再循环微流体设备和使用方法

专利名称：：再循环微流体设备和使用方法再循环微流体设备和使用方法本申请要求2005年6月10日提交的美国临时专利申请60/689720的权益，本文引入其全文作为参考。本申请的主题按CSRESS合同号NYC-123-404和国家健康协会资助(NationalInstitutesofHealthGrant)编号1R01HD37109-01A1受到美国政府支持进行。美国政府可以具有某些权利。发明领域本发明涉及樣i流体设备和使用它的方法。发明背景用于检测致病微生物的基于分子生物学的技术如聚合酶链反应(PCR)正逐渐代替基于培养物的检测方法(Kow等，JournalofMedicalEntomology378(4):475-479(2001);Laue等，JournalofClinicalMicrobiology37(8):2543-2547(1999);和Killen等，JournalofVirol.Methods41(2):135-146(1993))。尽管分子方法往往比基于培养物的方法更灵敏、更有针对性和更快速，但它们也受到昂贵设备要求的限制(Baeumner等，AnalyticalChemistry74:1442-1448(2002))。科学家们正通过将分子测定小型化成微流体格式来克服这种限制(Mondesire等，IVDMagazine9-14(2000);Yu等，MicroTotalAnalysisSystemsConference,Enschede，Netherlands545-548(2000);Kopp等，Science280:1046-1048(1998);和Manz等，JournalofChromatography593:253-258(1992))。微流体是开发能在微米范围内使流体体积移动、混合、控制和反应的微型设备的有效技术基础。微流体在减少试剂消耗方面提供明显优点；由于过程如扩散和传质的增强效应而提供更快和更灵敏的反应；通过并行处理增加总处理能力；和在电力和试剂消耗方面降低费用。最重要地，微流体设备的制造不昂贵并允许集成数个模块使分析过程自动化(Duffy等，AnalyticalChemistry70:4974-4984(1998);Jingdong等，AnalyticalChemistry72:1930-1933(2000);和Marty謂a等，AnalyticalChemistry69(23):4783-4789(1997))。微测定芯片和微通道中所有核酸检测方法的共同特征是使用结合到靶特异性探针的标记物。通常，这些标记物为能发荧光、改变或产生颜色从而向探针表明靶杂交的分子(Ramsay,G.,NatureBiotech16:40-44(1998))。还使用纳米颗粒如磁珠(Edelstein等，Biosensors&Bioelect讓cs14:805(2000))、月旨质体(Esch等，AnalyticalChemistry73:2952-2958(2001))和金颗粒(Taton等，Science289:1756画1760(2002)和Cao等，Science297:1536-1540(2002))作为标记物。在大多数情况下，这些颗粒标记的测定已证实更灵敏，因为它们提供了常规标记物不可能的进一步信号放大的方式。例如，Taton等在他们的测定中利用银还原增强金颗粒的可视性(Taton等，Science289:1756-1760(2002))。利用脂质体已实现了最不昂贵并或许是最简单的信号放大方案。脂质体是捕获几十万标记分子以提供大的信号放大和增强的灵敏性(是单一荧光团检测的3个数量级大)的磷脂泡嚢(Lee等，AnalyticaChimicaActa354:23-28(1997))。微流体混合器是微尺度总分析系统(pTAS)的集成部件，其在紧凑的系统中包含各种模块单元(Manz等，"Miniaturizedtotalchemicalanalysissystems.Anovelconceptforchemicalsensing",Transducers'89:Proceedingsofthe5thInternationalConferenceonSolid-StateSensorsandActuatorsandEurosensorsIII.Part1,Montreux,Switzerland(6月25-30,1989);vandenBerg等，ProceedingsoftheInternationalSymposiumonMicromechantronicsandHumanScience,181-184页(1994);和Dhawan等，AnalyticalandBioanlyticalChemistry,373:421-426(2002))。紊流是宏观尺度混合的主要机理，在大多数微流体系统中在正常条件下由于低雷诺数而实际上缺乏。因此，必须在微流体系统中利用替代的混合策略。近年来已根据各种不同原理建议了数种不同策略。被动式混合器(passivemixer)只利用通道的几何形状实现混合。被动式混合器的例子包括使用鱼骨形结构的刚性排列产生横流以增加要^皮混合的液体之间界面面积的那些(Stroock等，Science295:647-651(2002));使用蛇形通道模拟色谱柱部分装填床的那些(He等,"APicoliterVolumeMixerforMicrofluidicAnalyticalSystems",AnalyticalChemistry73:1942(2001));和使用具有深井结构的T型结混合器的那些(Johnson等，"RapidMicrofluidicMixing",AnalyticalChemistry74:45(2002))。被动式微混合器的完全概述给出了微尺度混合系统中涉及的基本物理学综述和微混合器中目前使用的各种几何结构的讨"i仑(Nguyen等,"Micromixers-Areview"，丄Micromech.Microeng.15:R1-R16(2005))。主动式混合器(activemixer)通常使用物理运动引起混合。这种设备的例子是基于磁场影响下的搅拌棒运动的那种(Barbie等,"Electromagneticmicromotorformicrofluidicsapplications",AppliedPhysicsLetters79:1399(2001))。另一4艮道的设备包括能在封闭的微流体通道内再循环毫微升体积的微流体设备，其采用平衡性液压来对抗在死端室中电渗透产生的流(Lammertink等，Anal.Chem.76:3018-3022(2004))。但是，仍需要不具有缺陷(上述)的微流体混合器。本发明涉及克服本领域中的上述缺陷。发明概述本发明涉及用于检测或量化测试样品中分析物的微流体测试设备(microflmdictestdevice)。该设备包括非吸收性基底，基底具有乂人中延伸的至少一个进口和出口。