硫酸腺苷基转移酶基因及其用途的制作方法

专利名称：硫酸腺苷基转移酶基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及硫酸腺苷基转移酶(sulfate adenyltransferase)基因及其用 途，特别是涉及制造香味稳定性优异的酒精饮料的酿造酵母、用该酵母制 造的酒精饮料、以及制造所述饮料方法等。更具体而言，本发明涉及通过 控制酿造酵母的硫酸腺苷基转移酶Met3p的编码基因MET3、特别是啤酒 酵母的特征性nonScMET3基因的表达量来控制有助于产品香味稳定化的亚 硫酸盐的生成能力的酵母，使用该酵母的酒精饮料制造方法等。
背景技术：
已知亚硫酸盐是抗氧化作用强的化合物，作为抗氧剂在食品、饮料、 医药品等领域被广泛使用[例如日本特开平06-040907号公报(专利文献1)、 日本特开2000-093096号公报(专利文献2)等]。在酒精饮料中，亚硫酸 盐也被作为抗氧剂利用，例如，在必需长期陈酿的葡萄酒中，因在其品质 保持上发挥重要作用，所以日本国内经厚生劳动省批准，允许添加到残留 浓度350ppm以下。而且，还已知在啤酒酿造中保质期随产品中含有的亚硫 酸盐浓度而变化，强化该物质对香味稳定性等方面非常重要。使产品中的亚硫酸盐含量增大的最简单的方法是添加亚硫酸盐，但这 种情况需作为食品添加剂处理，在商品开发的自由度、消费者对食品添加 剂的不良印象等方面均成为问题。但是，酵母能生物合成自身生命活动所必须的含硫化合物，亚硫酸盐作为其中间代谢产物而被生成。g卩，通过利用酵母的这种能力，无需从外 部添加即可使产品中的亚硫酸盐量增加。作为在酿造工序中提高发酵液中的亚硫酸盐浓度的方法，包括1)过 程控制法和2)酵母育种法。过程控制法，是指由于酿造中亚硫酸盐的生成与初期供氧量成反比，所以降低向发酵液的供氧量，使亚硫酸盐的生成量 增加的同时抑制其氧化的方法。另一方面，酵母育种法利用基因操作技术。在酵母的硫代谢中，亚硫 酸盐是含硫氨基酸和含硫维生素生物合成的中间体，从细胞外摄取的硫酸根离子经三步反应被还原后生成亚硫酸盐。这里，MET3基因是编码催化第 1反应的酶的基因，MET14基因是编码催化第2反应的酶的基因。Korch 等进行了通过增加上述两个基因的表达量来提高酵母的亚硫酸盐生成能力 的尝试，证实MET14更有效(C. Korch et al.， Proc. Eur. Brew. Conv. Conger., Lisbon, 201-208，1991:非专利文献1)。此时使用的MET3基因是从葡萄酒酵 母中分离的基因，但得到的结果是实际啤酒产品中含有的亚硫酸盐浓度的 十分之一左右(约0.8ppm)。另外，Hansen等进行了如下尝试通过破坏 编码亚硫酸盐根离子还原酶的MET10基因，防止生成的亚硫酸盐根离子还 原，以增加亚硫酸盐生成量a.Hansenetal.， Nature Biotech., 1587-1591,1996: 非专利文献2)。另外，藤村等进行了如下尝试通过提高酵母的编码亚硫酸盐根离子 排出泵的SSU1基因中特别是啤酒酵母特有的nonScSSUl基因的表达量， 以促进菌体内生成的亚硫酸盐向菌体外排出，使啤酒中的亚硫酸盐浓度增 加(藤村等，2003年度日本农艺化学会年度大会要旨集，159， 2003:非专 利文献3。日语原名「藤村b、2003年度日本農芸化学会年次大会要旨集、 159、 2003」)。[非专利文献1] C. Korch et al.， Proc. Eur. Brew. Conv. Conger" Lisbon, 201-208， 1991[非专利文献2] Donalies and Stahl，Yeast， 19,475-484,2002[非专利文献3]藤村等，2003年度日本农艺化学会年度大会要旨集， 159， 2003。日语原名「藤村b、 2003年度日本農芸化学会年次大会要旨 集、159、 2003」。[专利文献1]日本特开平06-040907号公报[专利文献2]日本特开2000-093096号公报发明内容然而，需要能提高酵母产生的亚硫酸盐的量从而使通过酵母生产的酒 精饮料的保质期和香味稳定性优异的新方法和材料。如上所述，使产品中 的亚硫酸盐含量增大的最简单的方法是添加非酵母生产的亚硫酸盐，但近 年来，消费者更热衷于无食品添加和使用天然材料，希望最低限度地使用 食品添加剂。因此，希望利用酵母自身的生命活动，不从外部添加亚硫酸 盐即可达到对香味稳定性有效的亚硫酸盐浓度。但是，上述过程控制法由 于氧不足导致酵母的增殖速度下降，有时引起发酵延迟、品质下降，因此 并不实用。另外，据报道，利用基因操作技术的酵母育种得到了达到亲株10倍以 上的亚硫酸盐浓度的结果(J. Hansen et al., Nature Biotech., 1587-1591,1996)，但另一方面，也出现了发酵延迟、不受欢迎的香味成分 即乙醛及l一丙醇增加，作为实用酵母还存在问题。由此，期望能有既不影 响发酵速度和产品质量又能生产充分量的亚硫酸盐的酵母的育种方法。本发明者为了解决上述课题不断潜心研究，结果从啤酒酵母中成功地 鉴定并分离出编码比已知蛋白质更有效的硫酸腺苷基转移酶的基因。且通 过将所得基因导入酵母并使其表达而制备了转化酵母，确认了亚硫酸盐生 成量的增加，从而完成了本发明。艮口，本发明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型硫酸腺苷基转移酶基因、 该基因编码的蛋白质、该基因的表达得到调节的转化酵母、通过使用该基 因的表达得到调节的酵母来控制产品中的亚硫酸盐生成量的方法等。具体 而言，本发明提供如下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了 该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒精饮料的制造方法等。(1)多核苷酸，其是选自下述(a) (f)构成的组的多核苷酸，(a) 多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸；(b) 多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的 多核苷酸；(c) 多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列经过1个或多个 氨基酸缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列组成，且具有硫酸腺苷 基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；(d) 多核苷酸，其含有编码具有与序列号2的氨基酸序列60%以上同 一性的氨基酸序列，且具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；(e) 多核苷酸，其含有与由序列号l的核苷酸序列的互补核苷酸序列 组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有硫酸腺苷基转移酶活性的 蛋白质的多核苷酸；以及(f) 多核苷酸，其含有与编码由序列号2的氮基酸序列组成的蛋白质 的多核苷酸的核苷酸序列的互补核苷酸序列所组成的多核苷酸在严谨条件 下杂交，且编码具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸。