.抗体的产生和修饰抗狂犬病病毒抗体的许多不同形式可用于抑制狂犬病病毒介导的疾病。这些抗体可以是不同的同种型，包括IgG(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgAl、IgA2、IgD或IgE。优选地，该抗体是IgG同种型，例如IgGl。该抗体分子可以是全长的(例如lgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体)，或者可以只包含抗原结合片段(例如Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段)。其中包括单克隆抗体(例如人单克隆抗体)、重组抗体、嵌合抗体和人源化抗体，以及这些抗体的抗原结合部分。在本发明中有用的抗狂犬病病毒抗体或其部分也可以是用编码所需抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA转化的宿主细胞产生的重组抗体。重组抗体可以用公知的基因工程技术产生。例如，重组抗体可以如下产生克隆编码所需抗体的免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列，例如cDNA或基因组DM。然后将编码这些多肽的核苷酸序列插入表达载体中，使这两个基因与它们自已的转录和翻译表达控制序列有效连接。选择表达载体和表达控制序列与使用的表达宿主细胞相匹配。一般将两个基因插入同一表达载体中。可以使用原核或真核宿主细月包。优选在真核宿主细胞中表达，因为这些细胞比原核细胞更可能装配并分泌正确折叠的且具有免疫活性的抗体。但是，产生的由于不正确折叠而失活的任何抗体都可以通过公知的方法复性(Kim和Ba1dwin，Ann.Rev.Biochem.,51:459-89，1982)。宿主细胞可能产生完整抗体的部分，如轻链二聚体或重链二聚体，它们也可以是本发明的抗体同系物。例如应用本领域^^知的重组DNA^支术与基因转染方法的组合，也可以在宿主细胞转染瘤中产生本文所述的抗体(Morrison，S.,Science,229:1202，1985)。例如，在一个实施方案中，可以将目标基因，例如人抗体基因，连接到表达载体中，如真核表达质粒，如wo87/04462、W089/01036和EP338841公开的GS基因表达系统中所用的真核表达质粒，以及本领域公知的其他表达系统。可以将含有克隆的抗体基因的纯化质粒引入真核宿主细胞如CH0细胞或NSO细胞中，或者其他真核细胞如植物来源的细胞、真菌或酵母细胞中。用于转染法、脂转染胺法、(例如氯化钙介导的)转染或轰击转染法，在轰击转染法中用携带目标DNA的微粒轰击细胞(Rodin等，Immunol.Lett.,74(3):197_200,2000)。将这些抗体基因导入宿主细胞中后，可以确定和选择表达该抗体的细胞。这些细力包代表转染瘤，然后可以扩增其表达水平，并且放大，以产生抗体。可以利用标准技术从这些培养上清液和/或细胞中分离和纯化重组抗体。应当理解，在本发明中可以使用上述方法的变化形式。例如，可能需要用编码抗体的轻链或重链(但不是同时编码轻链和重链)的DNA转化宿主细胞。也可以利用重组DNA技术除去编码并非结合所必需的轻链和/或重链的某些或所有DNA,例如，可以通过删除特定氨基酸来修饰恒定区。在此处所述的方法中可以使用由这些截短的DNA分子表达的分子。另外，也可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链能够与狂犬病病毒结合，而另外的重链和轻链对于该狂犬病病毒以外的一种抗原或该狂犬病病毒的另外一个表位是特异性的。本发明范围内也包括其中特定氨基酸已经被置换、缺失或添加的抗体。具体地，优选的抗体在构架区内含有氨基酸置换，例如改善了与抗原的结合。例如，可以将选择的免疫球蛋白链的少量接受体构架残基置换为相应的供体氨基酸。优选的置换位置包括与CDR相邻的或能够与CDR相互作用的氨基酸残基(参见，例如，美国专利5,585，089)。从供体中选择氨基酸的标准在美国专利5，585，089(例如第12-16栏)中记载，该专利的内容在此引用作为参考。接受体构架可以是成熟的人抗体构架序列或共有序列。需要时，可以改变本发明抗体的Fc区，以调节效应功能，例如，补体结合和/或Fc受体结合。构架改变和/或适合改变(例如取代、缺失或插入)的恒定区的标准和亚类在美国专利Nos.6，54S，640;5，S59，205;6，632，927;6，407,213;6,054,297;6，639，055;6，737，056;和6，673，580中记载。"共有序列，，是由相关序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)纟且成的序歹ll(参见，例^口Winnaker,FromGenestoClones(Verlagsgesel1schaft,Weinheim,Germany1987))。在蛋白质家族中，共有序列中的每个位置都被该家族中该位置处最常出现的氨基酸所占据。如果两个氨基酸出现的频率相等，则共有序列中可以包括其中的任一个。免疫球蛋白的"共有构架，，是指共有免疫球蛋白序列中的构架区。抗狂犬病病毒抗体或其抗原结合部分可以纟汙生化或者连接到另外一个功能分子(例如，另外一个肽或蛋白质)上。例如，抗体可以与另外一种或多种分子实体如另外一种抗体、可检测试剂、细胞毒性剂、药剂和/或能够介导与另外一种分子连接的蛋白质或肽(如链霉抗生物素核心区或多组氨酸标记)功能连接(通过化学偶联、基因融合、非共价连接或其他方式)。一种类型的衍生化抗体(或其片段)是通过将两个或多个(相同类型或不同类型的)这样的蛋白质交联在一起而产生的。合适的交联剂包括具有被适当间隔区隔开的两个不同反应基的异双功能交联剂(例如间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能交联剂(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。这些交联剂可从PierceChemicalCompany,Rockford，IL获得。可以衍生化(或标记)抗体(或其片段)的有用的可检测试剂包括焚光化合物、各种酶、辅基、发光材料、生物发光材料和放射性物质。荧光可检测试剂的例子包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明和藻红蛋白。蛋白质或抗体也可以用可检测的酶衍生化，如石成性磷酸酶、辣根过氧化物酶、(3-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等。当蛋白质用可4全测的酶书f生化时，通过加入^皮该酶用来产生可才企测反应产物的其他试剂来检测该蛋白质。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯产生可以检测到的有色反应产物。蛋白质也可以用辅基(例如链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素)衍生化。例如，抗体可以用生物素衍生化，并且通过间接测定抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的结合进行检测。标记的蛋白质和抗体可以用于许多(例如)诊断和/或实验情况中，包括(i)通过标准技术如亲和层析或免疫沉淀法分离预定的抗原；和(ii)检测预定的抗原(例如细胞裂解物或患者标本中的(例如)狂犬病病毒，或狂犬病病毒蛋白、碳水化合物或脂质，或其组合)，以监测组织中的病毒和/或蛋白质水平，作为临床检验程序的一部分，例如确定特定治疗方案的效果。也可以对病毒目标，例如狂犬病蛋白，如G糖蛋白或其片段使用上述任何蛋白质衍生化/标记技术。3.筛选方法可以用多种/>知技术表征抗狂犬病病毒抗体与狂犬病病毒的结合。抗体一般首先通过ELISA进行表征。简言之，微量滴定板用在PBS中的目标抗原例如狂犬病病毒或其G糖蛋白或部分包净皮，然后用在PBS中稀释的无关蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)封闭。将来自用目标抗原如狂犬病疫苗免疫的小鼠的血浆稀释液加入各孔中，在37°C下温育1-2小时。用PBS/Tween20洗板，然后与偶联到石威性磷酸酶上的山羊抗人IgGFc特异性多克隆试剂在37°C下温育1小时。洗涤后，平板用ABTS底物显色，在OD405下分析。优选地，用显示最高效价的小鼠进行融合。如上所述的ELISA试验可以用来筛选抗体，从而选择产生对狂犬病病毒显示阳性反应性的抗体的杂交瘤。然后将产生优选以高亲力与狂犬病病毒结合的抗体的杂交瘤进行亚克隆，并进一步表征。然后每个杂交瘤选择一个保留亲本细胞反应性的克隆(根据ELISA),用于制备细胞库，并用于抗体纯化。为了纯化抗狂犬病病毒抗体，选择的杂交瘤可以在滚瓶、两升旋转摇瓶或其他培养系统中生长。过滤上清液，浓缩，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway，N丄)进行亲和层析,以纟屯化蛋白质。