进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接。所述至少一个微通道包括进口部分和分析部分。该设备还包括位于分析部分处或其上游的非特异性捕获设备。该设备还包括延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构。本发明还涉及检测或量化测试样品中分析物的方法。该方法包括提供至少一种测试混合物，其中所述测试混合物包括测试样品、捕获缀合物(captureconjugate)和标记缀合物(markerconjugate)，其中测试样品可能包含分析物。捕获缀合物包括捕获载体和第一结合材料，其中第一结合材料经选择以与分析物的一部分结合。标记缀合物包括颗粒、标记物和第二结合材料，其中第二结合材料经选择以与分析物的不同于针对其选择第一结合材料的那部分的一部分结合。方法还包括提供微流体测试设备用于检测或量化测试样品中的分析物。测试设备包括非吸收性基底，基底具有从中延伸的至少一个进口和出口，其中进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接，和其中所述至少一个微通道包括进口部分和分析部分。测试设备还包括位于分析部分处或其上游的非特异性捕获设备。测试设备还包括延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构。在微流体测试设备内，允许反应在测试混合物中在测试样品中存在的分析物和第一与第二结合材料之间发生，从而形成包括测试样品中存在的分析物、捕获缀合物和标记缀合物的产物复合体(productcomplex)。使反应过的测试混合物接触非特异性捕获设备(例如对捕获载体具有非特异性亲合力的设备)，于是从反应过的测试混合物中固定反应过的测试混合物中存在的产物复合体。在微流体测试设备分析部分处检测来自固定的产物复合体的标记物的存在或数量，并分别与测试样品中分析物的存在或数量关联。本发明的另一方面涉及检测或量化测试样品中分析物的方法，如下该方法包括提供至少一种测试混合物，测试混合物包括可能包含分析物的测试样品、包括捕获载体和第一偶联组中第一成员的捕获载体复合体、经选择以与分析物的一部分结合并包括第一偶联组中第二成员的第一结合材料、标记复合体(包括颗粒、标记物和第二偶联组中第一成员)、和经选择以与分析物的不同于针对其选择第一结合材料的那部分的一部分结合并包括第二偶联组中第二成员的第二结合材料。该方法还包括提供微流体测试设备用于冲企测或量化测试样品中的分析物。测试设备包括非吸收性基底，基底具有从中延伸的至少一个进口和出口，其中进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接，和其中所述至少一个微通道包括进口部分和分析部分。测试设备还包括位于分析部分处或其上游的非特异性捕获设备。测试设备还包括延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构。在微流体测试设备内，允许反应在所述至少一种测试混合物中在第一偶联组中的第一和第二成员之间、在第二偶联组中第一和第二成员之间、和在测试样品中存在的分析物和第一与笫二结合材料之间发生。结果，形成包括测试样品中存在的分析物、捕获载体复合体、第一结合材料、标记缀合物和第二结合材料的产物复合体。使反应过的测试混合物接触到非特异性捕获设备(例如对捕获载体具有非特异性亲合力的设备)，于是从反应过的测试混合物中固定反应过的测试混合物中存在的产物复合体。在微流体测试设备分析部分处检测来自固定的产物复合体的标记物的存在或数量，并分别与测试样品中分析物的存在或数量关联。本发明的另一方面涉及检测或量化测试样品中分析物的方法，如下该方法包括提供至少一种测试混合物，测试混合物包括可能包含分析物的测试样品、捕获缀合物(包括捕获载体和第一结合材料)和标记缀合物(包括颗粒、标记物和分析物类似物)，其中第一结合材料经选择以与分析物的一部分结合。该方法还包括提供微流体测试设备用于检测或量化测试样品中的分析物。测试设备包括非吸收性基底，基底具有从中延伸的至少一个进口和出口，其中进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接，和其中所述至少一个微通道包括进口部分和分析部分。测试设备还包括位于分析部分处或其上游的非特异性捕获设备。测试设备还包括延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构。在微流体测试设备内，允许在所述至少一种测试混合物中在须'J试样品中存在的分析物和所述分析物类<以物之间针对第一结合材料发生竟争。结果，形成包括捕获缀合物和标记缀合物的产物复合体。使反应过的测试混合物接触到非特异性捕获设备(例如对捕获载体具有非特异性亲合力的设备)，于是从反应过的测试混合物中固定反应过的测试混合物中存在的产物复合体。在分析部分处检测固定的产物复合体。将来自固定的产物复合体的标记物的存在或数量分别与测试样品中分析物的存在或数量关联。本发明还涉及微流体设备(在本文中也称为再循环微流体设备、或微流体混合设备等)。该设备包括非吸收性基底和一个或多个固定式混合结构，非吸收性基底具有从中延伸的至少一个进口和出口。所述至少一个进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接。所述一个或多个固定式混合结构延伸到所述至少一个微通道内。根据本发明，与脂质体信号放大方案组合的微流体保证为以下技术的强烈需要提供了廉价的解决方案所述技术可紧跟最近的生物恐怖主义威胁快速且精确地检测环境、临床和食物样品中的致病生物。脂质体技术已用在模拟膜检测系统中，并取得巨大成功(Baeumner等，AnalyticalChemistry74:1442-1448(2002);Esch等，AnalyticalChemistry73:3162-3167(2001);和Rule等，ClinicalChemistry42:206隱1209(1996)，本文包括它们的全文作为参考)。还报道了通过将用于小球隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)的脂质体基膜检测测定转化成微流体格式获得敏感性增益(Esch等，AnalyticalChemistry73:3162-3167(2001);和Rule等，ClinicalChemistry42:206-1209(1996);和Taton等，Science289:1756-1760(2002),本文引入它们全文作为参考)(还参见Goral等,"Electrochemicalmicrofluidicbiosensorforthedetectionofnucleicacidsequences,'LabonaChip6(6):414-421(2006);Zaytseva等，"Microfluidicbiosensorfortheserotype-specificdetectionofdenguevirusRNA"，AnalyticalChemistry77(23):7520-7527(2005);和Zaytseva等,"Developmentofamicrofluidicbiosensormoduleforpathogendetection",LabonaChip5(8):805-811(2005),本文引入它们全文作为参考)。