(2) 上述(1)所述的多核苷酸，其是选自下述(g) (i)构成的组 的多核苷酸，(g) 多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列或序列号2的氨基酸 序列经过1 10个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列组成 且具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质；(h) 多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列90%以上同一性 的氨基酸序列，且具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质；以及(0多核苷酸，其与序列号1的核苷酸序列或与序列号1的核苷酸序 列的互补核苷酸序列在高严谨条件下杂交，且编码具有硫酸腺苷基转移酶 活性的蛋白质。(3) 上述(1)所述的多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列组 成的多核苷酸。(4) 上述(1)所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序 列组成的蛋白质的多核苷酸。(5) 上述(1) (4)任一项所述的多核苷酸，其是DNA。(6) 多核苷酸，其是选自下述(j) (m)构成的组的多核苷酸， (j)多核苷酸，其编码具有与上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的核苷酸序列的RNA;(k)多核苷酸，其编码通过RNAi作用抑制上述(5)所述的多核苷酸 (DNA)表达的RNA;(I) 多核苷酸，其编码具有特异性切割上述(5)所述的多核苷酸(DNA) 的转录产物的活性的RNA;以及(m)多核苷酸，其编码通过共抑制作用抑制上述(5)所述的多核苷 酸(DNA)表达的RNA。(7) 蛋白质，其是由上述(1) (5)任一项所述的多核苷酸编码的 蛋白质。(8) 载体，其是含有上述(1) (5)任一项所述的多核苷酸的载体。 (8a)上述(8)所述的载体，其含有包含以下(x) (z)的构成要素的表达盒(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)与该启动子以正向或反向连接的上述(1) (5)任一项所述的 多核苷酸；以及(z)与RNA分子的转录终止以及多聚腺苷化作用有关的在酵母起作 用的信号。(9) 载体，其是含有上述(6)所述的多核苷酸的载体。(10) 酵母，其是导入了上述(8)或(9)所述的载体的酵母。(II) 上述(10)所述的酵母，其通过导入上述(8)所述的载体，增 强亚硫酸盐生成能力。(12) 酵母，其通过导入上述(9)所述的载体，或通过破坏与上述(5) 所述的多核苷酸(DNA)相关的基因，抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA) 的表达。(13) 上述(10)所述的酵母，其通过增加上述(7)所述的蛋白质的 表达量，提高亚硫酸盐生成能力。(14) 酒精饮料制造方法，其使用上述(10) (13)任一项所述的酵母。(15) 上述(14)所述的酒精饮料制造方法，其酿造的酒精饮料是麦 芽饮料。(16) 上述(14)所述的酒精饮料制造方法，其酿造的酒精饮料是葡萄酒。(17) 酒精饮料，其是用上述(14) (16)任一项所述的方法制造 的酒精饮料。(18) 评价方法，其用根据具有序列号1的核苷酸序列的硫酸腺苷基 转移酶基因的核苷酸序列设计的引物或探针，评价被测酵母的亚硫酸盐生 成能力。(18a)通过上述(18)所述的方法来筛选亚硫酸盐生成能力高或低的 酵母的方法。(18b)用通过上述(18a)所述的方法筛选的酵母来制造酒精饮料(例 如啤酒)的方法。(19) 评价方法，其通过培养被测酵母，测定具有序列号1的核苷酸 序列的硫酸腺苷基转移酶基因的表达量，来评价被测酵母的亚硫酸盐生成 能力。(19a)选择亚硫酸盐生成能力强的酵母的方法，其用上述(19)所述 的方法，评价被测酵母，选择硫酸腺苷基转移酶基因的表达量高的酵母。(1%)用通过上述(19a)所述的方法选择的酵母来制造酒精饮料(例 如啤酒)的方法。(20) 酵母的选择方法，其包括培养被测酵母；对上述(7)所述的 蛋白质进行定量或测定具有序列号1的核苷酸序列的硫酸腺苷基转移酶基 因的表达量；以及选择具有与目的亚硫酸盐生成能力相应的上述蛋白质的 量或上述基因表达量的被测酵母。(21) 上述(20)所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和 被测酵母；测定具有序列号1的核苷酸序列的硫酸腺苷基转移酶基因在各 酵母中的表达量；以及选择其中该基因的表达高于或低于标准酵母的被测 酵母。(22) 上述(20)所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和 被测酵母；对各酵母中上述(7)所述的蛋白质进行定量；以及选择与标准 酵母相比该蛋白质的量增多或减少的被测酵母。(23) 酒精饮料制造方法，其包括用上述(10) (13)任一项所 述的酵母或通过上述(20) (22)任一项所述的方法选择的酵母中的任 一酵母进行以酒精饮料制造为目的的发酵，并调节亚硫酸盐的生成量。根据使用本发明的具有可操作地连接到载体上的硫酸腺苷基转移酶多 核苷酸的转化酵母的酒精饮料的制造方法，能增加产品中具有抗氧化作用 的亚硫酸盐含量，因而能够制造出香味稳定性优异、保质期更长的酒精饮 料。


图1表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化。横坐标表示发酵时 间，纵坐标表示OD660值(660nm时的光密度)。图2表示啤酒酿造试验中糖消耗量的经时变化。横坐标表示发酵时间， 纵坐标表示浸出物表观浓度(w/w%)。图3表示啤酒酿造试验中酵母中的nonScMET3基因的表达行为。横坐 标表示发酵时间，纵坐标表示检测到的信号辉度。图4表示使用nonScMET3高表达株的酿造试验中酵母增殖量的经时变 化。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示0D660值。图5表示使用nonScMET3高表达株的啤酒酿造试验中糖消耗量的经时 变化。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示浸出物表观浓度(w/w%)。图6表示使用nonScMET3高表达株的啤酒酿造试验结束时醪液中的亚 硫酸盐浓度。
具体实施方式
