专利名称：用于生产乙醇的、具有失活的乳酸脱氢酶基因(ldh)的嗜热微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为细菌发酵产物的乙醇的生产。具体而言，本发明涉及借助于嗜热细菌的乙醇生产。
背景技术：
根据细菌的种类和环境条件，细菌的代谢可以有各种不同的机制。异养菌(包括所有病原菌)通过有机化合物的氧化获得能量，碳水化合物(尤其是葡萄糖)、脂质和蛋白质是最常见的可被氧化的化合物。这些有机化合物通过细菌的生物氧化可合成化学能源形式的ATP。该过程还可产生细菌细胞生物合成反应所需的更简单的有机化合物(前体分子)。糖酵解是细菌代谢合适底物的一般过程，它是将葡萄糖转化为丙酮酸并产生ATP的一系列反应。丙酮酸在代谢能产生过程中的转化产物因微生物和环境条件的不同而有所不同。对于丙酮酸，存在三种主要的反应。
第一种，在有氧条件下，许多微生物可通过柠檬酸循环产生能量并在丙酮酸脱氢酶(PDH)的催化下将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。
第二种，在缺氧条件下，某些产乙醇的生物进行的乙醇发酵可通过丙酮酸脱羧酶(PDC)的催化将丙酮酸脱羧产生乙醛，并随后在乙醇脱氢酶(ADH)的催化下通过NADH将乙醛还原为乙醇。
第三种过程是在乳酸脱氢酶(LDH)的催化下将丙酮酸转化为乳酸。
目前利用微生物来生产乙醇的研究已受到诸多关注，这些研究利用了可进行天然厌氧发酵的微生物或利用了含有丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因的重组微生物。尽管已经在利用这些微生物生产乙醇方面取得了一些成功，但发酵过程经常会因为乙醇浓度的增加而受到影响，特别是在微生物的乙醇耐受水平较低时更是如此。
嗜热细菌已被提议用于乙醇生产，并且使用它们的优势是可使发酵在较高的温度下进行，在50℃以上的时候乙醇就可以以蒸气的形式被移除；这也允许发酵在较高的糖浓度中进行。然而，寻找可有效产生乙醇的合适的嗜热细菌还是个难题。
WO 01/49865公开了一种用于产生乙醇的革兰氏阳性细菌，该细菌带有转化的编码丙酮酸脱羧酶的异源基因并且具有本身具有乙醇脱氢酶功能。该细菌为嗜热的杆菌(Bacillus)，并且可利用转座子的插入来使乳酸脱氢酶基因失活而对其进行修饰。WO 01/49865中公开的细菌全部衍生自杆菌属LLD-R菌株，它是一种在培养物中自发产生的菌株，具有孢子形成缺陷，它的ldh基因通过自发突变或化学诱变手段被失活。菌株LN和TN作为菌株LLD-R的改进衍生物也被公开。然而，所有菌株均具有HaeIII型限制性系统，阻止质粒转化并由此阻止未甲基化DNA内的转化。
WO 01/85966公开了通过体内甲基化过程制得的微生物，该方法克服了限制性问题。这需要将流感嗜血菌(Haemophilus aegyptius)的HaeIII甲基转移酶转化到LLD-R、LN和TN菌株中。但LLD-R、LN和TN菌株是不稳定的突变体并可自发地反转为产生乳酸的野生型菌株，尤其是在较低pH以及较高糖浓度的条件下。这样就导致了发酵产物从乙醇转变为乳酸，因此这些菌株不适于生产乙醇。
WO 02/29030中公开的菌株LLD-R及其衍生物在其ldh基因的编码区域中包含天然存在的插入元件(IE)。该元件插入ldh基因的转座(以及脱离)和随后的基因失活是不稳定的，会出现反转。针对这一现象提出的技术方案是将质粒DNA整合入IE序列中。
因此，在本领域中，生成用于生产乙醇的微生物是基于对实验室产生的化学突变杆菌微生物进行修饰，以体内甲基化方法对其进行处理并进一步将质粒DNA整合入IE序列进行微生物的修饰。该方法较复杂、不确定并且在如何使用菌株方面还存在一般性的问题。
因此需要改进用于生产乙醇的微生物。
发明内容
根据本发明的第一方面，对嗜热微生物进行修饰以增加乙醇的产量，所述修饰为将野生型嗜热微生物的乳酸脱氢酶基因失活。
根据本发明的第二方面，对微生物进行保藏，其保藏编号为NCIMB41275。