本发明的被动式微流体混合器能在移动的并且开放的体积内建立从毫微升到微升范围的再循环流。设备中的混合不是由于产生垂直于通道长度的横流而发生(参见Stroock等，Science295:647-651(2002),本文引入其全文作为参考)，而且通过产生平行于通道长度的横流发生，从而在通道不同长度处的流线段可彼此接触。其利用流体-交换原理的优点(Chung等的美国专利6331073中所述，本文引入其全文作为参考)该设备提供次序变化功能(order-changingfunction)给樣i流体，即，允许由通道长度分割的流体段直接相互作用。该设备有效地"折叠(fold)"溶液以使得通常被线性分割的流线可以接触。在一种实施方案中，微流体设备为在使用外部电机控制的附连注射器在端部开口室(叩en-endchamber)中压力驱动的微流体混合器。学微/毫微系统，如(但不限于)微流体传感器、微-TotalAnalysisSystems。例如，其可用于数种溶液的有效和快速混合，其可用于减少核酸序列基扩增(NASBA)反应或任何催化衍生反应、任何杂交反应、任何结合反应(例如，利用脂质体和具有固定的DNA寡核苷酸的》兹珠的RNA-DNA杂交反应)所需的时间。附图简述图1显示了基于DNA/RNA杂交的本发明生物传感器的原理方案。图2A-B显示了使用硅晶片作为模具并采用第二硅晶片作为盖来控制PDMS层的平直度和厚度以制造聚二曱基硅氧烷("PDMS")微通道。图2A显示了排列中的这些部件，其中PDMS层在第一和第二硅晶片之间，这是正形成PDMS层的情况。图2B显示了分解图，其中第一石圭晶片、PDMS层和第二硅晶片在形成PDMS层后^皮彼此分开。图3A-B显示了用于荧光和电化学检测的通道布置图。图3A显示了信号检测的荧光方法的通道布置图。通道靠近出口110的放大区域106为检测区，具有进口102的通道为主杂交通道。图3B显示了信号检测的电化学方法的通道布置图。在进口102和进口108合并的位置和出口110的位置之间的较宽通道106代表才企测区。图4显示了微流体通道设备20的组装。具有微通道24的PDMS层22被搁置在玻璃板26上面以便为通道结构提供罩。图5显示了在壳中的微流体设备32的组装。使用由两个板28和4-8个螺钉30组成的壳通过施加轻微压力将PDMS22-玻璃板26结构夹持到一起。图6A-B显示了根据本发明的交指型(interdigitated)超微电极阵列("IDUA")。图7显示了根据本发明的荧光检测设备。图8显示了根据本发明磁体在双通道微流体设备捕获区中的定位。使用荧光显微法测量磁体上面检测区(捕获区)中的荧光。尽管可使用其它荧光检测设备，但这里选择焚光显微镜以便在反应发生的同时光学地观察分析中的不同步骤。图9显示了根据本发明的电化学检测设备。图IO显示了根据本发明PDMS微通道层在玻璃板上IDUA变换器上面的定位。图11显示了分析系统仪表设备的简化框图。图12显示了初始恒电位仪电路。用1.2V参考电压(Vref)设置IDUA电势，并用1MQ电位计调节。首先将传感器输出转化成电压，放大，并输出到连接到计算机上的LCD或数据记录器。用开关S2调整电流-电压放大器的增益。图13显示了检测0.1M六铁氰化钟(potassiumferrihexacyanide)和六亚纟失氰4匕钟(potassiumferrohexacyanide)的传感器输出对时间的关系。通道1图示在400mV保持不变的偏压电势，而通道2为以mV表示的电流-电压放大器输出。图14A显示了六铁氰化物/六亚铁氰化物检测的剂量响应曲线。图14B显示了0、0.1和ljaM浓度的图14A的放大图。图15显示了微控制器程序流程。操作为中断驱动的，其中微控制器("MCU，，)停留在低功率模式下直到中断发生。然后它进入活动模式并执行中断要求的事件。图16显示了样品中没有RNA(本底)和存在复合体(具有耙RNA和结合的未裂解脂质体(A)/裂解脂质体(B))时的捕获的超顺磁珠的荧光图象。图17显示了荧光强度对脂质体量的关系。图18显示了焚光强度对磁珠量的关系。图19显示了用于测定^f全测下限的标准曲线。误差^f奉对应于3x标准偏差。图20显示了当注入20nL、50nL、100nL的IO4MFe2+/Fe3"^t微通道中的IDUA响应。緩冲液流速为ljuL/mm。缓沖液本底信号-0.27±0.01nA,20nL信号-0.95士0.03nA,50nL信号-2.06士0.05nA，lOOnL信号-4.15士0.1nA。图21显示了存在分析的RNA和不存在分析的RNA时微通道中IDUA的信号响应。图22A-B为显示微流体混合器设备的结构的示意图。上部图象(图22A)显示了一个锯齿单元的设计。下部图象(图22B)为设备的横截面。灰色区域指PDMS设备自身，白色区域为由PMMA制成的壳。顶部PMMA和PDMS层中的孔用于允许到达通道，所述通道被才莫制在底部PDMS层内。PMMA层用于结构支撑和用于宏观互连放置(未示出)。图23显示了从上方观察的二维速度分布图。上部图象为左至右流向，下部图象为右至左流向。所示微通道的长度为150pm。按左侧上的尺度[m/s]，以颜色编码速度大小。图24为三个流线沿一个锯齿单元长度的左至右流向的速度分布图。在y-轴上以m/s给出速度。"上部，，流线为从图2中离下壁37.5)um—0.75伞50)um)开始的那种(流线都为处于纸平面中的2D函数)。"中间"流线为从离上壁和下壁25pm开始的那种。"下部"流线为从离下壁12.5)um开始的那种。图25为三个流线沿一个锯齿单元长度的右至左流向的速度分布图。在y-轴上以m/s给出速度。"上部，，流线为从图2中离下壁37.5(1111=(0.75*50|^1)开始的那种(流线都为处于纸平面中的2D函数)。"中间"流线为从离上壁和下壁都为25pm开始的那种。"下部"流线为^v离下壁12.5|um开始的那种。图26显示了在四个锯齿单元上向右(前四帧)和向左(下面7帧)移动的标记的DMSO/未标记的烃塞子/标记的DMSO的时间推移图。图27A-B显示了彼此邻接再循环的四个独立体积元件的照片和图示。手动进行快速的前后循环得到这个图象。通道填充二分之一的荧光标记的DMSO和二分之一的未标记DMSO,并快速与往复流混合。在照片(图27A)中可看到明显不同浓度的四个区域，并图示在下面(图27B)。图28显示了微通道的构造。"进口1"口是反应溶液的主要进口。"进口2"用作脂质体裂解的表面活性剂进口。两个进口使用位于检测区末端的相同出口。图29显示了锯齿形微通道的尺寸。所有测量值都以微米计。