已知的使亚硫酸盐根离子排出泵的表达量增加的方法，由于菌体内不 积累剩余的亚硫酸盐，因而能保持良好的发酵速度，但菌体内亚硫酸盐的生物合成反应可能成为限速步骤。因此认为通过强化作为起始物质的硫酸 根离子向亚硫酸盐的还原途径，可以更高效地生成亚硫酸盐。本发明者基于这种构想不断研究，根据用日本特开2004-283169中公开的方法解读的啤 酒酵母基因组信息，分离并鉴定出啤酒酵母特有的编码硫酸腺苷基转移酶 的nonScMET3基因。该核苷酸序列如序列号1所示。另外，由该基因编码 的蛋白质的氨基酸序列如序列号2所示。 l.本发明的多核苷酸首先，本发明提供(a)多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列组成 的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成 的蛋白质的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA或RNA。作为本发明对象的多核苷酸，不限于来自上述啤酒酵母的编码具有硫酸腺苷基转移酶活性基因的多核苷酸，还包含编码与该蛋白质具有同等功 能的蛋白质的其他多核苷酸。作为功能同等的蛋白质，例如，可列举(c)由 序列号2的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸缺失、取代、插入和/或添 加后的氨基酸序列组成且具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质。此种蛋白质可包括由序列号2的氨基酸序列经过例如1 100个、l 90个、1 80个、1 70个、1 60个、卜50个、1 40个、1 39个、l 38个、1 37个、1 36个、1 35个、1 34个、1 33个、1 32个、l 31个、卜30个、1 29个、卜28个、卜27个、1 26个、1 25个、l 24个、1 23个、1 22个、1 21个、卜20个、1 19个、1 18个、l 17个、1 16个、1 15个、卜14个、1 13个、1 12个、1 11个、l 10个、1 9个、1 8个、1 7个、1 6个(1 数个氨基酸)、1 5个、 1 4个、1 3个、1 2个、l个氨基酸残基缺失、取代、插入和/或添加的 氨基酸序列组成且具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质。上述氨基酸残基 的缺失、取代、插入和/或添加的数量， 一般越小越好。另外，此种蛋白 质可包括(d)具有与序列号2的氨基酸序列有约60%以上、约70%以上、71% 以上、72%以上、73%以上、74°/。以上、75%以上、76%以上、77%以上、 78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82°/。以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、 92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、 99°/。以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、 99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上同一性的氨基酸序列且具 有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质。上述同源性的数值一般越大越好关于硫酸腺苷基转移酶活性，例如可通过Klonus等的方法(PlantJ. 1994 Jul; 6(1): 105-12.)来测定。另外，本发明也包含(e)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷 酸在严谨条件下，与序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核 苷酸杂交，且编码具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；以及(f) 多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸在严谨条件下，与编码序列 号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列的互补核苷酸序 列组成的多核苷酸杂交，且编码具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质的多 核苷酸。这里，"在严谨条件下杂交的多核苷酸"，指以序列号1的核苷酸序列的 互补核苷酸序列组成的多核苷酸或编码序列号2的氨基酸序列的DNA的全 部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交 法等得到的多核苷酸，例如DNA。杂交的方法，可以利用例如Molecular Cloning 3rd Ed. 、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997等中记载的方法。本说明书中所述的"严谨条件"可以是低严谨条件、中严谨条件以及高严 谨条件中的任一种。"低严谨条件"，例如为5xSSC、 5xDenhardt溶液、0.5% SDS、 50%甲酰胺、32"C的条件。"中严谨条件"，例如为5xSSC、 5xDenhardt 溶液、0.5%SDS、 50%甲酰胺、42"C的条件。"高严谨条件"，例如为5xSSC、 5xDenhardt溶液、0.5% SDS、 50°/。甲酰胺、5(TC的条件。上述条件中，温 度越高，越能高效地获得具有高同源性的多核苷酸，例如DNA。但是，影 响杂交严谨性的因素有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐 浓度等多种因素，本领域技术人员可通过适当选择这些因素来实现同样的严谨性。另外，在杂交中使用市售的试剂盒时，例如可使用Alkphos Direct Labelling Reagents [安玛西亚法玛西亚(Amersham Pharmacia)公司帝U]。此 时，根据试剂盒中附带的操作方法，与己标记的探针一同保温过夜后，将 膜在55'C的条件下用含有0.1%(w/v)SDS的1次洗涤缓冲液洗涤后，可检测 出杂交后的DNA。其他可杂交的DNA，可为通过例如FASTA、 BLAST等同源性检索软 件，使用默认参数计算时，与编码序列号2的氨基酸序列的DNA有60%以 上、70%以上、71%以上、72°/。以上、73%以上、74%以上、75%以上、76% 以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、 83%以上、84%以上、85%以上、86°/。以上、87%以上、88°/。以上、89%以上、 卯％以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、 97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4% 以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上同一 性的多核苷酸。另外，关于氨基酸序列、核苷酸序列的同一性，可使用根据Karlin及 Altschul的BLAST算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268， 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90 : 5873, 1993)来确定。