根据本发明的第三方面，一种用于生产乙醇的方法，包括在合适的条件下并在C3、C5或C6糖存在时培养根据上文定义的微生物。
根据本发明的第四方面，一种质粒在本文中被定义为pUB190-ldh(保藏编号NCIMB 41276)。
根据本发明的第五方面，嗜热微生物含有本文中定义为pUB190的质粒(图4)。
参照附图对本发明进行描述，其中 图1为显示本发明的微生物(ldh 35)以不同的底物生产乙醇的曲线图； 图2为显示本发明的微生物(ldh 58)以不同的底物生产乙醇的曲线图； 图3为显示用11955的LDH敲除性突变体生产乙醇的曲线图； 图4和5为本发明中使用的pUB质粒的图示；图4为本发明的ldh突变体； 图6为显示不同培养条件下的LDH敲除性突变体的稳定性曲线图。
具体实施例方式 本发明是基于对野生型嗜热微生物的修饰以破坏乳酸脱氢酶的表达。
乳酸脱氢酶基因的失活有助于阻止丙酮酸分解为乳酸，从而通过丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶(在合适的条件下)促进丙酮酸分解为乙醇。优选地，通过基因内缺失或者通过基因缺失来破坏乳酸脱氢酶。
野生型微生物可以是任何嗜热微生物，但优选地，该微生物为杆菌。特别地，该微生物为地芽胞杆菌(Geobacillus)，特别是为热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)。
被选择用于修饰的微生物被称为“野生型”，即它们不是实验室产生的突变体。该微生物可从期望含有嗜热生物的环境样品中分离。分离的野生型微生物能够产生乙醇，但由于没有经过修饰，乳酸可能会是主要的发酵产物。该分离的微生物的选择还依赖于在较高的温度下，它们能够在己糖和/或戊糖及其寡聚体上的生长能力。
优选地，本发明的微生物具有某些理想特征使得可在发酵过程中使用该微生物。微生物应优选地不具有限制系统，由此避免需要体内甲基化的要求。此外，该微生物应在至少3％乙醇的条件下是稳定的，并且应能够利用包括纤维二糖和淀粉等的C3、C5或C6糖(或它们的寡聚体)作为底物。优选地，微生物可以被高频率的转化。此外，微生物在连续培养中的生长速率应可满足0.3h-1以上(典型的OD600为0.3)的稀释速率。
该微生物应是嗜热微生物并可在40℃-85℃的温度范围内生长。优选地，该微生物可在50℃-70℃的温度范围内生长。另外，微生物的理想生长条件在pH7.2或以下，尤其是在pH6.9-pH4.5之间。
该微生物可以带有孢子，也可以不不带孢子。发酵过程的成功并不取决于微生物一定具有形成孢子的能力，但希望当发酵过程结束后将微生物用作动物饲料的时候，在这些情况下优选可形成孢子的微生物。这是由于当它被用作动物饲料时，孢子具有能够产生良好的免疫刺激作用的能力。能形成孢子的微生物还会在发酵过程中沉降，因此不需离心就能被分离。因此，该微生物可用于动物饲料而不需进行复杂的或昂贵的分离过程。
现在，乳酸脱氢酶的核酸序列是已知的。本领域技术人员可以利用该序列通过各种不同的机制对乳酸脱氢酶基因进行靶向以使该基因失活。优选的乳酸脱氢酶基因的失活方法是通过插入转座子，或者优选地，通过该基因序列或该基因序列的一部分的缺失。优选缺失突变，这是因为这一方式避免了该基因序列再次活化的难题，而在利用转座子失活的时候经常出现这种情况。在优选的实施方案中，通过整合温度敏感性质粒(质粒pUB190-ldh)将乳酸脱氢酶基因失活，这样可实现质粒和微生物染色体间的自然同源重组或整合。染色体整合体的筛选可以通过它们对抗菌药(例如卡那霉素)的抗性。乳酸脱氢酶基因的整合可通过单交换重组或者双(多)交换重组发生。
在优选的实施方案中，微生物包含异源乙醇脱氢酶基因和异源丙酮酸脱羧酶基因。这些异源基因的表达会产生能够重定向代谢方向的酶，并因此使乙醇成为主要发酵产物。这些基因可从通常进行厌氧发酵的微生物中获得，所述微生物包含发酵单胞菌(zymomonas)属，该属包含运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis)。