每个微设备都包含各自具有166个锯齿的20个列(5cm)。图30为表示用于混合研究的通道的图。为了研究目的，在通道宽度变成50|im处设为0长度。图31显示了锯齿形通道的横截面。沿着延伸通过两个锯齿之间中间的横截面的线测量像素强度。图32显示了锯齿形通道和直线形通道之间混合分布图的比较。在锯齿之间中点处和在光滑通道中的等同距离处获取像素强度分布。0的长度代表进口进入通道的点。DI水进口在标记为通道宽度50的侧上，50mM焚光素在通道宽度0处。图33显示了通道不同长度处像素强度的标准偏差。相对直线通道(--),锯齿通道(-'-)在给定长度上似乎达到较小的标准偏差。图34A-B显示了IDUA的示意图(图34A)和IDUA在1.25x、5x和20x放大倍数下的光学照片(图34B)(参见Goral等，"Electrochemicalmicrofluidicbiosensorforthedetectionofnucleicadds叫uences",LabonaChip6(6):414-421(2006),本文引入其全文作为参考)。图35为显示具有延伸到微通道200内的一个或多个固定式混合结构300的微通道各种实施方案的示意图。该图显示了通道的顶视图(例如在PDMS800中)(通过敞开面通道，显示出锯齿结构)。图36A-C为显示具有锯齿结构的微通道(例如PDMS微通道)的示意图。图36A显示了本发明的封装设备的侧视图。关键点微通道400;载玻片盖500;壳600(例如丙烯酸树脂壳)；和螺钉700。图36B显示了通道的侧视图(例如在PDMS中)。关键点PDMS800;和微通道400。图36C显示了PDMS中通道的顶一见图(通过敞开面通道，显示锯齿结构900)。关键点PDMS800;和樣i通道400。箭头指示流体流动通过设备。图37为显示具有两个进口通道890的PDMS800中通道的顶视图的示意图(通过敞开面通道，显示锯齿结构900)。发明详述本发明涉及用于检测或量化测试样品中分析物的微流体测试设备。该设备包括非吸收性基底，基底具有从中延伸的至少一个进口和出口。进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接。所述至少一个微通道包括进口部分和分析部分。设备还包括位于分析部分处或其上游的非特异性捕获设备。设备还包括延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构。在一种实施方案中，具有多个延伸到所述至少一个微通道内的固定式混合结构。这些固定式混合结构可延伸不同的长度到所述至少一个微通道内。在另一个实施方案中，每个微通道都具有相对的侧，至少一些固定式混合结构沿着通常彼此相对的方向从相对侧延伸到微通道内。在又一实施方案中，微流体测试设备可包括以一定倾斜角度延伸到所述一个或多个微通道内的一个或多个固定式混合结构。可存在多个固定式混合结构，其中至少一些以不同角度延伸到所述一个或多个微通道内。在还一实施方案中，可存在多个到每个樣i通道的进口。本文使用的术语固定式混合结构也可称为锯齿。锯齿可具有变化的长度(以便捕捉不同流线)。锯齿可具有变化的角度。锯齿排列可包括换向锯齿(即，具有一组如所示的锯齿加上在通道第二部分的与其成镜像的一组)，或在通道壁的任何一侧或两侧上设置锯齿。例子显示在图35中。通道长度不是关键性的，并将简单地提供或多或少的体积。因此，已经制造了可具有5nL总体积的设备和可具有15nL体积的那些(作为例子)。混合器可由PDMS以外的材料制成，包括(但不限于)Si、Si02、SU8、石英、丙烯酸树脂等(见图36)。任何流体都可进行混合，所述流体还可包含颗粒物或较大分子，包括但不限于脂质体、磁珠、细胞、核酸、酶等。设计可用于NASBA反应(基于核酸序列的扩增)和用于脂质体测定。在又一实施方案中，微流体设备包括通向主锯齿通道的两个进口通道(见图37)。在一种实施方案中，描述了微流体设备能再循环微升体积。设备由具有玻璃盖密封的压力进口和出口孔的模制聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道构成(参见图36)。通过在多重锯齿结构上反复改变流向实现再循环。锯齿结构用于根据流体在结构上是向后流还是向前流而不同地改变各个流线的流体速度。按照这种方式，可相对于其它流线加速或减速单个流线以使得流体将相互作用的部分通常被线性分割。低雷诺数表明过程可逆，忽略扩散。使用荧光指示剂来验证数值模拟。发现羧基荧光素标记的DMSO塞和未标记DMSO塞在不混溶性烃塞上的混合在7.1min后在具有锯齿结构的通道内达到稳态，而在没有锯齿结构的通道内是在34.8mm后，这证实了根据数值;漠拟所预期的。本发明的再循环微流体混合器可用在各种生物分析和化学微/毫微系统中，如(但不限于)微流体传感器、微-TotalAnalysisSystems。例如，它可用于数种溶液的有效快速混合，它可用于减少基于核酸序列的扩增(NASBA)反应或任何催化衍生反应、任何杂交反应、任何结合反应所需要的时间。微流体设备还可用在NASBA反应中，并随后还用于利用脂质体和具有固定的DNA寡核苦酸的磁珠的RNA-DNA杂交反应中。非吸收性基底由材料如石英、玻璃、聚曱基丙烯酸酯、聚二曱基硅氧烷或聚合材料形成。微流体测试设备可以另外在分析部分上游包括培育部分。当捕获设备和分析部分在相同位置时，可在捕获设备处检测包含分析物、捕获缀合物和标记缀合物的复合体。当分析部分在捕获设备下游时，标记物从固定到捕获设备的复合体中释放，并在它在从进口102到出口110的方向上随流体一起移动时检测。在第三种实施方案中，分析部分位于捕获设备的上游，从而当标记物从固定的复合体中释放时，它然后通过在从出口110到进口102的方向上的流体逆流携带到分析部分。电化学检测组装包括基于微控制器的分析系统。这种系统的例子描述在下面段落中。目前的仪器设备同时为微流体生物传感器的电化学检测用恒电位仪、数据获取/储存系统、和有源元件(如泵致动器和电磁体)用控制器。利用使用尽可能少元件的电子设计实现便携性、低功率消耗和小波形因数的要求。系统的核心为TexasInstruments的低功率、高度集成的MSP430FG439微控制器("MPU")。TexasInstruments生产大量仅仅在I/0针脚数量、集成外围设备、存储器和价格方面不同的设备。所有MCU的基础体系结构是相同的。因此，为一个MCU写的代码将只需对初始化设置作出很小变化就能在所有MCU上工作。MCU选择提供的灵活性允许制造廉价基础分析系统以及使用相同编码库的高级系统。此外，利用高级MCU可容易地升级系统。MSP430具有4个主要部分-CPU、存储器、时钟和外围设备。见图11。CPU执行所有计算和数据操作。MSP430FG439具有60KB程序存储器和2KSRAM。程序存储器为闪存并可自编程。这种特征允许为以1秒间隔获取的1分钟测量储存约IOO个数据文件。可利用外加永久性存储模块增加储存容量。