在将緩冲液更换为PBS后，可以通过分光光度法测定浓度。为了确定选择的单克隆抗体是否与独特的表位结合，可以用商售试剂(Pierce,Rockford,II1.)将每种抗体生物素化。生物素化的MAb的结合可以用链霉抗生物素标记的探针4企测。可以进一步通过免疫沉淀或免疫印迹法检测抗狂犬病病毒抗体与狂犬病病毒或狂犬病病毒蛋白的反应性。本发明的特定抗体的特征为与狂犬病G糖蛋白的一个或多个表位结合。例如，狂犬病G糖蛋白的表位可以是线性表位、构象表位、不连续表位、或这些表位的组合。在一个实施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位由抗原位点I、抗原位点II、抗原位点III、抗原位点次要A、或这些抗原位点的组合例如抗原位点III和次要位点A组成。在另一实施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位包含氨基酸残基336-442。在一个特定实施方案中，狂犬病G糖蛋白包含氨基酸残基336和任选的其变化，如取代或缺失(例如，参见，表9)。用于测定抗狂犬病病毒抗体活性的其他试验包括中和试验。体外中和试,验可以测定抗体抑制病毒的细胞致病作用、感染力或病毒在培养细胞之上或之中的存在的能力(见下文实施例3)。可以利用体内中和或存活试验在合适的动物模型中测定狂犬病病毒的中和，它是减少的发病率和/或死亡率的函数(见下文的实施例5)。4.药物组合物和药盒在另一方面，本发明提供组合物，例如药学上可接受的组合物，其包含与药学上可接受的载体配制在一起的此处所述的抗体分子或其抗原结合部分。"药学上可接受的载体，，包括在生理学上匹配的任何及所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。这些载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。本发明的组合物可以是多种形式。包括，例如，液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如注射和输注'溶液)、分散液或悬浮液、脂质体和栓剂。优选的形式取决于预期的给药方式和治疗用途。有用的组合物是可注射或可输注的溶液的形式。一种有用的施用方式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)施用。例如，抗体或其抗原结合部分可以通过静脉内输注或注射施用。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分通过肌肉内或皮下注射施用。本发明的组合物可以与以下物质共同施用a)—种或多种其他抗体，例如抗狂犬病抗体，b)狂犬病蛋白，例如狂犬病疫苗，c)毒素，d)其他治疗剂(例如抗病毒剂)，和/或e)标记物。本文使用的短语"肠胃外施用"意思是除肠内施用和局部施用以外的施用方式，通常是通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘膜内、嚢内、眼眶内、心内、皮内、颅内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、嚢下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和f俞注。治疗组合物在生产和贮存条件下一般应当是无菌的和稳定的。该组合物可以配制为溶液、微乳剂、分散液、脂质体或其他适合高抗体浓度的有序结构。通过将活性化合物(即抗体或抗体部分)以需要的量掺入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着过滤除菌，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和选自上面所列举的其他所需成分的灭菌载体中制备分散液。对于用于制备无菌注射液的灭菌粉末剂来i兌，有用的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，该方法由其先前无菌过滤的溶液得到活性成分加任何其他所需成分的粉末。例如通过应用包衣如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的颗粒大小，和通过应用表面活性剂，可维持溶液的适当的流动性。通过在组合物中包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现注射型组合物的延长的吸收。用，并且用于多种治疗用途。本领域技术人员应当知道，施用途径和/或方式根据需要的结果而不同。在某些实施方案中，抗体或其抗体部分可以例如与惰性稀释剂或可同化食用的载体一起经口施用。该化合物(和其他成分，如果需要的话)也可以包封在硬壳或软壳的明胶胶嚢中、压制成片剂或直接加入受试者的饮食中。对于经口治疗性施用而言，化合物可以与赋形剂一起加入并且以可摄入的片剂、含化片、糖锭剂、胶嚢、酏剂、悬浮剂、糖浆、糯米纸嚢剂等形式使用。为了通过肠胃外施用以外的方式施用本发明的化合物，可能有必要向该化合物上涂覆阻止其失活的材料或者共同施用该化合物与该材料。治疗性组合物可以用本领域/^知的医疗装置施用。调节剂量方案，以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一大丸剂，可以随时间推移施用几次分开的剂量，或者可以根据治疗状况的紧急情况所指示的，按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易施用并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为接受治疗的受试者的单位剂量的物理不连续单位；每一个单位含有预定量的活性化合物，该预定量的活性化合物经计算与所需的药物载体组合产生所需的治疗效果。本发明剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和所要达到的具体疗效，和(b)配制用于治疗个体壽文感性的这种活性化合物的技术中所固有的限制。本发明抗体或抗原结合部分的治疗或预防有效量的示例性的、非限制性的范围是0.1-60mg/kg，例如0.5-25mg/kg,l-2mg/kg或0.75-10rag/kg。在一个实施方案中，抗狂犬病病毒抗体(或其抗原结合部分)的给药量为或者大约为0.125mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg或其区间或范围。还应当理解，对于任何具体受试者来说，应当根据个体需要和施用组合物者或监督组合物施用者的专业判断来随时间推移调节具体剂量方案，此处所述的剂量范围只是说明性的，并非限制要求保护的组合物的范围或实施。本发明范围内也包括含有抗狂犬病病毒抗体或其抗原结合部分的试剂盒。该试剂盒可包含一个或多个其他要素，包括使用说明；其他试剂，例如标记物、治疗剂或用于将抗体与标记物或治疗剂螯合或偶联的试剂，或用于制备所施用抗体的其他材料；药学上可接受的载体；和用于向受试者施用的装置或其他材料。抗体的各种组合可以包装在一起。例如，一个试剂盒可以包^舌可与狂犬病病毒结合的抗体(例如包含17C7、6G11、5G5、2B10、1E5的可变重链和/或轻链区的抗体，或其组合)。这些抗体可以混合在一起或者分开包装于试剂盒内。使用i兌明可以包括例如在具有狂犬病病毒4妄触症状或适应症或怀疑接触了狂犬病病毒的患者中进行治疗性应用的说明，包括建"^义剂量和/或给药方式。其他说明可包括将抗体与螯合剂、标记物或治疗剂偶联的i兌明，或者例如从未反应的偶联成分中纯化偶联抗体的i兌明。该试剂盒可包括可4全测标记物、治疗剂和/或用于将标记物或治疗剂与抗体螯合或偶联的试剂。偶联剂包括诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的试剂。在这些情况中，该试剂盒可包括一个或多个用于进行反应的反应容器或分离装置，例如层析柱，用于将终产物与起始材料或反应中间物分离开来。该试剂盒还可包括至少另外一种试剂，如诊断或治疗剂，例如此处所述的i貪断或治疗剂，和/或另外一种或多种抗狂犬病病毒抗体(或其部分)，必要时它们配制在一个或多个分开的药物制剂中。其他试剂盒可以包4舌用于被动免疫治疗的优化的编码抗狂犬病病毒抗体的核酸，和/或用作(例如)疫苗(主动免疫治疗)的狂犬病病毒蛋白或其片段，和用于表达该核酸的说明。5.治疗方法和组合物本发明的抗体和抗原结合片段具有体外和体内治疗、预防和"^断用途。例如，这些抗体可以(例如)在体外或离体地对培养的细月包施用，或者在体内对动物例如人类受试者施用，以治疗、抑制、预防复发和/或i貪断狂犬病病毒和狂犬病相关疾病。本文使用的术语"受试者"包括人和非人动物。术语"非人动物"包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、小鼠、狗、猫、猪、牛和马。蛋白质和抗体可以(例如)在体外或离体地用于培养的细月包。例如，可以在体外在培养基中培养细胞，并且通过向该培养基中加入抗狂犬病病毒抗体或其片段进行接触步骤。