制备这些基因并将其整合到微生物的方法是已知的，例如Ingramet al，Biotech & BioEng，1998；58(2+3)204-214和US 5916787，上述每篇文献的内容均通过引用的方式纳入本文。本领域技术人员应知晓，该基因可以被引入到质粒中或者被整合到染色体中。
本发明的微生物可在常规培养条件下培养，这依据所选择的嗜热微生物而定。所选底物、温度、pH和其他生长条件可基于已知培养要求进行选择，例如参见WO 01/49865和WO 01/85966，每篇文献均通过引用的方式纳入本文。
现将在以下实施例中参照附图并仅以示例的方式对本发明进行描述。
LDH基因的失活 实施例1-单交换突变 LDH敲除载体的形成 利用HindIII和XbaI，将ldh基因的约800bp的部分片段亚克隆至温度敏感性送递载体pUB190(SEQ ID NO.1)中，得到7.7kb的质粒pUB190-ldh(图4和SEQ ID NO.2)。如下所述，质粒pUB190已被保藏至NCIMB。通过限制性分析验证了十个推定的大肠埃希氏菌(E.coli)JM109(pUB190-ldh)转化体，并使用两个培养物来生产用于转化的质粒DNA。用HindIII和XbaI消化pUB190-ldh可得到预期的ldh片段。
用pUB190-ldh转化热萄糖苷酶地芽孢杆菌11955 在54℃下，经过24-28小时卡那霉素的筛选获得所有三种测试质粒的转化体。从热萄糖苷酶地芽孢杆菌(Gt)11955纯化得到ldh转化体，并利用HindIII和XbaI通过限制性分析来验证。
LDH基因敲除 通过将温度敏感性质粒整合至染色体的ldh基因中进行基因敲除。
质粒pUB190-ldh在54℃的Gt11955中被复制，在65℃下不被复制。用卡那霉素(kan)(12μg/ml)维持筛选。然后将培养温度升至65℃(质粒不再被复制)。在质粒和染色体之间发生自然重组或整合。基于对卡那霉素的抗性对染色体整合体进行筛选。由于在质粒上有同源序列，整合只是针对ldh基因。通过已知的单交换重组过程实现了针对ldh基因的靶向整合。该质粒被整合到ldh基因中，导致ldh基因失活。如果整合了多个质粒拷贝会产生串联重复。
方法和结果 试验了两种用于整合的不同方法 方法1将4×50ml TGP(kan)培养物在54℃下培养12-18小时。离心得到细胞沉淀物，并重悬于1ml TGP中。将重悬物接种于(5×200ml)TGP(kan)平板上，并在68℃下过夜培养。挑选整合体，并将其接种于新制TGP(kan)平板的50×50的格中，于68℃过夜(o/n)培养。
方法2将1×50ml TGP(km)培养物在54℃培养12-18小时。用1ml培养物接种50ml新制TGP(kan)培养物，并在68℃培养12-18小时。第二天在50ml新制TGP(kan)培养物中传代，并在68℃再培养12-18小时。将该培养物接种于TGP(km)平板上，并于68℃过夜培养。在平板上获得汇合生长物。将各单一菌落接种于新制TGP(kan)平板的50×50格中，并于68℃过夜培养。
筛选 针对ldh基因的敲除，采用以下方法筛选推定的整合物 1)平板筛选 将数百个整合体重复接种至在68℃的SAM2平板(含kan)上。乳酸阴性细胞产出的酸较少，因而可以在无缓冲液的发酵培养基上具有比野生型更强的生长优势。
2)PCR筛选 采用菌落PCR来确定质粒是否已被整合至ldh基因中。通过选择位于整合位点侧翼的引物，可确定是否发生了ldh基因整合(插入后无扩增的PCR片段)。
3)乳酸分析 该分析法确定整合体在SAM2(kan)中68℃过夜培养时是否产生乳酸。使用用于测定乳酸的Sigma乳酸试剂测定培养上清液的乳酸浓度。对乳酸阴性整合体再使用PCR进行鉴定，并在发酵罐中评估其稳定性。
热葡糖苷酶地芽孢杆菌NCIMB 11955的电穿孔法 NCIMB 11955冷冻原种的制备在TGP培养基中过夜培养NCIMB11955(在55℃250rpm，250ml的锥形瓶中50ml培养液，OD600)，加入等体积的20％甘油，并分成1ml的等份，装于冷冻管中置于-80℃下贮存。将1ml该原种接种至250ml锥形瓶中的50ml TGP中，以250rpm在55℃下培养，直至培养物OD600到达1.4。