时钟系统非常灵活，允许设备在极低功率模式下工作，例如对于自动定期测量在32KHz下操作，对于实时数据获取、分析、传送和显示在最高快速的8MHz下操作。大部分系统功能由MCU外围设备提供。MSP430FG439具有内置液晶显示器("LCD")控制器、1个通用同步异步接受器收发器("USART")、8通道12位模拟-数字转换("ADC")口、2通道12位数字-模拟转换("DAC")口、3个运算放大器、内置电源电压监控器、6个通用输入/输出(I/O)口和4个计时器。在这个申请中，基本计时器用于保持实时时钟和记录数据的时标。它还提供LCD帧频率速度。计时器A用于在蜂鸣器上产生警报和与众不同的状态蜂鸣声。计时器B用于产生用来控制MCU外部外围设备的PWM输出。任何一个计时器可以经设置以跟踪测量间隔和持续时间。当操作中出现错误时，监控计时器还可复位设备。MCU的固件主要用C语言来编写，并用微控制器MSP430线的开放源码MSPGCC编译器来编译。微控制器可通过JTAG接口在线路中编程。目前的设计要求JTAG接头(header)留在线路中，从而可升级并容易地调试固件。但是，也可去掉接口以防止窜改。用C语言编写代码为这种系统提供了另一与众不同的优点，为零件和外围设备增加了硬件配置文件，任何可能的微控制器都可代替微控制器的MSP430线。系统的其它主要部件为到MCU的ADC和DAC通道的才莫拟链形偶联器(analoguechaincoupling)。每个ADC通道都被偶联到可编程增益电流-电压放大器上。放大器将在IDUA传感器中感应的电流转换成电压并放大。然后通过MCU的模拟-数字转换器捕捉并记录信号。在显示前，电位信号在软件中被转换回电流。内置DAC外围设备为IDUA提供至多2.5V的偏压电势。通过下面更详细描述的用户接口由用户调节电势。ADC和DAC模拟链形成生物传感器电化学检测方案的恒电位仪。如前所述，这种电路来源于经过充分测试的独立^t拟形式。图12、13、14A和14B显示了初始恒电位仪电路和在400mV电势下在金IDUA上氧化还原对，六铁氰化钾/六亚铁氰化钾，的电化学检测结果。IDUA具有400个指(finger)。指平均1000A高和2pm宽，指之间有0.9pm间隙大小。电流-电压放大器的电阻被设为200KQ(传感器电流=电压/200000)。除非指明，都以l秒间隔进行测量，持续时间为l分钟。基于微控制器的设备的操作是中断驱动的。大多数时间，MCU停留在低功率模式。在这种模式下，实时时钟是开的，但大多数外围设备被关闭。设备只有在响应通过按下一个按钮、USART上接受的通讯信息、通电复位、电池不足警报或任何一个计时器产生的中断时才进入活动模式。操作汇总在图15中。设备以电池为电源。当连接时，通电复位起动MCU。它经历初始化顺序并准备好它的外围设备和计时器。MCU然后进入和停留在低功率模式的主循环中，所述主循环具有由其它中断产生的活动脉冲。按优先顺序处理接受的每个中断。每个中断都唤醒MCU并置它于活动模式以执行要求的任何活动。一旦以活动模式处理完全部指令，MCU又回到低功率模式等待下一个事件。四个按钮产生将LCD显示器打开或关闭、启动测量、启动参数变化和将设备置于监控模式的中断，在处于监控模式时，定期唤醒设备以以预定间隔进行测量。功能不是固定的，可按照需要重新编程。当设备接受其USART口上的输入时也被唤醒。这种输入可为例如检索记录数据的请求。电池不足中断使大部分MCU活动无法动作，并产生可包括蜂鸣和/或LCD上电池不足信号闪烁的警报。如果指令执行n存在问题，则监控计时器产生中断。这种中断将使设备利用默认参数重新初始化自身并相应通知用户。用户接口目前包括LCD、到计算机的串联接线、4个按钮以及到键盘的接线。接口还包括具有访问基础平台因特网能力的交互平台图形用户接口("GUI"),客户可使用它改变测量或控制参数、上传/下载数据和使传感器输出可视化。系统的模块设计允许其它通信方案如以太网、红外和无线在需要时容易集成。GUI提供了容易使用的菜单驱动接口来调整传感器电势、满刻度测量范围、测量间隔、通信设置和设置正确时间。目前，传感器电势可为0-1500mV。满刻度范围(+/-)可为10nA-lmA。测量间隔此时为0.5秒最小值。如果MCU不需要数据存储，则对测量持续时间没有限制。此时MCU的容量被限制到6000个数据点。持续时间因此依赖于容量。因此，对于l秒间隔，测量持续时间应不超过IOO分钟。可在MCU闪存中增加容量到30000个数据点。另外，如前所述，可利用外部数据闪存增加容量。GUI还允许用户从MCU下载的图形或者图形数据上实时观察传感器信号变化。数据还可被保存为逗号分割文件用于在第三方应用中察看和分析。本发明还涉及检测或量化测试样品中分析物的方法。该方法包括提供至少一种测试混合物，其中测试混合物包括测试样品、捕获缀合物和标记缀合物，其中测试样品可能包含分析物。捕获缀合物包括捕获载体和第一结合材料，其中第一结合材料经选择以与分析物的一部分结合。标记缀合物包括颗粒、标记物和第二结合材料，其中第二结合材料经选择以与分析物的不同于针对其选择第一结合材料的那部分的一部分结合。方法还包括提供微流体测试设备用于检测或量化测试样品中的分析物。测试设备包括非吸收性基底，基底具有从中延伸的至少一个进口和出口，其中进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接，和其中所述至少一个微通道包括进口部分和分析部分。测试设备还包括位于分析部分处或其上游的非特异性捕获设备。测试设备还包括延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构。在微流体测试设备内，允许反应在测试混合物中在测试样品中存在的分析物和第一与第二结合材料之间发生，从而形成包括测试样品中存在的分析物、捕获缀合物和标记缀合物的产物复合体。使反应过的测试混合物接触到非特异性捕获设备(例如对捕获载体具有非特异性亲合力的设备)，于是从反应过的测试混合物中固定反应过的测试混合物中存在的产物复合体。在微流体测试设备分析部分处检测来自固定的产物复合体的标记物的存在或数量，并分别与测试样品中分析物的存在或数量关联。在一种实施方案中，通过在所述至少一个微通道中以相对方向循环测试混合物，进行使反应发生和接触的步骤。术语"分析物"意思包括要被测量或检测的化合物或组合物。它能结合到第一和第二结合材料上。合适的分析物包括但不限于抗原(例如蛋白质抗原)、半抗原、细胞和耙核酸分子。优选的分析物是耙核酸分子。本发明适用于用于测定各种分析物的过程和产品。作为分析物类型的典型例子，可提到环境和食品污染物，包括杀虫剂和有毒工业化学品；药物，包括治疗药物和滥用药物；激素，维生素，蛋白质，包括酶、受体和所有类别的抗体；朊病毒；肽；类固醇；细菌；真菌；病毒；寄生虫；细菌、真菌、病毒或寄生虫的组分或产物；适体；各种类型的变应原；正常或恶性细胞的产物或组分；等。作为具体例子，可提到T4;T3;地高辛；hCG;胰岛素；茶碱；促黄体生成激素；和导致或与各种病态有关的有机体，如脓链球菌(组A)、I和II型单纯疱疹、巨细胞病毒、衣原体等。