开发了基于BLAST算法的被 称为BLASTN、 BLASTX的程序(Altschul SF, et ah J Mol Biol 215: 403， 1990)。用BLASTN分析核苷酸序列时，参数例如为score=100、 wordlength =12。另外，用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score=50、 wordlength=3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认 参数。此外，本发明的多核苷酸包含(j)多核苷酸，其编码具有与上述(5)所 述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的核苷酸序列的RNA; (k)多核苷酸， 其编码通过RNAi作用抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA; ①多核苷酸，其编码具有特异性切割上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的 转录产物的活性的RNA;以及(m)多核苷酸，其编码通过共抑制作用抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA。这些多核苷酸被整合进载 体，进而可在导入了该载体的转化细胞中抑制上述(a) (i)的多核苷酸 (DNA)的表达。因此，在希望抑制上述DNA表达的情况下优选利用。本说明书中，"编码具有与DNA的转录产物互补的核苷酸序列的RNA 的多核苷酸"，指所谓的反义DNA。反义技术作为抑制特定内源性基因的表 达的方法而公知，在各种文献中均有记载[例如，参照平岛及井上新生化 学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达(日本生化学会编，东京化学同 人)pp.319-347,1993等。日语原文「平島招上tJ^井上新生化学実験講座 2 核酸IV遺伝子(Z)複製h発現(日本生化学会編，東京化学同人)」]。反 义DNA的序列，优选为与内源性基因或其一部分互补的序列，但只要能有 效地抑制基因的表达，也可以不完全互补。转录的RNA相对于靶基因的转 录产物优选具有90%以上、进一步优选具有95%以上的互补性。反义DNA 的长度至少为15个碱基以上，优选为100个碱基以上，进一步优选为500 个碱基以上。本说明书中，"编码通过RNAi作用抑制DNA表达的RNA的多核苷酸"， 指用于通过RNA干扰(RNAi)抑制内源性基因表达的多核苷酸。"RNAi" 指将具有与靶基因序列同一或类似序列的双链RNA导入细胞内，导入的外 源基因及内源性耙基因的表达均受到抑制的现象。这里使用的RNA，包括 例如21 25个碱基长的产生RNA干涉的双链RNA，例如，dsRNA (双链 RNA)、 siRNA(小干扰RNA)或shRNA(短发卡RNA)。此种RNA可通过脂 质体等运载系统运载至所需位点局部，也可以使用生成上述双链RNA的载 体使其局部表达。此种双链RNA(dsRNA、 siRNA或shRNA)的制备方法、 使用方法等已在许多文献中公开(参照日本特表2002-516062号公报；美国 公开专利第2002/086356A号；Nature Genetics，24(2),180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4)， 240-244, 2000 April; Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.l6,(8)，948國958，2002 Apr. 15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 99(8)， 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553， 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9， 6047-6052, 2002 Apr. 30; NatureBiotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res" 30:10, e46,2002 May 15等)。本说明书中，"编码具有特异性切割DNA转录产物的活性的RNA的多 核苷酸"一般指核酶。核酶是指具有催化活性的RNA分子，通过切割靶DNA 的转录产物，抑制该基因的功能。关于核酶的设计，可参照各种公知文献 (例如参照FEBS Lett. 228: 228， 1988; FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059， 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271， 1992等)。另外，"编码通过共抑制作用抑制DNA表达的RNA的多核苷酸"， 指通过"共抑制"抑制靶DNA的功能的核苷酸。本说明书中，"共抑制"是指通过在细胞中由转化导入具有与内源性靶基 因同一或类似序列的基因，从而使导入的外源基因及内源性耙基因的表达 均受到抑制的现象。关于具有共抑制作用的多核苷酸的设计，可参照各种 公知文献(例如，参照Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997， Martienssen R: Curr.Biol. 6: 810， 1996等)。2.本发明的蛋白质本发明还提供由上述多核苷酸(a) (f)中任一多核苷酸编码的蛋白质。 本发明的优选蛋白质，是由序列号2的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸 缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列组成，且具有硫酸腺苷基转移 酶活性的蛋白质。作为此种蛋白质，可列举由序列号2的氨基酸序列经过上述数量的氨 基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列组成，且具有硫酸 腺苷基转移酶活性的蛋白质。另外，此种蛋白质包括具有与序列号2的氨 基酸序列有上述同源性的氨基酸序列，且具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋 白质。这类蛋白质可用《分子克隆第3版》、《Current Protocols in Molecular Biology》、"Nuc. Acids. Res" 10, 6487 (1982)，，、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79，6409 (1982)"、 "Gene， 34， 315 (1985)"、 "Nuc. Acids. Res" 13, 4431 (1985)，，、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 82， 488 (1985)"等中记载的定点诱变法获得。