使锥形瓶在冰上冷却10分钟，然后将培养物在4℃4000rpm离心20分钟。将沉淀物重悬于50ml冰冷的电穿孔培养基中，并4000rpm离心20分钟。再经过三次(1×25ml和2×10ml)洗涤，然后将沉淀物重悬于1.5ml冰冷的电穿孔培养基中并分成60μl的等份。
为进行电穿孔，在置于冰上的EP管中的60μl电感受态细胞中加入1-2μl DNA，并轻轻搅拌。将该悬液转移至预冷的电穿孔杯(1mm间距)中，并且在2500V、10μF电容、600Ω电阻下进行电穿孔。
电脉冲后立即加入1ml TGP，混合并将悬液转移至螺旋盖小管中，在52℃振摇水浴中培养1小时。培养后，将悬液直接接种(例如2×0.5ml)于含合适抗生素的TGP琼脂上，或者4000rpm离心20分钟并且将沉淀物重悬于200μl-500μl TGP中后涂布。
电穿孔培养基 TGP养基 0.5M山梨糖醇 胰蛋白胨17g/L 0.5M甘露醇 大豆蛋白胨3g/L 10％甘油 K2HPO4 2.5g/LNaCl 5g/LpH至7.3高压灭菌后加入丙酮酸钠4g/l甘油4ml/L LDH基因的失活 双交换突变 基于可获得的11955 LDH序列设计引物。敲除策略是基于通过两种方法在LDH基因中产生内部缺失。
在方法1中，利用LDH编码序列中部附近存在的两个特异的限制性位点被改变以产生缺失。从基因组DNA产生的单一的大pcr产物包含大部分的LDH序列，被克隆到pUC19的多克隆位点的SmaI位点中。然后该pUC19克隆被BstEII和BsrGI相继消化，并在Klenow消化后被重新连接，从而在LDH基因的BstEII和BsrGI之间产生内部缺失。
在方法2(参见实施例2)中，该LDH基因作为2个PCR产物被克隆，在寡聚引物中引入NotI位点使2个PCR产物在pUC19中被连接在一起，并在LDH序列中部产生缺失。该具有内部缺失的两个LDH基因被亚克隆至芽孢杆菌的三种送递系统中。
通过电穿孔将送递载体转化至11955中。
遗传学方法信息开发用于同源重组的送递系统。
为产生敲除体，需要一个有效的系统来将突变的基因送递至靶器官，并筛选出通过与靶“野生型”基因的同源重组而与基因组进行的整合。在理论上，这可通过将DNA引入携带革兰氏阳性选择性标记但不含革兰氏阳性复制子的大肠埃希氏菌载体来实现。这需要一个高的转化效率。μ为芽孢杆菌11955开发的电穿孔方法应用在pNW33N上，每1μg的DNA可产生3×104个转化子。革兰氏阳性复制子来源于BGSC目录中的pBC1和序列数据库中的pTHT15。
pNW33N上的cat基因被用于大肠埃希氏菌和芽胞杆菌中的筛选。pNW33N的温度敏感型突变体是通过使质粒在Statagene XL1r ed突变菌株中传代而产生的。
实施例2 通过基因置换产生LDH突变体 另一种方法被设计通过基因置换在热葡糖苷酶地芽孢杆菌NCIMB11955中产生LDH基因的稳定突变。该方法包括在编码序列中部附近形成42bp的缺失，并在该位点插入7bp碱基，引入一个新的NotI限制性位点。该插入的序列的目的是引起下游的移码突变。
该方法包括利用引入新的NotI位点的寡聚引物的2个PCR片段产生缺失。引物设计是基于11955的LDH编码区域的部分序列。下面示出所用的引物序列。
片段1 引物1(正向)
TCCCTTATGAACCAAGGAATAGCA(SEQ ID NO.3；阴影部分序列表示为产生新的EcoRI位点而引入的碱基) 引物2(反向)
ACCCGCTCTTTCGGTAACCCGCT(SEQ ID NO.4；阴影部分序列表示为产生新的NotI位点而引入的碱基) 引物3(正向)
GCTTGCTAAGTGAATATTTTCAAGT(SEQ ID NO.5；阴影部分序列表示为产生新的NotI位点而引入的碱基) 引物4(反向)
AGCGTCAATTCCATCACTTCACGA(SEQ ID NO.6；阴影部分序列表示为产生新的PstI位点而引入的碱基)基因组DNA的制备。