可以对受试者中存在的病毒体或细月包进行该方法，作为体内(例如治疗或预防)方案的一部分。对于体内实施方案，接触步骤在受试者中进行，包括在使抗体或其部分与受试者中(例如在伤口中或周围，或在神经元来源的细胞上或附近)存在的狂犬病病毒或其任意部分结合的有效条件下，向该受试者施用抗狂犬病病毒抗体或其部分。本文描述了施用抗体分子的方法。该分子的适当使用剂量取决于受试者的年龄和体重和使用的具体药物。抗体分子可以用作配体结合的竟争剂，以抑制或减少不需要的相互作用，例如抑制狂犬病病毒与细胞例如神经元细胞的结合和/或感染。抗狂犬病病毒抗体(或其抗原结合部分)可以与其他抗狂犬病病毒抗体(例如其他单克隆抗体、多克隆Y-球蛋白，例如含有抗狂犬病免疫球蛋白的人血清)联合施用。能够使用的抗体组合包括抗狂犬病病毒抗体或其抗原结合部分和/或抗狂犬病病毒G蛋白抗体或其抗原结合部分。抗狂犬病病毒或G蛋白抗体可以是包括该抗体的可变区的抗体克隆17C7、6G11、5G5、2B10和/或E5，或具有与该抗体的可变区至少90%相同的可变区的抗体。在一个实施方案中，抗狂犬病病毒抗体可以是17C7或其部分，或具有与前述抗体如17C7、6G11、5G5、2B10和/或E5的可变区至少90%相同的可变区的抗体。抗狂犬病病毒抗体(例如17C7、6G11、5G5、2B10和/或E5)的组合可以提供对狂犬病、特别是例如特定狂犬病分离株的有效抑制(见表11-13)。适合用本发明的抗体治疗、检测、诊断等的典型狂犬病病毒分离抹包括，例如，CVS-11分离抹、ERA分离抹、Pasteur病毒分离林、灰狐(德克萨斯州)分离抹、灰狐(亚利桑那州)分离抹、北极狐(阿肯色州)分离抹、臭鼬(北方中部)分离林、臭鼬(南方中部)分离抹、浣熊分离抹、丛林狼(德克萨斯州)分离株、狗(德克萨斯州)分离林、蝙蝠(赤蓬毛蝠G^S2'i/ri^6orea7/W;田纳西州)分离斗朱、蝙蝠(大棕蝠(A/^es/ciA/UcwW-鼠耳蝠(￥yo〃、spp.);科罗拉多州)分离抹、蝙蝠(鼠耳蝠spp.);华盛顿)分离才朱、蝙蝠(灰蓬毛蝠a^/wri^c//2erei/W;亚利桑那州)分离林、蝙蝠(东美油蝠(户/p/Wre/7i^Si/6/7a7M，；阿4立巴马州)分离才朱、蝙蝠(巴西犬吻蝠(rat/ar/&6ra^7/e/^/^;阿4立巴马州)分离才朱、编虫畐(纟艮毛虫畐(Za5"/o刀7cefris/7(9C〃Mga/w,;华盛顿)分离才朱、编虫畐(大才宗虫畐(^p"s/cws/z^cwW;宾夕法尼亚州)分离株、猫鼬(纽约/波多黎各)分离林、狗(阿根廷)分离抹、狗(Sonora)分离抹、狗(加蓬)分离林、狗(泰国)分离抹、及其组合。应当理解，本发明的任何药剂，例如抗狂犬病病毒抗体或其片段，可以(例如)以不同的比例或含量联合，用于改善疗效。实际上，本发明的药剂可以配制为混合物，或者利用本领域公知的技术进行化学或遗传连接，从而产生具有抗狂犬病病毒结合性质例如与(例如)狂犬病病毒G糖蛋白的多表位结合性质的共价连接的抗体(或共价连接的抗体片段)。通过测定单独的或与另一种药物联合的药剂的一个或多个参数，如亲和力、亲合力或生物学效能，可以指导组合配制。在耙向、清除和/或隔离狂犬病病毒或其抗原中，本发明的药剂也可以与提高治疗剂的进入、半衰期或稳定性的其他药剂联合施用。在治疗活性方面，例如在狂犬病病毒相关疾病的抑制、预防、感染和/或治疗方面，这些联合治疗优选是加合的，甚至是协同性的。应用这样的联合治疗能够减少达到所需效果所需的治疗剂(例如抗体或抗体片段混合物，或交联的或基因融合的双特异性抗体或抗体片段)的剂量。本发明也提供了免疫原性组合物，其含有免疫原性有效量的狂犬病病毒成分例如狂犬病病毒G糖蛋白或其片段，并且能够用于产生抗狂犬病病毒抗体。狂犬病病毒蛋白序列中的免疫原性表位可以如本文所述(参见例如实施例4)或者按照本领域公知的方法鉴定，含有这些表位的蛋白质或片段可以用多种手段加入到疫苗组合物中。合适的組合物可以包括，例如，脂肽(例如，Vitiello等，J.Clin.Invest.95:341(1995))、包封于聚(DL-丙交酯-共聚-乙交酯)("PLG，，)微球体中的肽组合物(参见，例如，Eldridge等，Molec.Immunol.28:287-94(1991);Alonso等，Vaccine12:299-306(1994);Jones等，Vaccine13:675-81(1995))、包含于免疫刺激复合物(ISCOMS)中的肽组合物(参见，例如，Takahashi等，Nature344:873-75(1990);Hu等，Clin.Exp.Immunol.113:235-43(1998))和多抗原肽系统(MAPs)(参见，例如，Tam,Proc,Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5409-13(1988);Tam，J.Imm画l.Methods196:17-32(1996))。可以与本发明的免疫原性组合物一起使用的有用的载体是众所周知的，包括，例如，曱状腺球蛋白、白蛋白如人血清白蛋白、破伤风类毒素、聚氨基酸如聚L-赖氨酸、聚L-谷氨酸、流感、乙型肝炎病毒核心蛋白等。这些组合物可含有生理学耐受的(即可接受的)稀释剂，如水或盐水，典型的是磷酸盐缓冲溶液。这些组合物和疫苗一般还含有佐剂。如不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾等佐剂是本领域公知的材料的例子。另外，将靶抗原例如狂犬病病毒蛋白(或其片段、失活衍生物或类似物)与脂质如三棕榈酰-S-甘油半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)偶联，可以引发CTL应答。抗狂犬病抗体可以与其他药剂如用于治疗狂犬病病毒介导的疾病的组合物联合施用。例如，可以与抗狂犬病抗体联合施用的治疗剂包括用于治疗、预防或抑制狂犬病的抗病毒剂、血清免疫球蛋白和/或疫苗(例如，疫苗，如RabAvert(Chiron),吸附狂犬病疫苗(Bioport)，和ImovaxRabies(Aventis),和/或免疫球蛋白，如BayRab(Bayer)和ImogamRabies-HT(Aventis))。该4元体可以在狂犬病病毒疫苗之前、之后或同时施用。6.其他方法可以通过标准:忮术，例如亲和层析或免疫沉淀法，利用抗狂犬病抗体(例如单克隆抗体)分离狂犬病病毒。而且，也可以利用抗狂犬病抗体检测(例如血清标本中的)狂犬病病毒，例如，用来筛查标本中狂犬病病毒的存在/接触。可以在诊断上应用抗狂犬病抗体监测组织中病毒的水平，作为临床检验程序的一部分，例如，确定特定治疗方案的效果。另外，狂犬病病毒表位，例如G糖蛋白表位(线性、构象或其纽合)也可以用作免疫原或者作为靶标来鉴定中和性抗狂犬病结合分子，包括，例如，人血清、多克隆抗体、单克隆抗体或其片段。示例在实施例中，除非另外说明，使用如下的材料与方法。材料与方法通常，除非另外说明，本发明的实施使用常规化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(特别是例如抗体技术)和标准多肽制备技术。参见，<列^口，Sambrook，Fritsch牙pManiatis，MolecularCloning:ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989);AntibodyEngineeringProtocols(MethodsinMolecularBiology)，510，Paul:S.，HumanaPr(1996);AntibodyEngineering:APracticalApproach(PracticalApproachSeries,169),McCafferty，编著，IrlPr(1996);Antibodies:ALaboratoryManual,Harlow等，C.S.H丄Press,Pub.(1999);和CurrentProtocolsinMolecularBiology,编著.Ausubel等人，JohnWiley&Sons(1992)。参见，侈寸3口，Smith等人，Jra;/J/7i/aresce/2/1/ocws/"力/6/f/onfestpages181-189andChapter15i"由r"o/y7e由/,i"//2As6/e51,4thed.，editedbyMeslin等人,Geneva:WorldHealthOrganization(1996))。小鼠的免疫和杂交瘤的分离HuMab小鼠(Medarex)是含有人免疫球蛋白基因和失活的小鼠重链基因和K轻链基因的转基因小鼠。HuMab小鼠在第一周一般使用完全弗氏佐剂注射约为人用剂量1/10的商售狂犬病疫苗，在随后数周使用RIBI佐剂，总共6-8周。利用狂犬病包膜糖蛋白ELISA测定血清应答，当认为血清应答达到最大时杀死动物。通过将脾细胞和配体细胞(P3X63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞)融合产生杂交瘤，利用狂犬病糖蛋白ELISA针对反应性筛选得到的上清液。