本发明的蛋白质的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个以 上的氨基酸残基，是指在同一序列中的任意且1个或多个氨基酸序列的位 置上缺失、取代、插入和/或添加1个或多个氨基酸残基，2种以上对缺失、 取代、插入及附加中的也可同时发生。以下，例示可相互取代的氨基酸残 基。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。
A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2 —氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环 己基丙氨酸；B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2—氨基 己二酸、2-氨基辛二酸；C组天冬酰胺、谷氨酰胺；D组赖氨酸、精氨 酸、鸟氨酸、2， 4一二氨基丁酸、2， 3 — 二氨基丙酸；E组脯氨酸、3 —
羟基脯氨酸、4一羟基脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组 苯丙氨酸、酪氨酸。
本发明的蛋白质也可以用Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧 羰基法)等化学合成法来制造。
另外，也可以利用Advanced Chem Tech公司、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司、法玛西亚(Pharmacia)公司、Protein Technology Instruments 公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、岛津制作所公司等制造的肽 合成仪进行化学合成。
3.本发明的载体及导入了该载体的转化酵母
其次，本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述 (a) (i)中任一项所述的多核苷酸或上述(j) (m)中任一项所述的多核苷酸。 本发明的载体通常包括表达盒，该表达盒含有(x)在酵母细胞内可转录的启 动子；(y)与该启动子以正向或反向连接的上述(a) (i)中任一项所述的多核 苷酸；以及(z)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷化作用有关的在酵母中起 作用的信号。本发明中，在后述的酒精饮料(例如，啤酒)酿造中，使上 述本发明的蛋白质高表达时，将这些多核苷酸针对该启动子正向导入，以促进上述(a) (i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)的表达。另外，抑制上 述本发明的蛋白质表达时，也可在载体中可表达地导入上述(j) (m)中任一 项所述的多核苷酸。且在本发明中，通过破坏上述靶基因(DNA)，可抑制 上述DNA的表达或上述蛋白质的表达。基因的破坏，可通过向参与耙基因 的基因产物表达的区域，例如编码区域、启动子区域的内部附加或缺失一 个或多个碱基，或使这些区域整体缺失来进行。这种基因破坏的手法，可 参照公知的文献(例如，参照Proc. Natl.Acad.Sci.USA,76,4951(1979)、 Methods in Enzymology， 101, 202(1983)、日本特开平6-253826号公报等)。
作为导入酵母时使用的载体，可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp 型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如，作为YEp型载体，已知 有YEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83， 1983)，作为YCp型载体，已知有YCp50(M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987)，作为Yip型载体，已知有YIp5(K.Struhl et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USP，76，1035， 1979)，并可容易地获得。
用于调节酵母中基因表达的启动子/终止子，如能在酿造用酵母中起 作用，同时不影响醪液中的氨基酸、糖、高级醇或酯的浓度，可以是任意 的组合。例如，可利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3 — 磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因已被克隆，例如在 M. F. Tuite et al.， EMBO J.， 1,603(1982)中有详细记载，通过已知的方法即可 容易地获得。
作为转化时使用的选择标记，由于酿造用酵母不能利用营养缺陷型标 记，所以可利用遗传霉素抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1) (Marin etal.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 81,337 1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m, PDR4)(分别为猪腰淳嗣等，生化学，64,660， 1992; Hussain et al., gene, 101， 149, 1991)等。
如上所述构建的载体被导入宿主酵母。作为宿主酵母，可列举能用于 酿造的任意酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体可列举酵母属(Sacc/^ram;;c^)等的酵母，但在本发明中，可使用啤酒酵母， 例如巴斯德酵母(Sacc/zaramyces poston'awws) W34/70等，iSacc/wra附少cas car/sZ)ergms^ NCYC453 、 NCYC456 等，或 Sacc/zara附yces cerev/s/ae NBRC1951、 NBRC1952、 NBRC1953、或NBRC1954等。此外，还可以使 用威士忌酵母，例如酿酒酵母NCYC90等；葡萄酒酵母，例如日本酿造协 会的1号、3号和4号等葡萄酒酵母；清酒酵母，例如日本酿造协会的用7 号和9号等清酒酵母，但不限于此。本发明优选使用啤酒酵母，例如巴斯 德酵母 (^acc/wra，ces / osto"'a"入
作为酵母的转化方法，可利用常用的公知方法。例如，可使用电穿孔 法"Meth. Enzym" 194, pl82(1990)"、原生质球法"Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75 p1929(1978),，、醋酸锂法"J.Bacteriology， 153， pl63(1983)，，、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)、 Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中记载的方法，但不限于此。