基因组DNA从11955中制备，作为PCR的模板。TGP培养基、52℃过夜培养的20ml 11955培养物在4000rpm下离心20分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于5ml含0.3M蔗糖、25mM Tris HCl和25mM EDTA，pH为8.0，并含有2.5mg溶菌酶和50μl的1mg/ml核糖核酸酶A的STE缓冲液中。在30℃培养1小时，然后加入5mg蛋白酶K和50μl 10％SDS，然后在37℃培养1小时。该培养物裂解液随后用等体积的苯酚/氯仿和氯仿依次提取，然后用异丙醇沉淀。用冰冷的70％乙醇洗涤两次后，将DNA沉淀物重新溶解于0.5ml TE缓冲液中。
LDH缺失构建体的形成 使用Robercycler Gradient 96(Stratagene)进行PCR，反应条件如下循环1；在95℃变性5分钟，在47℃退火1分钟，在72℃延伸2分钟，2-30个循环；在95℃变性1分钟，在47℃退火1分钟，在延伸2分钟，再在72℃孵育5分钟。所用酶为Pfu聚合酶(Promega)和Taq聚合酶(New England Biolabs，NEB)的等比混合物。缓冲剂和dNTP的组成和浓度依照供应商为Pfu的推荐。以NCIMB 11955的基因组DNA为模板获得的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化，并用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶上洗脱。纯化的PCR产物与预先用SmaI消化的pUC19(New England Biolabs)连接，并且连接的混合物被用于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DH10B(Invitrogen)的转化。挑选青霉素抗性克隆，其包含的质粒通过限制性分析被分离和鉴定，并确定插入的方向。
pUC19(在距pUC19的多克隆位点(mcs)的PstI位点最近的引物4上被引入新的PstI位点)中插入片段2的质粒(pTM002)被NotI和PstI消化。所得的片段(约0.4kb)被连接到含有片段1(在距pUC19的mcs的EcoRI位点最近的引物1上引入了新的EcoRI位点)的pUC19质粒(pTM001)上，用NotI和PstI消化使质粒线性化。连接的混合物用于转化大肠埃希氏菌DH10B。挑选具有青霉素抗性菌落，其包含的质粒用限制性分析被分离和鉴定。通过利用M13mp18反向和正向引物的测序鉴定和验证具有需要的构造(该LDH编码区域含有缺失并被引入NotI位点)的期望限制性模式的质粒(pTM003)。
突变的LDH基因通过HindIII和EcoRI的消化从pTM0003上被切下来，并通过琼脂糖凝胶电泳被纯化，然后用QIA快速凝胶提取试剂盒(作为约0.8kb的片段)从凝胶上被洗脱。该片段被Klenow聚合酶处理(NEB，按照生产商的说明书)产生平端，并被引入pUB190载体中。这种引入可通过与pUB190进行平端连接实现，该pUB190通过Xbal的消化线性化，并根据上述进行Klenow处理和接着的凝胶纯化。该连接混合物用于转化大肠埃希氏菌SCS110(Stratagene)。挑选青霉素抗性菌落，其包含的质粒通过限制性分析被分离和鉴定。具有需要构造的期望限制性模式的质粒(pTM014)被鉴定，并被应用到利用实施例1中限定电穿孔方法的NCIMB 11955电穿孔转化中。
通过双交换产生并鉴定LDH的基因置换突变体 以此种方式(株TM15)获得推定的pTM014的原代整合体被应用于获得双重组体(基因置换)。这是通过在不含卡那霉素的TGP培养基中对TM15进行一系列传代培养来实现的。采用5次连续振摇培养，条件在54℃8小时至52℃16小时之间变化，每50ml的管(Falcon)中有5ml TGP，转速为250rpm，每次传代转移1％。上述5次传代后，所得培养物用TGP连续稀释，并且将100μl样品接种至TGP琼脂平板上，54℃下培养。将所得菌落重复接种至含有12μg/ml卡那霉素的TGP琼脂上，以鉴定卡那霉素敏感性菌落。在琼脂上划线接种得到纯化的单一菌落后，检测这些卡那霉素敏感性衍生物是否产生乳酸，正如所料，证实其为LDH+和LDH-的混合物。将一种LDH-衍生物TM89进一步用PCR和Southern印迹进行鉴定。