通过蛋白AS印harose层初_法(Amersham)从杂交瘤培养液中纯化阳性抗体。RFFITRFFIT试验如本领域所述进行。使用的狂犬病病毒一朱、街病毒分离林和小鼠成神经细胞瘤细胞(丽A)均来自美国疾病控制和预防中心(CenterfromDiseaseControlandPrevention,Atlanta,USA)。细胞和细胞培养从ATCC获得的服K-293T/17细胞在添加10%胎牛血清和100IU青霉素-链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(腦EM)(完全培养基)中在37。C和5%C02下培养。将细胞收集到含有5mMEDTA的磷酸盐緩沖液(PBS)中。狂犬病糖蛋白的克隆利用狂犬病G蛋白的氨基酸序列(ERA抹，Genbank:AF⑧66")设计包括氨基酸1-524的全长糖蛋白的密码子优化形式的狂犬病糖蛋白基因。将合成基因克隆到pcDNA3.1Myc/His(Invitrogen)内与c一Myc和6-组氨酸(His)标记处于阅读框内。这些免疫标记能够允许容易地纯化和检测。构建截短形式的标记的糖蛋白编码基因，其含有整个外功能区(20-439位氨基酸)。通过从全长糖蛋白克隆中PCR扩增需要的片段，随后限制性消化，并连接到pcDNA3.1Myc/His(Invitrogen)内，进行截短，通过DNA序列分析来证实。为了分离编码各种狂犬病G糖蛋白抹的天然基因，用CVS-ll、臭鼬-CA、赤蓬毛蝠、灰蓬毛蝠和ERA狂犬病病毒(疾病控制和预防中心，USA)感染MNA细胞。使用Trizol试剂从被感染的细胞或病毒体中提取RNA。分两步进行RT-PCR。首先，使用AmbionRetroscript试剂盒合成cDNA，然后用TurboPfu(Stratagene)和狂犬病病毒特异性引物扩增狂犬病糖蛋白编码基因。将狂犬病糖蛋白编码基因克隆到哺乳动物表达载体pCDNA3.lMycHis(Invitrogen)中的HindHI/XbaI位点处，与c-Myc和His表位标记处于阅读冲匡内。利用定点诱变合成重组基因，这些基因编码在归为抗原位点I、II、III和次要位点a的残基处突变的狂犬病糖蛋白。利用含有所需点突变的重叠引物从先前克隆的密码子优化的ERA糖蛋白的pcDM3.1Myc/His载体中扩增全长突变糖蛋白基因。用Dpnl消化PCR扩增的DNA，除去未扩增的野生型起始模板，转化到细菌内，通过测序筛选预期的突变。证实每个突变体的全长编码序列，将得到的构建体克隆到pcDNA3.1Myc/His表达载体内。重组糖蛋白的表达使用Lipofectamine2000(Invitrogen)如厂商所述将所有构建体转染到HEK-293T/17细胞中。细胞在150ram组织培养皿中的15mlDMEM-10%胎牛血清(FCS)中生长到85%汇合。向细胞中添加与75ulLipofectamine混合的30jugDM,将培养^反在37。C下温育过夜。对于分泌型可溶性蛋白质来说，在转染后24、48、"小时吸出培养基并贮存，或者对于膜结合蛋白质来说，弃去培养基。重组蛋白的纯化、免疫沉淀和WesternBlot通过与镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)玉朱(Invitrogen)—起温育，随后进行柱过滤，并用250mM咪唑进行蛋白质洗脱，从细胞培养上清液中纯化狂犬病糖蛋白ERA20-439和CVS-IUO-439，它们均含有Myc和His表位标记。为了免疫沉淀全长膜结合糖蛋白，使用PBS/5mMEDTA将被转染的细胞从培养板上脱离下来，并溶解在PBS,1%CHAPS,IX完全蛋白酶抑制剂中。通过离心使细胞裂解液澄清，与HuMab17C7或对照非狂犬病HuMab和蛋白ASepharose—起温育。通过SDS-PAGE分析免疫沉淀的蛋白质，用于随后进行分析。对于免疫印迹分析，将蛋白质在2XLaemmli样品緩冲液(+/-BME)中煮沸5分钟，使用10或12%Novex凝胶(Invitrogen)分析。如厂商所述将凝胶转移到ImmobilonP(Mi11ipore)上，进行免疫印迹分析。使用小鼠抗-Myc抗体9E10(0.2|Lig/ml)(BDPharmingen)或HuMab17C7(2)Lig/ml)然后使用辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠或抗人IgG(1:5000JacksonImmuoresearch)检测蛋白质。膜与增强化学发光试剂(Amersham)—起温育1分钟，对X-Omat-AR膜曝光不同的时间长度。细胞表面染色在转染48小时后收集用编码全长狂犬病G蛋白的构建体转染的细胞，与不同浓度的HuMabs—起温育。l吏用藻红蛋白标记的抗人IgG(Jackson)检测HuMabs的结合，使用FACScan以及CellQuest软件(BectonDickinson)进行流式纟田胞术。对所有杂交瘤进行捕获ELISA，以鉴定产生人IgG的杂交瘤。ELISA平氺反用3(ig/ml山羊4元人K專至链^t体(SouthernBiotech)包一皮。平板用洗涤緩冲液(PBS,0.05%Tween)洗涤，用封闭緩冲液(PBS,1%BSA，0.05订ween)封闭，洗涤，然后将样品加到平板上(用封闭緩冲液1:2-1:400稀释)。用山羊抗人IgG-AP第二抗体(JacksonImmimoResearch)检测结合，洗板，用溶于1M二乙醇胺的lmg/ml对硝基苯碌酸二钠盐显色20分钟。在405nm下读板。利用捕获糖蛋白ELISA检测HuMab17C7与CVS-1120-439和密码子伊O化的ERA20-439的相互作用。平才反用7.5|iig/ml小鼠抗-c-Myc抗体9E10(BDPharmingen)或鸡抗-c-Myc抗体(MolecularProbes)包被。平板与纯化的糖蛋白或去污剂增溶的细胞裂解液一起溫育，然后与5pg/ml的第一抗体(HuMab17C7和小鼠抗狂犬病糖蛋白R0012(USELISABiological))—起温育。使用碱性磷酸酶偶联的山羊抗人第二抗体(JacksonI隨unoResearch)检测结合，然后如上所述显色。HuMab17C7抗性病毒的产生在第1天将小鼠成神经细胞瘤细胞以1.5xl()S细胞/ml的密度接种于板孔中。在第2天将lxlO'至108FFU/ml的CVS-11狂犬病病毒与IU/mlHuMab17C7(133pg/ml)在37。C下温育1小时。将病毒/抗体混合物加到细胞中，在37。C下温育3-12小时。从细胞中除去病毒/抗体混合物，用培养基洗涤细胞一次，然后加入含有IU/mlHuMab17C7的新鲜培养基再保持60小时。在第5天，从玻片上吸取含有可能的HuMab17C7抗性病毒的培养基，标记，并贮存在4。C。然后为了纟全测狂犬病感染的细胞的存在，通过与l:40稀释的CenticorFITC抗狂犬病IgG(FujirebioDiagnostics)在36°C/0.5%C02下温育30分钟，将玻片染色。然后洗涤玻片，在荧光显微镜(FITC滤光片)下以200x的放大倍数检查。从含有1-5个荧光灶的孔中取出病毒，在HuMabHC7的存在下在MNA细胞中扩增3天。检测扩增的病毒在存在和不存在HuMab17C7的相应条件下感染MNA细胞的能力。6孔板中的MNA细胞用HuMab17C7抗性病毒感染。从病毒感染的细胞中4是取RNA，进行逆转录，使用CVS-ll糖蛋白特异性引物PCR扩增糖蛋白编码序列。通过对完整编码序列进行测序来分析糖蛋白编码基因中的突变。狂犬病^i病毒含有插入到"e/基因内的萤火虫萤光素酶基因的复制缺陷型Env-，Vpr-HIV骨架pNL4-3.Luc.R-E-与狂犬病糖蛋白编码质粒共转染到293T细月包内。pNL4—3.Luc.R-E—^式齐'J通过NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram,DivisionofAIDS,NIAID，andNIH获得。在转染48-72小时后收获々i病毒颗粒，<吏用centricon浓缩器(Millipore)浓缩30倍，并在-80。C下冻存。通过连续稀释病毒，然后感染并检测，确定假病毒制品的每秒萤光素酶计数(见下文)。对于中和测定，每秒约50,000计数的假病毒与抗体一起以及在不含抗体的情况下在室温下温育1小时。在存在2|ag/mlpolybrene的条件下将抗体/病毒混合物加到HOS细胞(ATCCfCRL-1543)上，于4。C以800G离心2小时，然后在37°C/5%C02下温育。在感染72小时后使用Bright-Glo试剂(Promega)按照厂商的方案测定萤光素酶活性。实施例在下面的实施例中进一步描述本发明，这些实施例不是限制权利要求书中所述的本发明的范围。实施例1.抗狂犬病病毒单克隆抗体的产生含有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠如以上标题为"在HuMAb小鼠中产生人单克隆抗体，，一节中所述产生，并且由Medarex,Milpitas,CA提供，将其用6剂商售狂犬病疫苗免疫。该疫苗与弗氏完全佐剂一起施用，然后用另外的狂犬病疫苗和不完全弗氏佐剂加强免疫。