更具体而言，将宿主酵母在标准酵母营养培养基(例如YEPD培养基 "Genetic Engineering. Vol.l， Plenum Press, New York, 117(1979)'，等)中培养 至OD600nm的值为1 6。将此培养酵母离心分离并收集、洗涤，用浓度 约为1 2M的碱金属离子、优选锂离子进行预处理。将此细胞在约3(TC下 静置约60分钟后，与将导入的DNA (约1 20吗) 一同在约3。C下静置约 60分钟。加入聚乙二醇，优选加入约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓 度为约20% 50%。在约3(TC下，静置约30分钟后，将此细胞在约42°C 下加热处理约5分钟。优选将此细胞悬浮液用标准酵母营养培养基洗涤， 置于规定量的新鲜标准酵母营养培养基中，在约3(TC下静置约60分钟。之 后，将其移植到含有作为选择标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基上， 获得转化体。
此外，关于通常的克隆技术，可参照《分子克隆第3版》、"Methods in Yeast Genitics、 A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 、 Cold Spring Harbor, NY)，，等。
4.本发明的酒精饮料的制造方法及由该制造方法制得的酒精饮料将上述本发明的载体导入适合酿造所需酒精饮料的酵母中，通过使用 该酵母，可制造所需的且亚硫酸盐含量增加、香味增加了的酒精饮料。另 外，也可使用通过下述本发明的酵母评价方法选择的酵母。作为制造对象 的酒精饮料，包括例如啤酒、葡萄酒、威士忌、清酒等，并不限于此。
制造这些酒精饮料时，除了使用本发明中得到的酿造酵母代替亲株外， 可利用公知的手法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往方法完 全相同，不会因制造亚硫酸盐含量增加的酒精饮料而增加成本。即，本发 明可在使用已有设施、不增加成本的情况下，制造出香味稳定性等优异的 酒精饮料。
另外，使用该基因为高表达的酵母时，培养基中的硫酸根离子被高效 摄入，因此，即使使用硫源缺乏的原料，例如制造啤酒时使用麦芽比率低 的麦芽汁时，也可以实现良好的酵母增殖和酒精发酵。
另外，使用含硫氨基酸合成体系的合成过强的酵母时，有时会大量生 成、积累以该途径的中间代谢物硫化氢为代表的、酒精饮料中不受欢迎的 具有异味的含硫化合物类。对于这种酵母，通过抑制或破坏该基因的功能， 抑制硫酸盐作为起始原料的摄入，可以制造出减少了异味的酒精饮料。
5.本发明的酵母的评价方法
技术领域：
本发明涉及用根据具有序列号1的核苷酸序列的硫酸腺苷基转移酶基 因的核苷酸序列设计的引物或探针来评价被测酵母的亚硫酸盐生成能力的 方法。使用引物或探针的评价方法的一般手法已公知，例如，在W001/ 040514号公报、日本特开平8—205900号公报等中有记载。下面，对该评 价方法进行简单说明。
首先，制备被测酵母的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾 法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl30 (1990)]。以得到的基因组为对象，使用根据硫酸腺苷 基转移酶基因的核苷酸序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，检测被 测酵母的基因组中是否存在其基因或其基因的特异性序列。引物或探针的 设计可用公知的方法来进行。基因或特异性序列的检测可使用公知的方法来进行。例如，将含有特 异性序列的一部分或全部的多核苷酸或含有该核苷酸序列的互补核苷酸序 列的多核苷酸作为一个引物使用，另一引物使用含有此序列的上游或下游 序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核苷酸，通过PCR法扩增酵母的核酸，测定扩增物的有无、扩增物的分 子量大小等。用于引物的多核苷酸的核苷酸数通常为10bp以上，优选为15 25bp。且夹在两引物间部分的碱基数通常以300 2000bp为宜。PCR法的反应条件不受特别限定，例如，可使用变性温度90 95°C， 退火温度40 60°C，延伸温度60 75°C,循环数10次以上等条件。 所得反应生成物通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，可测定扩增 产物的分子量。通过该方法，根据扩增产物的分子量是否是含有特异部分 的DNA分子的大小，来预测4平价该酵母的亚硫酸盐生成能力。且通过分 析扩增物的核苷酸序列，可进一步更加准确地预测和/或评价上述能力。本发明通过培养被测酵母，测定具有序列号1的核苷酸序列的硫酸腺 苷基转移酶基因的表达量，也可以评价被测酵母的亚硫酸盐生成能力。此 时，通过培养被测酵母，对硫酸腺苷基转移酶基因的产物mRNA或蛋白质 进行定量。mRNA或蛋白质的定量可用公知的手法来进行。例如，mRNA 的定量，例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量， 例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。而且，通过培养被测酵母，测定具有序列号1的核苷酸序列的硫酸腺 苷基转移酶基因的表达量，选择与目的亚硫酸盐生成能力相应的上述基因 表达量的酵母，可选择出适于酿造所需酒精饮料的酵母。另外，也可以培 养标准酵母及被测酵母，测定各酵母中上述基因表达量，比较标准酵母和 被测酵母的上述基因表达量，从而选择出所需的酵母。具体而言，例如可 通过培养标准酵母及被测酵母，测定具有序列号1的核苷酸序列的硫酸腺 苷基转移酶基因在各酵母中的表达量，选择与标准酵母相比该基因为高表 达的被测酵母，从而选择出适于酿造所需酒精饮料的酵母。或者，可以通过培养被测酵母，选择亚硫酸盐生成能力强的或硫酸腺 苷基转移酶活性高的酵母，从而选择出适于酿造所需酒精饮料的被测酵母。 上述情况下，作为被测酵母或标准酵母，例如可使用导入了上述本发明的载体的酵母、上述本发明的多核苷酸(DNA)的表达被促进或抑制的 酵母、实施了人工突变处理的酵母、发生了自发突变的酵母等。关于硫酸 腺苷基转移酶的活性，例如可通过Klonus等的方法(PlanU.1994Jul; 6(1): 105-12.)来测定。突变处理，例如可使用紫外线照射、放射线照射等物理 方法，EMS (甲磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等试剂处理的化学方法等 任何方法(例如，参照大嶋泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传 学实验法、p67-75、学会出版中心等。日语原文「大嶋泰治編著、生物化 学実験法39、酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版ir乂夕一」)。另外，关于可作为标准酵母、被测酵母使用的酵母包括可用于酿造的 任意酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体可为酵母属(Saccharomyces ) 等酵母(例如 <S. poston'awws 、 S.ce/rv/w'ae 禾口 S.car/^^^e"w's)。