用TM15(原代整合体)和TM89(推定的双重组体LDH-)制备基因组DNA，并作为引物1和4的PCR中的模板，使用条件如上所述。11955的基因组DNA被作为对照。该PCR产物(从所有3个模板中都得到大约0.8kb条带)用凝胶电泳纯化，并用QIA快速凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶上洗脱。样品用NotI消化，并且在0.7％的琼脂糖凝胶上进行电泳以显示产物。11955的PCR产物正如预计地显示出没有NotI消化，而TM89的PCR产物在大约0.4kb的位置有2个条带，表明野生型基因与突变的等位基因发生了置换。原代整合体TM15的PCR产物的NotI消化有2个与TM89相同的主要条带，并有微量的未切割条带(0.8kb)。这一点可通过从TM15基因组DNA的Southern印迹中获得的结果来解释。
用NotI，PstI和NotI，以及HindIII和NotI消化11955、TM15和TM89的基因组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳。按照生产商的说明书(罗氏(Roche)分子生物化学DIG应用手册)，该DNA被转移至带正电荷的尼龙膜(Roche)上，并与DIG标记的探针杂交，该探针是利用引物1和4以及DIG标记的dNTP对11955的LDH基因进行PCR产生。用提供的检测试剂盒(Roche)显示杂交条带。Southern印迹表明TM15的NotI消化物中存在约7.5kb的大量扩增条带，在TM15的HindIII/NotI和PstI/NotI的消化物中存在约7kb和0.4kb的类似扩增条带，这表明在该原代整合体的LDH基因座上整合的pTM014被以多串联拷贝的形式被整合。进行所有三种限制性消化，TM89显示出具有不同的限制性图模式，比11955多出一条杂交带，这与基因置换是相符的。如下文所述，TM89已保藏于NCIMB，编号为41275。
实施例3 用野生型嗜热生物生产乙醇 野生型嗜热生物的补料分批培养和连续培养实现了增殖性生长和产物生成。表1、2和3示出了发酵过程中使用的条件。
表1 表2 微量元素硫酸盐储液 表3 发酵罐条件 表4
实施例4 通过嗜热生物增加乙醇产量 为了从嗜热生物的乙醇获得目标产量和生产率，通过ldh基因的失活敲除L-乳酸脱氢酶(LDH)活性以使乳酸的产生量最小化。使ldh基因失活的方法有两种标记DNA与染色体的ldh区域进行单交换重组从而阻止转录，或者DNA的同源区域与ldh基因进行双重组以在基因区域内形成突变，从而使其失去功能。
与野生型菌株(NCIMB 11955)相比，单交换方法快速产生LDH阴性突变体显示出乙醇产量的增加。
通过LDH突变体改进乙醇产量 LDH阴性突变体在补料分批培养中培养，使用常规的基本培养基以测量LDH活性去除所导致的乙醇产量的增加。LDH突变体的代谢物状况变化示于表5，并与野生型菌株的最优乙醇产量进行对比。两种LDH突变体的代谢物产量曲线示于图1和2。表6显示了由LDH活性的去除所致的乙醇产量的增加。
表5
表6
LDH突变体产出的乙醇产量明显高于野生型嗜热生物，表明这些嗜热生物的代谢路径被成功地改变。进一步的优化LDH突变株的培养条件和培养基成分进行将使乙醇产量增加。
在连续培养物中用LDH突变体生产乙醇 将最稳定的单交换乳酸突变体在连续培养物中生长以评估其作为乙醇生产菌株的长程的稳定性。该菌株在基本培养基中培养，以葡萄糖为碳源。稳定状态的培养物在约290小时内被观察到，之后出现乳酸产量的反转。