本发明还可用于测定相对抗体亲合性，用于相对核酸杂交试验，利用核酸的限制酶测定，结合蛋白质或其它材料列。较优选的分析物为存在于有机体中的靶核酸分子，所述有机体选自细菌、真菌、酵母、病毒、原生动物、寄生虫、动物(例如人)和植物。合适的有机体包括但不限于小球隐孢子虫、大肠杆菌、炭疽杆菌、登革病毒和人免疫缺陷病毒(HIV-1)。术语"结合材料，，意在包括在其表面上或空穴中具有如下面积的生物受体分子如免疫球蛋白或它的衍生物或片段所述面积特异性结合到另一分子一一在这种情况下是分析物上，并因此被定义为与所述另一分子的具体空间和极性组织互补。合适的结合材料包括抗体、抗原、核酸分子、适体、细胞受体、生物素、抗生蛋白链菌素和其它合适的配体。当分析物为靶核酸分子时，第一结合材料可为核酸分子(例如受体探针，其经选择以与靶核酸分子的一部分杂交)，第二结合材料可为核酸分子(例如捕获探针，其经选择以与靶核酸分子的另一部分杂交)，或其它部分，如能结合到分析物上并与其相互作用的抗体或其它试剂。抗体结合材料可为单克隆、多克隆或基因工程化的(例如单链抗体、催化抗体)，并可通过本领域中众所周知的技术制备，如宿主免疫反应和血清收集、杂交细胞系技术或通过基因工程。结合材料还可为特异性地结合感兴趣的分析物的任何天然存在或合成化合物。第一和第二结合材料经选择以特异性地结合到分析物的分开部分上。例如，当分析物为核酸序列时，需要为耙核酸序列的分开部分选择探针。设计这种探针的技术是众所周知的。适合实施本发明的探针必须与靶分析物序列互补，即能杂交到靶上，并应对靶分析物有高度特异性。探针优选在17和25个核苷酸长之间，以提供需要的特异性，同时避免过长的杂交时间和使在测定条件下形成二级结构的可能性最小。因此，在这种实施方案中，第一结合材料为报道探针，其经选择以并确实与靶核酸序列的一部分杂交。第二结合材料在本文中称为核酸检测/测量实施方案的捕获探针，经选择以并确实与靶核酸序列的不同于和报道探针杂交的那部分的部分杂交。捕获探针可被固定在微通道的捕获部分中或磁珠上。另外，第一和第二结合材料(报道和捕获探针)应能不彼此相互作用或相互作用受限制。确定适合本发明实施的探针和反应条件的才支术描述在Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中，本文引入其全文作为参考。可任选地使用可从DNASTAR得到的称为"Lasergene"的软件程序或类似产品。本发明的方法使用标记复合体，其包括颗粒、标记物和偶联组中的一个成员。合适的颗粒包括脂质体(标记物可被包封在脂质体内，或并入到双层中)、胶乳珠、金颗粒、二氧化硅颗粒、枝状大分子、量子点、磁珠(例如抗体示踪的磁珠和核酸探针示踪的磁珠)或适合衍生的任何其它颗粒。使用多种标记复合体时，每种复合体中的标记物可相同或不同。本申请中描述的脂质体的使用提供了超越使用例如酶的传统信号产生系统的几个优点。这些优点包括增强的信号强度、贮存稳定性和即时释放信号产生标记物，如Siebert等，AnalyticaChimicaActa282:297-305(1993);Yap等，AnalyticalChemistry63:2007(1991);Plant等，AnalyticalBiochemistry176:420-426(1989);Locascio-Brown等，AnalyticalChemistry62:2587-2593(1990);和Durst等，Eds.,FlowInjectionAnalysisBasedonEnzymesorAntibodies,第14巻,VCH,Weinheim(1990)中所述，本文引入它们中每一个的全文作为参考。脂质体可由各种脂类制备，包括磷脂、糖脂、类固醇、较长链烷基酯；例如磷酸烷基酯、脂肪酸酯；例如卵磷脂、脂肪胺等。可使用脂肪材料的混合物，如中性类固醇、带电两性分子和磷脂的组合。磷脂的示例性例子包括卵磷脂、神经鞘磷脂和二棕榈酰磷脂酰胆碱等。典型的类固醇包括胆固醇、chlorestanol、羊毛甾醇等。典型的带电两性分子化合物通常包含12-30个碳原子。单或二烷基磷酸酯或烷基胺例如磷酸二鯨蜡酯、硬脂酰胺、十六碳烷基胺、二月桂基磷酸酯等是代表性的。在包含标记物的水溶液中制备脂质体泡嚢，于是泡嚢将在它们的内部包括标记物。可通过在溶液中强烈搅拌、然后除去未包封的标记物来制备脂质体泡嚢。或者，可使用反相蒸发加超声处理。美国专利4342826和PCT国际公布WO80/01515中阐述了关于脂质体制备的更多细节，本文引入它们两者的全文作为参考。通常调整介质中电解质的浓度以实现与脂质体内部中的等渗性或等-同渗质量摩尔浓度(或至多约50至约100mmol/kg高渗)以防止它们皱缩或溶胀。在通过电分析仪施加的激发波形有一些增加的复杂性的情况下，也可使用溶出伏安法(strippingvoltammetry)进行根据本发明的电化学测量，使用例如脂质体包封的金属离子用于检测和测量。通常使用温和的、并希望基本不变的温度用于进行测定。用于所述测定和产生可检测信号的温度通常在约4-65。C的范围内，更通常在约20-38。C的范围内，更经常为约15-45°C。测试混合物用溶剂通常为水溶性介质，其可以是达到其它极性溶剂的约60wtQ/。，尤其是具有l-6个、更通常1-4个碳原子的溶剂，包括醇、甲酰胺、二甲基甲酰胺和二甲基亚砜、二噹烷等。通常，存在少于约30-40wt。/。的助溶剂。在一些情况下，根据样品性质，可由样品本身提供部分或全部水溶性介质。介质的pH通常在2-11的范围内，通常为5-9,并优选在约6-8的范围内。选择pH以保持结合成员结合亲合性的显著水平和信号产生系统的最佳信号产生。可使用各种緩冲剂获得所需的pH，并在测定期间保持所述pH。示例性緩沖剂包括硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、三羟曱基氨基曱烷(tris)、巴比妥等。使用的具体緩沖剂通常不是关键性的，但在各个测定中，可能与另外一个相比而优选一种緩沖剂。对于核酸分析物，必需选择合适的緩沖剂。这类緩沖剂包括SSC、氯化钠、柠檬酸钠緩冲剂和SSPE(氯化钠、磷酸钠、EDTA)。可利用包括样品制备模块和生物传感器模块的生物分析微系统执行这种方法。优选在微流体平台中制备整个系统。本发明的生物传感器的基本原理基于DNA/RNA杂交系统和脂质体信号放大(图1)。如图1中所示，两组探针特异性地与把RNA杂交。参考被设计以结合到四种Dengue病毒血清型的一般探针描述这种系统，并设计四种特异性探针只结合到所述四种血清型上(Wu等，"DetectionofDengueViralRNAUsingaNucleicAcidSequence-basedAmplificationAssay",J.Clin.Microbiol.39:2794-2798(2001),本文引入其全文作为参考)。报道探针被偶联到具有包封的焚光染料或电化学活性化合物的脂质体上，并可杂交到靶RNA的特异性序列上。