在本发明中，可使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(tSacc/zflframyces / oston'a鼎s) W34/70等, Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、 NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951 、 NBRC1952、 NBRC1953、或NBRC1954等。此外，也可以使用葡萄酒酵母，例如曰本 酿造协会1号、3号和4号等葡萄酒酵母；清酒酵母，例如日本酿造协会的 7号和9号等清酒酵母，但不限于此。本发明优选使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母。标准酵母、被测酵母可从:h述酵母中以任意组合选择。实施例下面，通过实施例说明本发明的内容，但本发明不限于以下的实施例。 [实施例1]硫酸腺苷基转移酶基因(nonScMET3)的克隆用日本特开2004-283169中记载的比较数据库检索后，发现了啤酒酵母 特有的新型硫酸腺苷基转移酶基因、nonScMET3 (序列号1)。根据得到的核苷酸序列信息，分别设计了用于扩增全长基因的引物ncmScMET3—F (序 列号3) /nonScMET3一R (序列号4)，以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70株(W34/70株)的染色体DNA为模板进行 PCR，获得含有nonScMET3全长基因的DNA片段。将按上述操作得到的nonScMET3基因片段，通过TA克隆插入 pCR2.1-TOPO载体[英杰(Invitrogen)公司制造]。用Sanger法(R Sanger, Science, 214， 1215， 1981)分析nonScMET3基因的核苷酸序列，并证实 了核苷酸序列。 [实施例2]啤酒试酿中的nonScMET3基因表达分析用啤酒酵母巴斯德酵母W34/70株进行啤酒试酿，将从发酵中的啤酒酵 母菌体中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微阵列进行检测。麦芽汁浸出物浓度 12.69%麦芽汁体积 70L麦芽汁中溶解氧浓度 8.6ppm发酵温度 15°C酵母添加量 12.8xl06cells/mL对发酵液进行经时采样，观察酵母增殖量(图1)、浸出物表观浓度(图 2)的经时变化。与此同时，对酵母菌体进行采样，将制备好的mRNA用生 物素标记，与日本特开2004-283169中记载的啤酒酵母DNA微阵列杂交。 用基因芯片操作系统(GCOS; GeneChip Operating Software 1.0，昂飞 (Affymetrix)公司制造)进行信号检测。nonScMET3基因的表达模式如图 3所示。其结果证实nonScMET3基因在一般的啤酒发酵中表达。 [实施例3]nonScMET3基因的组成型表达将实施例1中所述的nonScMET3/pCR2.1-TOPO用限制酶Sacl及Notl 酶解，制备含有nonScMET3基因的DNA片段。将其与经限制酶Sacl及 Notl处理的pUP3GLP2连接，构建nonScMET3组成型表达载体pUP-nonScMET3。 pUP3GLP2是在同源重组位点含有乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶 基因URA3的YIp型(染色体整合型)酵母表达载体，导入的基因在甘油 醛-3-磷酸脱氢酶基因TDH3的启动子和终止子的控制下组成型表达。作为 酵母中的选择标记，在半乳糖激酶基因GAL1的启动子和终止子的控制下 整合抗药性基因YAP1，从而在含有半乳糖的培养基中被诱导表达。另外， 还包含作为大肠杆菌中的选择标记的氨节青霉素抗性基因Amp、使用通过上述方法制作的组成型表达载体，用日本特开平07-303475 中记载的方法，转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34〃0株。首 先，若生成的亚硫酸盐在菌体内积累，则酵母自身受到亚硫酸盐引起的损 害，无法正确评价该基因的效果，因此用日本特开2004-283169中记载的方 法获得编码亚硫酸盐排出泵的nonScSSUl基因高表达株，将其作为亲株。 将得到的亲株用pUP-nonScMET3进行转化，在含有浅蓝菌素1.0mg/L的 YPGal平板培养基(1%酵母膏、2%多聚蛋白胨、2%半乳糖、2%琼脂)上 选择浅蓝菌素抗性株。 [实施例4]啤酒试验酿造中的亚硫酸盐生成量分析在下述条件下，用亲株和实施例3中获得的nonScMET3高表达株2株 进行发酵试验。麦芽汁浸出物浓度 11.96%麦芽汁体积 1L麦芽汁中溶解氧浓度 约10ppm发酵温度 15"C恒定酵母添加量 6g湿酵母菌体/L麦芽汁对发酵醪液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)(图4)、浸出 物消耗量的经时变化(图5)。关于发酵结束时的亚硫酸盐浓度的定量，通 过在酸性下利用蒸馏将亚硫酸盐收集到过氧化氢水中，然后用碱滴定来进 行[(财)日本酿造协会改订BCOJ啤酒分析法]。由图6可知，发酵结束时的亚硫酸盐生成量，亲株为25.4ppm，而nonScMET3高表达株分别为32.3、 33.8ppm。该结果表明，通过nonScMET3高表达，亚硫酸盐生成量约提高30%。此时，亲株与组成性表达株之间在 增殖速度及浸出物消耗速度上无差别。由上述结果可知，本发明中公开的通过使啤酒酵母特有的硫酸腺苷基 转移酶基因组成型表达而使亚硫酸盐的生成能力强化的酵母，能在不改变 发酵工序、发酵时间的情况下，特异性增加作为啤酒抗氧剂起作用的亚硫 酸盐的生成量。从而可以制造出香味稳定性优异、保质期更长的酒精饮料。 [实施例5]使用了低硫源麦芽汁的啤酒酿造试验用实施例3中制作的高表达载体将巴斯德酵母(&cc/^raw少cw poytoW"m^y) W34/70株转化，分别获得Sc和non-ScMET3 (单独)高表达 株。然后，调制麦芽比率为24%的麦芽汁作为低硫源麦芽汁，在下述条件 下，用亲株和得到的高表达株进行啤酒酿造试验。麦芽汁浸出物浓度 13%麦芽汁体积 2L麦芽汁中溶解氧浓度 约8ppm发酵温度 15X:恒定酵母添加量 10.5g湿酵母菌体/2L麦芽汁对发酵醪液进行经时采样，观察酵母增殖量(OD660)、糖消耗量的经 时变化。 [实施例6] MET3基因的破坏按照文献(Goldstein etal.， yeast. 15 1541 (1999))的方法，以含有抗药 性标记的质粒(pFA6a (G418")或pAG25 (natl))为模板进行PCR，制作MET3 基因破坏用片段。用制作的基因破坏用片段将W34/70株或孢子克隆W34/70-2株转化。 转化采用日本特开平07-303475中记载的方法进行，选择试剂的浓度分别为 遗传霉素300mg/L，诺尔丝菌素50mg/L。[实施例7]啤酒酿造试验中的含硫化合物生成量的分析在下述条件下，用亲株及实施例6中获得的破坏株进行啤酒酿造试验。 