实施例5 根据如实施例4中的设计，评估双交换突变体TM89(实施例2)的乙醇产量。该结果在表8中显示，并且表明该突变体的乙醇产量达到了显著高的水平(大于200mM)。该突变体也被以葡萄糖或木糖为碳源评估其乙醇产量。其结果示于表7。
表7
葡萄糖被显示是最好的碳源，但该结果清楚地表明这些生物不经进一步修饰的情况下也能发酵木糖。
乳酸脱氢酶阴性突变体的稳定性也通过各种条件下的1500小时的连续培养物被检测。结果在表6中显示，并且表明虽然培养物经受了很大的压力，但是乳酸脱氢酶阴性表型保持稳定，并且这种稳定性并不依赖于抗生素的筛选。在此连续过程中，稀释速率为0.1hr-1至0.5hr-1，并且培养物从有氧(通空气)条件转变为无氧(通N2)条件不影响乳酸的浓度。更为显著的是，培养物的pH发生变化并降至pH4.4，该值在该野生型微生物生长的正常pH范围之外。然而，培养物迅速恢复，无表型变化，即乳酸浓度无变化。
本文中定义为TM89的微生物和质粒pUB190-ldh已被提交NCIMB保藏，NCIMB的编号分别是41275和41276。保藏单位为NCIMB Ltd，Ferguson Bulding，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，AB219YA，United Kingdom。
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权利要求
1.一种嗜热微生物，对所述嗜热微生物进行修饰以使其产生的乙醇的产量增加，其中所述修饰为将野生型嗜热微生物的乳酸脱氢酶基因失活。
2.根据权利要求1的微生物，其中所述微生物不含限制性系统。
3.根据权利要求1或权利要求2的微生物，其中所述微生物为地芽孢杆菌属(Geobacillus)的种。
4.根据前述任一项权利要求的微生物，其中所述微生物为热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus Thermoglucosidasius)。
5.根据前述任一项权利要求的微生物，其中所述微生物为形成孢子的微生物。
6.根据前述任一项权利要求的微生物，其中所述微生物在含有最多达30％(w/v)乙醇的培养基中是稳定的。
7.根据前述任一项权利要求的微生物，其中所述微生物可代谢纤维二糖和/或淀粉，或者它们的寡聚物。
8.根据前述任一项权利要求的微生物，其中所述微生物可以以高频被转化。
9.根据前述任一项权利要求的微生物，其中所述微生物在40℃-85℃的温度下生长，优选在50℃-70℃的温度下生长。
10.根据前述任一项权利要求的微生物，其中所述微生物包含非天然的pdc基因。
11.根据前述任一项权利要求的微生物，其中所述微生物包含非天然的adh基因。
12.根据前述任一项权利要求的微生物，其中所述天然的乳酸脱氢酶基因或其一部分被缺失。
13.根据前述任一项权利要求的微生物，其中所述微生物的乳酸脱氢酶基因中不含整合元件。
14.一种以编号为NCIMB 41275保藏的微生物。
15.一种用于生产乙醇的方法，包括在C3、C5或C6糖或它们的寡聚物存在时，在合适的条件下培养前述任一项权利要求的微生物。
16.根据权利要求15的方法，其中所述方法在40℃-70℃的温度下被实施。
17.根据权利要求16的方法，其中所述温度为52℃-65℃。
18.根据权利要求15-17任一项的方法，其中所述微生物在pH为4-7.5的培养物中培养。
19.本文定义为pUB 190-1dh的质粒。
20.一种嗜热微生物，包含权利要求19的质粒。
21.一种动物饲料，包含根据权利要求1-14任一项的微生物。
全文摘要
对一种野生型微生物进行修饰以使其乳酸脱氢酶失活从而制备一种突变的嗜热微生物。所述突变的微生物用于以C3、C5或C6糖为底物的乙醇生产。
文档编号C12N9/04GK101203602SQ200680015299
公开日2008年6月18日 申请日期2006年5月3日 优先权日2005年5月4日
发明者A·阿特金森, R·克里普斯, K·埃利, B·拉德, M·托德, A·汤普森 申请人:Tmo可再生能源有限公司