第二特异性探针(捕获探针)通过生物素-抗生蛋白链菌素相互作用被固定到超顺磁微珠的表面上。利用等温核酸序列基扩增("NASBA")反应扩增靶RNA。在引入混合物到微通道前，利用扩增的耙序列培育具有报道探针的脂质体和具有捕获探针的珠，夹层复合体随后被捕获到磁体上面用于荧光或电化学检测。本发明的微流体设备可以经设计以进行信号检测的焚光或电化学方法。构建微流体设备的途径基于在体积和流速方面提供精确的样品处理、在进口和出口点处的零死体积(在分析期间没有样品损失和100%废物处理)、拆卸设备以替换微流体通道或变换器零件的能力。如同以前在开发用于Dengue病毒检测的基于膜剥离的生物传感器中进行的试验中所优化的，使用脂质体、Dengue病毒RNA、报道和捕获探针以及杂交和洗涤緩冲液(Baeumner等,"ABiosensorforDengueVirusDetection:Sensitive,RapidandSerotypeSpecific",AnalyticalChemistry,74(6):1442-1448(2002)和Zaytseva等，"Multi-AnalyteSingle-MembraneBiosensorforSerotype-SpecificDetectionofDengueVirus",Anal.Bioanal.Chem.380:46-53(2004),本文引入它们的全文作为参考)。可使用标准光刻方法在4英寸硅酮晶片上将微流体通道制造成凸起结构。将lmL新制备的体积比为7:1的硅酮弹性体和硅酮弹性体固化剂的混合物(Sylgard,184硅酮弹性体试剂盒)倒入到硅酮;f莫板上并用另一平的硅酮晶片盖住。用硅酮晶片盖住得到的聚二甲基硅氧烷(PDMS)层允许控制层的厚度和厚度均匀性。在65。C的烘箱中固化得到的夹层结构(图2)2小时。从晶片上剥离固化的PDMS层，人工切出通道。PDMS层为170微米厚。通道为50mm深，宽度从100微米变化到500孩t米。本发明微流体设备中使用的微流体通道应满足以下要求1)通道的几何形状和尺寸应适合在液流进入它时避免液流中大的压降。根据试-睑，发现100微米宽、50微米深通道满足这个要求；2)通道应具有小的区域，与它其余部分相比，该区域具有5倍慢的线性流体流动。在这个区域中，捕获在分析中使用的磁珠。信号变换器被放置在捕获珠区域的下游；和3)具有嵌入通道结构的PDMS层应具有垂直经过PDMS整个宽度并具有不大于邻近通道宽度的直径的进口和出口孔。为了避免分析期间出现一定体积的停滞流，尤其需要这些合适的进口尺寸。具有微米尺寸的典型通道几何形状提供在图3中。图3A和3B显示了本发明的2种实施方案，其中每一个都具有通往检测段106并最终到达出口110的进口102和108。在图3A中，进口102具有迂回区域104，其给予正通过的材料更多的停留时间来进行反应。具有嵌入通道24的PDMS22的形成显示在图2A-2B中。如图2A中所示，通过在顶模板T和底模板B之间模塑形成具有嵌入通道24的PDMS22。PDMS22形成有沿PDMS22—个表面纵向暴露的嵌入通道24。通过从才莫板T和B中取出可恢复这种结构，如图2B中所示。具有嵌入通道24的PDMS22被安装到玻璃板26上形成单元20,如图4中所示。这种安装使PDMS中纵向暴露的通道24被玻璃板26盖住。对于利用荧光检测的微流体设备，玻璃板26是透明的。在电化学检测的情况下，玻璃板26设有图案化的交指型超微电极阵列(IDUA),其与通道24流体连通，从而通过通道24的材料可^皮IDUA接触和分析。通过从上面PDMS层22和下面玻璃板26施加压力实现不漏密封。为此，使用两个板28和4-8个螺钉30,如图5中所示。在光学检测的情况下，至少靠近玻璃板26的板28是透明的，以允许在通道内可视。或者，可在板28和玻璃板26之间安装光学检测设备。应注意，上板具有胶合到与PDMS设备的进口102和出口110对直的位置内的管32和34。施加到PDMS-玻璃板设备上面的压力也为PDMS-Plexiglas界面提供了密封。开始时，在Plexiglas进口和出口孔中使用金属管。但是，由于电化学检测中高的本底信号，因此用塑料管代替它们。为了容纳捕获区中分析期间捕获磁珠所需要的磁体，可在上Plexiglas板中做槽。通过槽的深度和PDMS层的厚度可精确控制磁体和PDMS通道上壁之间的距离。这些参数和磁场强度对在变化的流速下在分析期间定量捕获珠的能力有很大影响。磁体位置相对于微通道上壁越近，在分析过程中就可使用越高的流速。在本发明的微流体设备中，磁体(35DNE1304-NI,MagnetApplications,Inc.)被放在离通道上壁270|um的距离处。这使得所有珠(l|iim直径)以0.2m/min或5|iiL/min的线性流速被捕获。上述结合材料的使用p)'。i场产生设备或具有结二材料的过滤器是尤其的捕获载体。尤其;尤选使用磁珠作为捕获载体，同时捕获设备包^磁场产生设备。在这种实施方案中，如图i中所示，在允许靶结合到捕获探针上的条件下，使具有对靶材料有特异性的捕获探针的顺磁颗粒接触可能包含靶材料的样品。然后用磁体从样品混合物中除去得到的复合体。当选择代替磁场产生设备的过滤器时，必须改变图5的排列使得过滤器与通道24相通。优选地，它们可处于相对于进口102和出口108与》兹体36位置对齐的位置(这不会存在于这类实施方案中)。当使用过滤器作为捕获设备时，可使用孔尺寸为约O.lpm-约100jum、优选约lpm-约30pm的允许水性介质从中流过的任何多孔材料。孔尺寸对设备性能有重要影响。孔尺寸必须大于标记物的平均直径。另外，孔不应太大，以便可得到良好的体积对表面比和阻止磁珠、聚合物珠或二氧化硅珠偶联到捕获探针上。另外，过滤器可用作常规过滤器和截留大的颗粒。因此，结合到二氧化硅或其它颗粒上的脂质体(二氧化质:将通过过滤器。、、因此，、可利用截留:^滤器上的经由把结合到二氧化硅或其它颗粒上的脂质体数量测量存在的耙数量。本发明的设备和方法的合适过滤器膜包括硝基纤维素膜、硝基纤维素混合酯、聚酯膜、基于聚磺酰基的膜、普通滤纸、玻璃纤维膜和具有规定孔尺寸的任何塑料材料膜，如聚碳酸酯过滤器、多孔金和多孔磁性材料。还可使用微制造工具使用光刻胶材料，如SU-8或者以及PDMS，直接在微通道内内部制造。过滤器膜可具有各种形状，包括矩形、圆形、椭圆形、或者三角形等。当使用本发明的光学检测实施方案时，光学标记物被固定在脂质体中。合适的光学标记物包括荧光染料、可见染料、生物-或化学-发光材料、量子点和酶标记物。当使用可见染料作为标记物时，可用肉眼进行所关心的分析物存在或数量的定性或半定量测量。对于半定量测量，可将颜色强度可视地与一系列参考标准如在比色图表中比较。或者，当需要较大的精确度时，或当使用的标记物需要仪器分析时，可使用定量仪器如反射计、荧光计、分光光度计、电分析仪等在膜上直接测量标记物的强度。当使用脂质体作为颗粒时，可以无需裂解脂质体来测量存在的标记物材料的数量。