麦芽汁浸出物浓度 13%对发酵醪液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)、糖消耗量的 经时变化。用顶空气相色谱法进行醪液中的含硫化合物类的分析。工业实用性根据本发明的酒精饮料制造方法，由于产品中具有抗氧化作用的亚硫 酸盐的含量增加，从而可以制造香味稳定性优异、保质期更长的酒精饮料。 另外，本发明的酵母可以高效地还原作为硫源摄取的硫酸根离子，生物合 成增殖所需的含硫化合物，因此即使使用含硫氨基酸含量低的原料、例如 发泡酒麦芽汁的情况下也可以进行良好的酒精发酵。此外，即使对于具有 异味的含硫化合物类的生成量高的酵母，也可以通过抑制该基因的表达来 制造香味良好的酒精饮料。本申请主张日本专利申请第2005-235011号(2005年8月12日申请) 以及日本专利申请第2006-84289号(2006年3月24日申请)的优先权的 利益，通过引用将该申请所记载的全部内容包括在本申请内。另外，其他 所有引用文献的全部内容也包括在本申请内。麦芽汁体积 麦芽汁中溶: 发酵温度氧浓度约8ppm15"C恒定10.5g湿酵母菌体/2L麦芽汁酵母添加量
权利要求
1. 多核苷酸，其是选自下述(a)～(f)构成的组中的多核苷酸(a)多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；(c)多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列组成且具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；(d)多核苷酸，其含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列且具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；(e)多核苷酸，其含有与由序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有与编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸。
2. 根据权利要求1所述的多核苷酸，其是选自下述(g) (i)构成的 组中的多核苷酸-(g) 多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列或序列号2的氨基酸 序列经过1 10个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列组成 且具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质；(h) 多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有90%以上同一 性的氨基酸序列，且具有硫酸腺苷基转移酶活性的蛋白质；以及(0多核苷酸，其与序列号1的核苷酸序列或与序列号1的核苷酸序 列的互补核苷酸序列在高严谨条件下杂交，且编码具有硫酸腺苷基转移酶 活性的蛋白质。
3. 根据权利要求1所述的多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列组 成的多核苷酸。
4. 根据权利要求1所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序 列组成的蛋白质的多核苷酸。
5. 根据权利要求1 4任一项所述的多核苷酸，其是DNA。
6. 多核苷酸，其是选自下述(j) (m)构成的组中的多核苷酸，(j)多核苷酸，其编码具有与权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的 转录产物互补的核苷酸序列的RNA;(k)多核苷酸，其编码通过RNAi作用抑制权利要求5所述的多核苷 酸(DNA)表达的RNA;(1)多核苷酸，其编码具有特异性切割权利要求5所述的多核苷酸 (DNA)的转录产物的活性的RNA;以及(m)多核苷酸，其编码通过共抑制作用抑制权利要求5所述的多核苷 酸(DNA)表达的RNA。
7. 蛋白质，其是由权利要求1 5任一项所述的多核苷酸所编码的蛋白质。
8. 载体，其是含有权利要求1 5任一项所述的多核苷酸的载体。
9. 载体，其是含有权利要求6所述的多核苷酸的载体。
10. 酵母，其含有权利要求8或9所述的载体。
11. 根据权利要求10所述的酵母，其通过导入权利要求8所述的载体增 强亚硫酸盐的生成能力。
12. 酵母，其通过导入权利要求9所述的载体或通过破坏与权利要求5 所述的多核苷酸(DNA)相关的基因，抑制权利要求5所述多核苷酸(DNA)的表达。
13. 根据权利要求10所述的酵母，其通过增加权利要求7所述的蛋白质 的表达量，提高亚硫酸盐的生成能力。
14. 酒精饮料的制造方法，其包括培养权利要求10 13任一项所述的酵母。
15. 根据权利要求14所述的酒精饮料制造方法，其酿造的酒精饮料是麦 芽饮料。
16. 根据权利要求14所述的酒精饮料制造方法，其酿造的酒精饮料是葡萄酒。
17. 酒精饮料，其是用权利要求14 16任一项所述的方法制造的酒精饮料。
18. 评价方法，其包括使用根据具有序列号1的核苷酸序列的硫酸腺苷 基转移酶基因的核苷酸序列设计的引物或探针，评价被测酵母的亚硫酸盐 生成能力。
19. 评价方法，其包括培养被测酵母，以及测定具有序列号1的核苷 酸序列的硫酸腺苷基转移酶基因的表达量，来评价被测酵母的亚硫酸盐生 成能力。
20. 酵母的选择方法，其包括培养被测酵母；对权利要求7所述的蛋 白质进行定量或测定具有序列号1的核苷酸序列的硫酸腺苷基转移酶基因 的表达量；以及选择具有与目的亚硫酸盐生成能力相应的上述蛋白质的量 或上述基因表达量的被测酵母。
21. 根据权利要求20所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和 被测酵母；测定具有序列号1的核苷酸序列的硫酸腺苷基转移酶基因在各 酵母中的表达量；以及选择其中基因的表达高于或低于标准酵母的被测酵 母。
22. 根据权利要求20所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和 被测酵母；对各酵母中权利要求7所述的蛋白质进行定量；以及选择与标 准酵母相比该蛋白质的量增多或减少的被测酵母。
23. 酒精饮料的制造方法，其包括用权利要求10 13任一项所述的酵 母或通过权利要求20 22任一项所述的方法选择的酵母中的任一酵母进行 以酒精饮料制造为目的的发酵，并调节亚硫酸盐的生成量。全文摘要
本发明涉及硫酸腺苷基转移酶基因及其用途，特别是涉及制造香味稳定性优异的酒精饮料的酿造酵母、用该酵母制造的酒精饮料、以及所属饮料的制造方法等。更具体而言，本发明涉及通过控制酿造酵母的硫酸腺苷基转移酶Met3p的编码基因MET3、特别是啤酒酵母的特征性nonScMET3基因的表达量来控制有助于产品香味稳定化的亚硫酸盐的生成能力的酵母，以及使用该酵母的酒精饮料制造方法等。
文档编号C12R1/86GK101283091SQ200680029188
公开日2008年10月8日 申请日期2006年8月11日 优先权日2005年8月12日
发明者下永朋子, 中尾嘉宏, 儿玉由纪子 申请人:三得利株式会社