狂犬病疫苗由已经灭活并冻千的完整的狂犬病病毒组成。从被免疫的动物中分离脾B细胞，与小鼠骨髓瘤(P3X)细胞融合。产生克隆杂交瘤，并通过ELISA筛选。培养得到的杂交瘤，利用检测人K/Y抗体链的酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测候选人IgG抗体以供进一步分析。被命名为54.17C7、108.6G11、35.5G5.1E12.149、35.2B10.1G11.3FG、和35.1E51G1.4CB的克隆在本文中分别被称为克隆l冗7、6G11、^5、2B10和1E5,进一步通过抗原特异性ELISA试ar确定它们与狂犬病病毒G糖蛋白的特异性结合。另外，选择这5个杂交瘤克隆，通过针对大量不同狂犬病分离抹的RFFIT试验确定它们中和小鼠神经元细胞的狂犬病感染(参见实施例3)。因此，通过RT-PCR从mRNA扩增示例性克隆的cDNA,克隆，并测序。每个克隆发现一个重链V区共有序列(表7)。所有5个克隆都使用来源于两个种系V区基因之一的VH区，但是使用不同的J序列。来自示例性克隆17C7和6G11的VH和VL区的氨基酸序列在图1-2中显示(SEQIDN0s:1、2、15和16)。对于抗体重链和轻链可变区(SEQIDN0s:3-8;17-22)标出了互补决定区(即，CDR1、CDR2和CDR3)。将编码每个克隆的抗原结合部分的DNA克隆到载体中，以表达为给人施用的人抗体。抗体克隆17C7和6G11的轻链和重链的核酸和氨基酸序列在序列表中提供(分别为SEQIDN0s:9-12和SEQIDN0s:23-26)。表7.抗体克隆和基因组成<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>(*上表使用IMGT命名法)实施例2.抗狂犬病病毒抗体的结合活性应用标准技术通过EUSA测定每种抗体与狂犬病病毒特别是狂犬病病毒糖蛋白G的结合。抗狂犬病病毒抗体对于狂犬病病毒糖蛋白G的亲和力也用Biacore⑧仪器测定，该仪器用表面等离振子共振技术检测生物分子结合的相互作用。将每种抗体加到蛋白A包被的传感器芯片上，使狂犬病病毒糖蛋白G流经该芯片，以测定结合。可以测定范围为1x10—6M的KD、1x10—7M的KD、1x10_8M的KD、1x10—9M的KD、1x10_1。M的KD、1x10—nM的KD、1x10—12M的K。以及更高(或其内部或范围)的结合常数。具有有利的结合常数的抗狂犬病病毒抗体指示该抗体具有适合在人类治疗中使用的亲和力。当对(密码子优化的)狂犬病G糖蛋白的外功能区检测时，抗体17C7通过Biacore分析;险测，其结合亲和力至少为1.36E-8M。实施例3.抗狂犬病病毒抗体中和狂犬病病毒在一系列实验中4全测17C7、6G11、5G5、2B10和1E5杂交瘤表达的抗体的体外狂犬病病毒中和活性(见下面的表8-11)。具体而言，使用快速焚光灶抑制试验(RFFIT)测定狂犬病中和活性，该方法利用荧光标记的抗体检测小鼠成神经细胞瘤细胞的狂犬病病毒感染。RFFIT试一验是医学和7>共卫生专家用来测定特定抗体制品中和狂犬病病毒(即，抑制其感染细胞的能力)的效力的一种标准试验。该试验一般使用固定的病毒(CVSll)进行，但是也可以使用来自被感染动物的分离林进行。该试验如下进行将标准量的病毒与抗体稀释液一起或者在没有抗体稀释液的情况下加入到小鼠成神经细胞瘤细胞单层中。培养该单层，然后使用荧光标记的抗狂犬病核蛋白单克隆抗体检测被感染的成神经细胞瘤细胞的灶(foci)。使用荧光显微镜显示并计数灶。然后报告结果，即没有荧光灶的显微镜视野数为50。/。时的抗体浓度(稀释度)。所有试验都包括用于比较的标准狂犬病免疫球蛋白制品(SRIG)。针对来自北美的各种脊推动物的具有公共卫生意义的一組狂犬病病毒分离林检测抗狂犬病人单克隆抗体17C7、6G11、5G5、2B10和1E5。表8显示了选择的抗体与现有的疗法(即，人抗狂犬病血清；"SRIG，，)相比，对一組狂犬病病毒分离抹的体外中和测定结果。数字表示抗体可以被稀释而仍然显示出50%的中和活性的稀释倍数，即在体外阻断狂犬病病毒感染鼠成神经细胞瘤细胞的能力。较高浓度的17C7对选择的分离抹的结果显示在下面的组中。表8.毒抹中和结果<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>最初，根据中和狂犬病病毒抹CVS-11的能力筛查每种HuMAb。然后针对来自北美、南美、欧洲、非洲和亚洲的具有公共卫生意义的一大组分离才朱更广泛地检测中和HuMab。显著地，与HuMabs2B10和5G5不同，HuMab17C中和大多数狂犬病病毒分离林(表8)。对一种从美国加利福尼亚的臭鼬中分离的街道狂犬病病毒(臭鼬-CA)测定50%终点中和滴度。HuMabl7C7(测试浓度为0.03mg/ml)针对加利福尼亚臭鼬计算的滴度为l:12，898,证明HuMab17C7强烈中和该街道病毒。为了更好地理解如何将单个人单克隆抗体的效能与多克隆hRIG进行比较，在RFFIT试验中使用CVS-11狂犬病病毒检测相同抗体浓度的HuMab17C7和hRIG。hRIG的50。/。终点滴度为1:224，而HuMab17C7为1:7029(图4)。因此，在同等的抗体浓度下，HuMab17C7比hRIG更强地抑制CVS-11的感染。这些初步实^r揭示HuMab17C7能够中和多种狂犬病病毒分离抹，中和程度从低抗体剂量时对臭鼬CA分离抹的强烈中和(0.03Mg/ml;1:12,898)到较高抗体剂量时对CVS-ll的强度较低的中和(2mg/ml;l:7029)不等。针对最初在对杂交瘤上清液的RFFIT检测中不显示中和的狂犬病分离林(赤蓬毛蝠，頂和灰蓬毛蝠，AZ),使用不同浓度的纯化的17C7进行重复检测，在该重复检测中证明能够中和这两种病毒。这些数据提示HuMab17C7与来自赤蓬毛蝠-TN和灰蓬毛蝠-AZ分离4未的狂犬病糖蛋白上的中和表位相互作用(表9)。表9.在针对从北美蝙蝠中分离的狂犬病病毒(赤蓬毛蝠和灰蓬毛蝠)的RFFIT中HuMabs2B10、17C7和5G5的50°/。终点中和(滴度的倒数)<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>也检测了HuMab17C7克隆中和非狂犬病狂犬病病毒的能力。狂犬病病毒(lyssaviruses)不是一个重要的世界范围上的公共卫生问题，但是在少数人类病例中导致致死性的疾病。这些事件以及某些狂犬病病毒在野生动物宿主中的流行已经导致最近对狂犬病生物制剂是否具有针对非狂犬病狂犬病病毒的保护能力的兴趣。在改良的RFFIT试验中4企测时，HuMab17C7能够有力地中和澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒。计算的HuMabl7C7(检测浓度为2mg/ml)针对澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒的滴度大于l:1400，i正明HuMab17C7中和澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒(表10)。表IO.在RFFIT中HuMabsl7C7针对从狂犬病病毒的50。/。终点中和(滴度的倒数)狂犬病病毒属hRIGHuMab17C7(2IU/ml)(2mg/ml)狂犬病(CVS-11)270>1400Lagos<5<5Mokola<5<5Duvenhage13<5区欠洲蝙蝠狂犬病病毒142<5欧洲蝙蝠狂犬病病毒240<5澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒54〉1400这些数据表明，在RFFIT试验中，抗狂犬病单克隆抗体能够中和来自多种北美脊推动物的具有公共卫生意义的狂犬病病毒分离抹。实施例4.抗狂犬病病毒G糖蛋白抗体的表位作图通过免疫印迹法和免疫沉淀试〗全确定#皮每种单克隆抗体结合的狂犬病病毒糖蛋白G的表位(见图3)。使用聚合酶链反应(PCR)和基因工程技术构建来自ERA狂犬病病毒分离抹的密码子优化的全长合成人狂犬病病毒G糖蛋白基因。将该基因和缺失衍生物克隆到用于在人293T细胞中表达的pCDNA3.1A(Invitrogen)中。^吏用标准技术进行免疫印迹和免疫沉淀实马全。j吏用重组表达的狂犬病病毒G糖蛋白的结果显示人单克隆抗体17C7对狂犬病G糖蛋白外功能区的丽3末端19-422位氨基酸内的表位作图。人单克隆抗体5G5、2B10、1E5在免疫印迹实^r中不与可溶性G糖蛋白片段反应。为了进一步在体外检测HuMab17C7与狂犬病糖蛋白的相互作用，克隆并表达了来自多种狂犬病病毒林和分离林的狂犬病病毒糖蛋白。最初从pcDNA3.1Myc/His(Invitr。gen)哺乳动物表达载体中克隆并表达了野生型CVS-11糖蛋白，但是在转染的人细胞中以低水平表达。为了克服这种低水平的表达，使用本领域公知的技术构建了密码子优化形式的ERA狂犬病糖蛋白编码基因(era-co)。也克隆了其他G蛋白(ERA(ew/),来自美国加利福尼亚州的臭鼬分离林(臭鼬-ca)，和蝙蝠分离抹赤蓬毛蝠-"和灰蓬毛蝠-az)。ERA糖蛋白编码基因的密码子优化导致表达水平比野生型ERA糖蛋白显著提高(图5A)，作为用于许多后续实验的有用的试剂。确定HuMab17C7从溶解的era-(未显示)、era-/、臭鼬-cs、赤蓬毛蝠-^和灰蓬毛蝠-az分离抹感染的细胞中免疫沉淀出糖蛋白(图5B)。使用流式细胞术进一步显示HuMab17C7也依赖于剂量地结合在其细胞表面上表达ERA-CO、ERA-N、赤蓬毛蝠-TN和灰蓬毛蝠-AZ糖蛋白的细胞(图5C和D)。这些数据表明HuMab17C7与来自多种毒林和分离抹的狂犬病病毒糖蛋白特异性结合。为了更好地表征HuMab17C7识别的表位，检测l冗7，并且确定其识别不具有糖蛋白胞质结构域或跨膜结构域的可溶形式的狂犬病糖蛋白(氨基酸20-439)。在ELISA中也确定HuMAb1冗7识别包括氨基酸20-439的分泌型可溶形式的ERA糖蛋白(ERA-CO20-439)和CVS-ll糖蛋白(CVS-1120-439)(图6A)。令人惊讶的是，在含有还原剂和SDS的样品緩冲液中温育后，在SDS-PAGE凝胶中HuMab17C7识别变性的ERA-COM-439和ERACO。然而，当不加还原剂准备样品时，信号的强度大大提高(图6B)。在没有还原剂时，在SDS-PAGE中未观察到对CVS-1120-439糖蛋白的这种识别(图6C)。这些数据表明HuMab17C7识别ERA狂犬病糖蛋白上的不连续表位。HuMab17C7识别狂犬病病毒糖蛋白的次要位点a和抗原位点III。为了更好地理解HuMab17C7识别狂犬病病毒糖蛋白上的哪些区域，构建了能够在HuMab17C7的存在下生长的狂犬病病毒。为了产生HuMabUC7抗性病毒，细胞培养CVS-ll抹和臭鼬-CA分离抹。/人CVS-11病毒原种中分离HuMab17C7抗性病毒。对这些CVS-ll衍生的病毒的糖蛋白编码序列进行分析，揭示在所分析的8种病毒(CVS1-8)中具有3点突变。令人感兴趣的是，在两例中鉴定到天冬酰胺336处的氨基酸改变。一种病毒含有Asn到Lys的改变，多种病毒含有Asn到Asp的改变。两种病毒含有336位Asn到Asp的改变，以及"6^f立Gln到Lys的改变。天冬酰胺336位于以前被确定为抗原位点III的一部分的区域内(表11)。为了确定天冬酰胺336是否是HuMab17C7结合的关键残基，将ERA-co构建体中的天冬酰胺336残基突变为在CVS-1l衍生的抗性病毒中发现的残基。如图5和6所示，ERA糖蛋白被HuMab17C7强烈识别；与CVS-11相比，HuMab17C7也强烈中和在糖蛋白序列上与臭鼬-CA高度相似的ERA病毒。因此，在这组实验中，Asp336残基显示对于HuMab17C7中和CVS-ll病毒是重要的，对于保持ERA糖蛋白内的HuMabHC7表位也是重要的。表达突变的糖蛋白ERA-C0N""和ERA-C0N336D,并测定HuMab17C7的识别。在ELISA中HuMab17C7识别突变糖蛋白，然而HuMab17C7与ERA-C0N336K糖蛋白的结合与野生型相比大大降j氐(图7A)。根据小鼠抗狂犬病糖蛋白单克隆抗体的相当的结合显示，在ELISA测定中捕获的野生型和突变糖蛋白的水平是类似的(图7A)。^使用His标记进行免疫沉淀，然后用Myc标签抗体进行免疫印迹分对斤，显示突变糖蛋白都具有适当的分子量(图7B)。与ERA-C0N336K糖蛋白相比，HuMab17C7更容易免疫沉淀ERA-C0和ERA-C0N336D糖蛋白(图7B),这与在ELISA中观察到的ERA-C0N336K结合的降低相一致。与野生型ERA-CO相反，在非还原条件下在WesternMot中突变蛋白不祐:识别(图7B)。我们也产生了ERA-CON336DQ426K和ERAQ426K,ELISA和免疫印迹结果分别与ERA-CON336D和ERA-COQ426K相似，显示Q426K突变不影响HuMab17C7的结合。为了确定HuMab17C7的识别是否与中和活性相关，使用ERA-C0沣唐蛋白产生狂犬病糖蛋白假型HIV-l假病毒(lO，20)。观察到这些，支病毒颗粒感染人细胞(图8A),HuMab17C7强烈抑制野生型ERA-C(M艮病毒的感染，显示降至100pM的显著抑制(图8B)。检测了1000nM的无关的非狂犬病HuMabs,它们不中和狂犬病假病毒。令人感兴趣的是，HuMab17C7也抑制ERA-CON336K和ERA-CON336D假病毒的感染(图8C)，这与观察到的HuMab17C7识别ERA-CON336K和ERA-CON336D糖蛋白相一致。与HuMab17C7类似，hRIG也以依赖于剂量的方式抑制所有狂犬病假病毒(图8D)。这些数据证明，使CVS-ll病毒对HuMabl(^中和不敏感的突变降低而不消除ERA糖蛋白的HuMab17C7识别和EM假病毒的中和。为了检测其他良好表征的抗原位点是否被HuMab17H识别，产生了一组突变糖蛋白，它们含有以前对于在影响抗原位点I、n、III和次要位点a的残基上发生改变的mAb抗性病毒报道的氨基酸改变(表11)。HuMab17C7容易从细胞裂解液中免疫沉淀所有突变糖蛋白，例外是R3331、K342T、G343E糖蛋白，它们在抗原位点III的一部分(氨基酸33)和次要位点a(氨基酸342和343)中突变。通过产生分开的R333I位点III突变体和K342T、G343E次要位点a突变体，进一步表征了对于HuMab17C7结合重要的决定蔟。在ELISA和免疫印迹分析中R333I位点III突变体被HuMab17C7识别，而K342T、G343E次要a和R333I、K342T、G343E位点III/次要a突变体的识别较差19(图9A和9B)。K342T、G3卩3E和R3331、K342T、G343E突变体被商品狂犬病单克隆抗体识别(图9A),具有适宜的分子量(图9B)，表明这些糖蛋白以相当的水平表达。因此，确定了HuMab17C7不能与次要位点a突变体结合是由于糖蛋白的氨基酸342和343突变，证明了这些氨基酸对于HuMab17C7识别狂犬病糖蛋白是重要的(表12)。另外，还比较了狂犬病病毒分离抹和非狂犬病狂犬病病毒在氨基酸336、342和343处的糖蛋白序列。对于HuMab17C7重要的残基在不同的狂犬病病毒4朱和澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒之间保守，{旦是在其4也狂犬病病毒之间不保守(表13)。将来自全世界，包括北美、南美、中国和印度的人、蝙蝠和食肉动物分离抹的154种狂犬病病毒的糖蛋白序列进行比较。序列比较揭示天冬酰胺336为93°/。保守，赖氨酸342为98°/。保守，甘氨酸343为99%保守。这些数据表明对于HuMab17C7识别狂犬病病毒而言重要的残基高度保守。表ll.HuMab17C7抗性病毒病毒氨基酸数氨基酸改变密码子改变靠近抗原位点CVS1336Asn一LysAAT—AAGIIICVS2--6336Asn—AspAAT—GATIIICVS7--8336Asn—AspAAT—GATIIICVS7--8426Glu—AspCAG—AAGN/A表12.HuMab17C7识别位点I和位点II突变的糖蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表13.狂犬病病毒和狂犬病毒属其他病毒的氨基酸330-345<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>HuMab17C7由于能够以较高的反应性与非还原的蛋白质结合，因此识别不连续表位。HuMab17C7与狂犬病糖蛋白的相互作用也是独特的，因为它能够免疫沉淀多种狂犬病分离林的膜结合糖蛋白，并且中和所有这些分离抹，但是在ELISA和免疫印迹分析中只能与一部分分泌型可溶性糖蛋白相互作用。HuMab17C7识别非还原的蛋白质表明狂犬病糖蛋白的抗原位点II、次要位点a、或未知的构象决定簇对于HuMab17C7的识别是重要的。突变糖蛋白的分析揭示在次要位点a处的2个氨基酸改变显著降低了HuMab17C7对狂犬病糖蛋白的识别。这两个氨基酸改变破坏了狂犬病糖蛋白上的HuMab17C7结合位点，和/或导致对于HuMab17C7结合重要的狂犬病糖蛋白三级结构发生改变。这些数据显示，HuMab17C7抗性病毒表明天冬酰胺336对于HuMab17C7中和是重要的。残基336处的氨基酸改变破坏了狂犬病糖蛋白上的HuMab17C7结合位点，和/或导致对于HuMab17C7结合重要的狂犬病糖蛋白结构发生改变。通过定点诱变产生的突变糖蛋白的分析也揭示了HuMab17C7既识别次要位点a也识别抗原位点III的一部分。总之，这些结果表明HuMab17C7识别广泛保守的表位。HuMab17C7的宽交叉反应性指示它可以代替RIG用于接触后预防。实施例5.施用抗狂犬病病毒抗体〗呆护仓鼠避免致死性狂犬病病毒攻击检测了抗体保护仓鼠避免致死剂量的狂犬病病毒攻击的能力(见表14-15)。也在仓鼠接触后预防(PEP)模型中检测了人单克隆抗体17C7,以确定其作为人类狂犬病病毒感染的预防的潜力。用致死剂量的狂犬病病毒经仓鼠后腿的腓肠肌进行攻击。攻击病毒最初从得克萨斯州丛林狼中分离。在该模型中，未治疗的动物在不到2周内死于狂犬病病毒感染。简要地说，用50/il狂犬病病毒经动物的用夂肠肌进^亍攻击，并在24小时后在相同部位给予抗狂犬病病毒抗体。动物(n=9)用单剂量的19mg/kg商售人狂犬病血清来源的免疫球蛋白(HRIG，Imogam，Aventis)或各种剂量(5、0.5或0.25mg/kg)的人单克隆抗体17C7治疗。未治疗攻击组的所有动物都在攻击2周内死于狂犬病。在攻击63天后的存活百分比显示Q.25mg/kg剂量的该单克隆抗体比商售人免疫球蛋白具有更好的保护(表14)。进行类似的实验，其中在动物接触狂犬病后用抗体进行治疗，另外，用狂犬病疫苗治疗。在狂犬病攻击1、3、7、14、28天后以50n1的注射体积向与攻击部位相对的崩夂肠月几施用商业人用疫苗。如前所述施用抗体。攻击53天后的存活百分比显示0.125mg/kg剂量的该单克隆抗体比商售人免疫球蛋白具有更好的保护(表15)。抗体单独施用以及与疫苗一起施用，表14-15中显示的结果证明在接触病毒后单独地(见表14)或与狂犬病疫苗联合(表l5)给予本发明的抗体可以保护用致死剂量的狂犬病病毒攻击的仓鼠。为了证明17C7不干扰疫苗应答，给予仓鼠17C7和狂犬病疫苗。如表16所示，动物甚至在给予17C7时也对疫苗具有应答，由此证明17C7抗体不干扰疫苗应答。表14.用人单克隆抗体对狂犬病的接触后^f呆护a<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>在接种得克萨斯州丛林狼狂犬病病毒分离抹(#323)M小时后，在8个治疗组(每组9只动物)中在病毒接种部位施用人单克隆抗体17C7(26IU/kg;7IU/kg、1IU/kg或O.05IU/kg)或商售人狂犬病免疫球蛋白(15IU/kg、6IU/kg、1IU/kg或0.05IU/kg)开始预防。非治疗对照组由9只动物组成。表15.包括疫苗的狂犬病接触后预防人单克隆抗体与人狂犬病免疫J求蛋白的比4交a<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>a在用来自自然感染的丛林狼的唾液腺匀浆(得克萨斯州丛林狼狂犬病病毒分离林#323)进行狂犬病病毒接种(50ul1:1000(106'8MICLD"ml)24小时后，在4个治疗组(A-D)(每组18只仓鼠)中在病毒接种部位施用人单克隆抗体nC7(2QIU/kg;10IU/kg或2IU/kg)或商售人狂犬病免疫球蛋白(20IU/kg)开始预防。50)ul体积的商售狂犬病疫苗施用于左腓肠肌。在第3、7、l4、28天施用额外剂量的疫苗。非治疗对照组由18只动物组成。表16.狂犬病疫苗和抗体联合应用后狂犬病病毒中和抗体的效价的几何平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>三个治疗组(A-C)的动物在左腓肠肌肌肉内接受人单克隆抗体17C7(25IU/kg(B组)或15IU/kg(C组))或商售人狂犬病免疫球蛋白(25IU/kg)。在右腓肠肌中给予50Ul体积的商售狂犬病疫苗。在第3、7、14、28天施用额外剂量的疫苗。在第3、7、14、28、42天，向每组6只动物给予镇静剂，采血，对动物施以安乐死。总之，这些数据表明HuMab17C7总是提供对抗狂犬病的体内保护，并且可以代替RIG用于接触后预防。实施例6.用于对人施用的抗狂犬病病毒抗体的产生可以应用已知的技术克隆和重组表达本发明的人抗体，以促进或提高其产量。4吏用标准重组DNA方法将编码抗体的可变重链和轻链的核酸序列克隆到pIE-UgammalF载体中。该载体在大肠杆菌中扩增，纯化，并转染到CHO细胞内。将被转染的细胞以每孔4x105细胞的密度接种到96-孔培养皿中，并用G418对载体转染进行筛选。根据G418抗性选择抗性克隆，然后与其他转染瘤一起测定IgG的产生。通过在浓度逐渐增加的氨甲喋呤的存在下生长，提高抗体的表达。选择能够在I"nM氨甲喋呤中生长的培养物，用于克隆单细胞，以供进一步开发。将该培养物以低密度接种于96孔板中，导致产生起源于单细胞或克隆的培养物。针对人IgG的产生筛选这些培养物，一般选择产生最高水平IgG的细胞进一步应用。扩大氨曱喋呤扩增的克隆数，产生包括几十个细胞瓶的细胞库。可替代的，可以使用谷氨酸合成酶(GS)载体，以及使用例如曱硫氨酸砜亚胺实现细胞选择(参见，例如，美国专利Nos.5，S27，739;5,122，464;5,879,936;和5，891，693)。为了从被转染的细胞制备抗体，培养在前述步骤中分离的克隆的细胞，并且扩增，作为生物反应器的接种物。生物反应器一般容纳500升体积的培养基。细胞在生物反应器中培养，直到细胞生存力下降，这指示在培养物中已经产生了最大的抗体浓度。过滤除去细胞。将滤液加至蛋白A柱上。抗体与该柱结合，用低pH洗液洗脱。然后，将抗体加至Q-Sepharose柱上，除去残余的杂质，如CHO细胞蛋白质、DNA和其他杂质(例如病毒污染物，如果存在的话)。从Q-Sepharose柱上洗脱抗体，納米过滤，浓缩，在缓冲液如PBS中洗涤。然后将该制剂无菌分装到小瓶中用于施用。其他实施方案本领域技术人员应当认识到或者仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明特定实施方案的许多等同方案。这些等同方案包括在下面的权利要求书内。权利要求1.一种分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，它与狂犬病病毒特异性结合并且抑制该病毒感染细胞的能力。2.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分在快速荧光灶抑制试验UFFIT)中中和狂犬病病毒。3.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体在受试者体内抑制狂犬病病毒。4.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分防止或抑制受试者中狂犬病病毒介导的神经元病理状况；防止或抑制受试者中狂犬病病毒介导的脑脊髓炎；或防止或抑制受试者中狂犬病病毒介导的麻痹。5.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述狂犬病病毒是选自下组的分离林CVS-11分离抹、ERA分离抹、Pasteur病毒分离才朱、灰狐(德克萨斯州)分离林、灰狐(亚利桑那州)分离株、北极狐(阿肯色州)分离林、臭鼬(北方中部)分离抹、臭鼬(南方中部)分离抹、浣熊分离抹、丛林狼(德克萨斯州)分离抹、狗(德克萨斯州)分离抹、蝙蝠(赤蓬毛蝠；田纳西州)分离株、蝙蝠(大棕蝠-鼠耳蝠；科罗拉多州)分离林、蝙蝠(鼠耳蝠；华盛顿)分离抹、蝙蝠(灰蓬毛蝠；亚利桑那州)分离林、蝙蝠(东美油蝠；阿拉巴马州)分离林、蝙蝠(巴西犬吻蝠；阿拉巴马州)分离抹、蝙蝠(银毛蝠；华盛顿)分离抹、蝙蝠(大棕蝠；宾夕法尼亚州)分离抹、猫鼬(纽约/波多黎各)分离抹、狗(阿根廷)分离抹、狗(Sonora)分离抹、狗(加蓬)分离抹、狗(泰国)分离林、及其组合。6.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体与狂犬病病毒G蛋白或其片段内的一个或多个表位特异性结合。7.权利要求6的抗体或其抗原结合部分，其中所述表位位于狂犬病病毒G蛋白的氨基酸19-524、19-439、19-422或336-342之间。8.权利要求6的抗体或其抗原结合部分，其中所述表位包括选自抗原位点I、抗原位点II、抗原位点III、抗原位点次要A及其组合的抗原位点。9.权利要求6的抗体或其抗原结合部分，其中所述表位选自线性表位、构象表位、不连续表位及其组合。10.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以至少约1x10—7M、1x10_sM、1xl(T9M、1x10—1QM、1x10—11M、1xl(T'2M或更好的K。与狂犬病病毒的G蛋白或其片段特异性结合。11.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变重链区，该可变重链区包含与SEQIDNO:l(17C7)或SEQIDNO:15(6Gll)的可变重链区氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。12.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变轻链区，该可变轻链区包含与SEQIDNO:2(17C7)或SEQIDNO:16(6Gll)的可变轻链区氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。13.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变重链区，该可变重链区包含与SEQIDN0:1(17C7)或SEQIDNO:15(6Gll)的可变重链区氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。14.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变轻链区，该可变轻链区包含与SEQIDN0:2(17C7)或SEQIDNO:16(6Gll)的可变轻链区氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。15.权利要求13的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体或其抗原结合部分还包含可变轻链区，该可变轻链区包含与SEQIDNO:2(17C7)或SEQIDNO:16(6G11)的可变轻链区氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。16.—种分离的人抗体或其抗原结合部分，它与狂犬病病毒G斗唐蛋白上的表位特异性结合，该表位与被克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5产生的抗体结合的表位重叠。17.—种分离的人抗体或其抗原结合部分，它与狂犬病病毒G糖蛋白上的表位特异性结合，该表位与被人血清免疫球蛋白或鼠单克隆抗体MAb1112-1(A.T.C.C.登记号:HB10751)结合的表位重叠。18.权利要求17的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与人血清免疫球蛋白或鼠单克隆抗体MAb1112-1(A.T.C.C.登记号HB10751)竟争结合狂犬病病毒G蛋白。19.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变重链区包含与SEQIDNOs:3-5(17C7)中的一个或多个或与SEQIDNOs:17-19(6G11)中的一个或多个至少80%相同的一个或多个互补决定区(CDR)。20.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包含与SEQIDNOs:6-8(l冗7)中的一个或多个或与SEQIDNOs:20-22(6G11)的一个或多个至少80%相同的一个或多个互补决定区(CDR)。21.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变重链区包含与SEQIDNOs:3-5(17C7)中的一个或多个或与SEQIDNOs:17-19(6G11)中的一个或多个至少95%相同的一个或多个互补决定区(CDR)。22.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包含与SEQIDNOs:6-8(UC7)中的一个或多个或与SEQIDNOs:20-22(6G11)中的一个或多个至少9/。相同的一个或多个互补决定区(CDR)。23.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中可变重链区包含与SEQIDN0s:3-5(17C7)中的一个或多个或与SEQIDNOs:17-19(6G11)中的一个或多个的可变重链区CDR至少80。/。相同的三个CDR。24.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中可变轻链区包含与SEQIDNOs:6-8(17C7)中的一个或多个或与SEQIDNOs:22-22(6G11)中的一个或多个的可变重链区CDR至少8(T/。相同的三个CDR。25.—种与狂犬病病毒特异性结合的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分(a)包含由人VH3-30基因或VH3-33基因编码或衍生的重链可变区；且(b)包含由逸自VkL6、VkLII、VkL13、VkL15、或VkL19的人Vk基因编码或衍生的轻链可变区。26.权利要求25的抗体，其中重链可变区由VH3-33基因编码或衍生，并且轻链可变区由VkL13编码或^f';t生。27.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分抑制狂犬病病毒与哺乳动物细胞的结合。28.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制狂犬病病毒G蛋白与哺乳动物细胞的结合。29.权利要求l的抗体，其中所述抗体是全长抗体。30.—种分离的多肽，其包含上述任一项权利要求的抗体的抗原结合部分。31.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含效应结构域。32.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含Fc结构域。33.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是单链抗体。34.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是Fab片段。35.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其还包含标记或毒素。36.—种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的上述任一项;):又利要求的抗体或其抗原结合部分。37.—种组合物，其包含两种或多种上述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体与狂犬病病毒的不同表位结合。38.—种分离的核酸，其编码与狂犬病病毒结合的人抗体的可变区，包含与SEQIDNO:13或SEQIDNO:14、SEQIDNO:25或SEQIDNO:27至少90%相同的序列。39.—种表达载体，其包含权利要求38的核酸。40.—种宿主细胞，其包含^l利要求38的核酸。41.一种狂犬病疫苗，其包含分离的狂犬病G糖蛋白或其片段。42.—种试剂盒，其包括一种或多种如权利要求1所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，和用于治疗狂犬病病毒介导的疾病的说明。43.—种治疗受试者的狂犬病病毒疾病的方法，该方法包括以有效抑制狂犬病病毒疾病症状的量给受试者施用上述任一项^又利要求的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分。44.权利要求43的方法，其中所述受试者是人。45.权利要求43的方法，其中给受试者静脉内、肌肉内或皮下施用所述抗体或其抗原结合部分。46.权利要求43的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分与第二治疗剂联合施用。47.权利要求46的方法，其中所述第二治疗剂是第二种人抗体或其抗原结合部分。48.权利要求46的方法，其中所述第二治疗剂是抗病毒剂。49.权利要求46的方法，其中所述第二治疗剂是狂犬病病毒疫苗。50.权利要求49的方法，其中所述狂犬病病毒疫苗是狂犬病病毒G蛋白或其片段。51.—种适合治疗哺乳动物中狂犬病病毒相关疾病或紊乱的组合物，其包含在药学上可接受的载体中的权利要求1的人抗体或其抗原结合片段。52.权利要求51的组合物，其中该组合物还包含第二种与狂犬病病毒结合的人抗体。53.—种治疗哺乳动物中狂犬病病毒相关疾病或紊乱的方法，包括给该哺乳动物施用两种或多种与狂犬病病毒结合的抗体或其片段，使狂犬病病毒对细胞的感染力受到抑制。54.权利要求53的方法，其中所述与狂犬病病毒结合的抗体或其片段是选自17C7、6G11、5G5、2B10或1E5的人单克隆抗体。55.—种鉴定与狂犬病病毒或其糖蛋白特异性结合的抗体或其片段的方法，包括使该抗体接触上述任一项权利要求的狂犬病G蛋白。56.权利要求55的方法，其中所述抗体是人抗体血清、多克隆抗体或单克隆抗体。57.权利要求55的方法，其中所述抗体与线性表位、构象表位或其组合特异性结合。58.权利要求55的方法，其中确定所述抗体与一种以上的狂犬病病毒抹具有交叉反应性。59.—种根据权利要求54的方法鉴定的抗体或其片段。60.—种重组狂犬病G蛋白，其包含是线性表位、构象表位或其组合的表位，并且在导入哺乳动物体内时能够诱导中和抗体。61.权利要求60的糖蛋白，其中所述哺乳动物是人、灵长类动物或小鼠。62.权利要求61的糖蛋白，其中所述小鼠是含有人免疫球蛋白序列的转基因小鼠。全文摘要本发明提供了与狂犬病病毒特异性结合的人单克隆抗体，其抗原结合部分，以及制备和应用该抗体及其抗原结合部分治疗受试者中狂犬病病毒的方法。文档编号C12N5/10GK101133158SQ200680007172公开日2008年2月27日申请日期2006年2月2日优先权日2005年2月2日发明者C·鲁普雷希特,D·安布罗西诺,G·J·巴布科克,R·曼德尔,S·舍恩霍夫,W·D·小托马斯申请人:马萨诸塞州大学;美国疾病控制与预防中心