但是，可利用裂解以增强这种可视性。这可通过应用脂质体裂解剂来完成。合适的脂质体裂解材料包括表面活性剂如辛基吡喃葡糖苷、二氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、皂角香、Sigma以商标Tween-20出售的聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯和Sigma以商标TritonX-100出售的非离子表面活性剂，其为叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。对于许多测定，辛基吡喃葡糖苷是优选的裂解剂，因为它能快速裂解脂质体而且似乎不干扰信号测量。或者，可利用脂质体的补充裂解，或可用电、光、热或其它物理手段使脂质体破裂。使用光学检测的本发明实施方案的合适布置显示在图7-8中。操作时，如图8中具体显示，通过进口102注入测试混合物，测试混合物包含可能含有耙分析物的测试样品、包括顺磁珠的捕获缀合物和标记缀合物。从进口102引出的通^各可具有迂回构造104以为这些反应物提供更多的停留时间来彼此接触，允许形成包括靶分析物、捕获缀合物和标记物的产物复合体。一旦测试混合物达到磁体112,产物复合体就被固定。将洗涤液注入到最终通往石兹体112的进口102(或108)内，从而可处理固定的产物复合体以除去未结合的标记物(例如脂质体)，通过出口110将其排出。如果磁体U2位于光学检测区域106中，则可利用固定在磁体112上的洗涤产物进行这种光学检测。或者，不管检测区域106是位于磁体112处还是其下游，都可例如用通过进口108注入的试剂来处理固定的产物复合体以释放标记物。例如，如果标记物为包含荧光染料的脂质体，则将能破坏脂质体的试剂通过进口108注入。因此，可通过光阅读器检测测试样品中耙分析物的存在。如果检测区域106在磁体112上游，则也可通过在标记物释放后在通道内造成反流条件来实现这种4佥测。可使用标准光刻和脱离技术在玻璃晶片上制造交指型超微电极阵列("IDUA")。通过在图案化Pyrex玻璃晶片(7740,Corning,NY)上蒸发沉积70nmTi然后是500nmAu制备典型的IDUA。研究了不同尺寸的IDUA在六亚铁/铁氰化钾对，Fe2+/Fe3+(CN)6,的氧化-还原反应中作为信号转换器。表明本底噪声和特异性信号两者都取决于微电极的指/间隙比以及指的总数量(Min等，"CharacterizationandOptimizationofInterdigitatedUltramicroelectrodeArraysasElectrochemicalBiosensorTransducers",Electroanalysis,16(9):724-729(2004)，本文引入其全文作为参考)。设计有3.8)am宽指和2.5pm宽间隙并具有总计1000个电极指的IDUA在灵敏性和信噪比方面表现出最佳特性。IDUA的典型微观照片提供在图6中。上述一般原理已用于设备组装。使用在玻璃板上制造的IDUA作为电化学信号检测方案的信号转换器。组装过程中，以IDUA检测区位于捕获区下游的方式将PDMS通道定位于玻璃上。另外，PDMS通道应在有源微电极指的上面(图10)。当使用本发明的电化学检测实施方案时，在标记物例如脂质体中包封电活性物种，如六亚铁氰化钾和六铁氰化钾。将微通道放置在可重复使用电极如上述交指型电极阵列的上面。在脂质体裂解后，测定电活性物种的数量。合适的电化学标记物以及选择它们和使用它们的方法公开在例如以下专利中Durst等的美国专利5789154、Durst等的美国专利5756362、Durst等的美国专利5753519、Roberts等的美国专利5958791、Durst等的美国专利6086748、Durst等的美国专利6248956、Roberts等的美国专利6159745、Roberts等的美国专利6358752和2002年10月2曰提交的待审美国专利申请序列号10/264159,本文引入它们的全文作为参考。简单地说，测试设备可被设计用于电活性标记物的电流测定或量化。在这种实施方案中，测试设备包括在微流体设备中的工作电极部分、参比电极部分和反电极部分。工作电极部分、参比电极部分和反电极部分各自适合经由到恒电位仪的接线彼此电连接。测试设备可改为包括工作电极部分和反电极部分。或者，微流体设备可被设计用于电活性标记物的电势测定或量化。在这种实施方案中，设备包括指示电极部分和参比电极部分。指示电极部分和参比电极部分适合电连接到电位仪上。在另一实施方案中，测试设备可包括交指型电极阵列，所述阵列经定位以在脂质体裂解时诱导从脂质体释放的电活性标记物的氧化还原循环。合适的电活性标记物为具有电化学活性但不降解颗粒(例如脂质体)或以其它方式浸出颗粒的那些。它们包括金属离子、有机化合物如醌、酚和NADH,和有机金属化合物如衍生的二茂铁。在一种实施方案中，电化学标记物为可逆氧化还原对。可逆氧化还原对由如下化学物种组成对于所述化学物种而言，异相电子转移速度(heterogeneouselectrontransferrate)快并且氧化还原反应表现出最小的超电势。可逆氧化还原对的合适例子包括但不限于二茂铁衍生物、二茂镥(fe画im腦)衍生物、二茂铁衍生物和二茂输(fe薩in讓)衍生物的混合物、氯化铜、氯化亚铜、氯化铜和氯化亚铜的混合物、钌-三-双吡咬、六亚铁氰化钾、六铁氰化钾、以及六亚铁氰化钾和六难失氰化钾的混合物。优选地，电化学标记物被包封在脂质体内，在双层中或附着到脂质体膜表面上。使用电检测的本发明实施方案的合适布置显示在图9和10中。工作时，具体如图10中所示，测试混合物包括可能含有靶分析物的测试样品和捕获缀合物102。同样，尽管在图IO中未示出，但从进口彼此接触，从而允许形成包括靶分析物、捕获缀合物和标记物的产物复合体。一旦测试混合物达到磁体112,产物复合体就被固定。将洗涤液注入到最终通往磁体112的进口102内，从而可处理固定的产物复合体以除去未结合的标记物(例如脂质体)。如图IO所示，当包含IDUA114的电才佥测区域106位于》兹体112下游时，则可利用通过进口108注入的试剂处理固定的产物复合体以释放标记物。例如，如果标记物为包含荧光染料的脂质体，则将能破坏脂质体的试剂通过进口108注入。因此，可通过IDUA114检测测试样品中耙分析物的存在。IDUA114由分别从连接器120和122伸出的交指型指116和118形成。如上文所示，所述测定可为定性的(存在或不存在一定含量的靶)或定量的或半定量的。从本文教导中，认为合适标准物和/或标准曲线(术语"标准曲线"以通用含义使用，包括比色图表)的制备在本领域那些技术人员的范围内。在一种实施方案中，测试设备包括多个捕获部分，其中每一个都被改进以结合对数种分析物中的一种有特异性的与众不同的第二结合材料。因此，可通过分配每种缀合物/分析物到它自身的浓度测量部分并测量来确定每种分析物。或者，在本发明的这种实施方案中，要被确定的每种分析物的缀合物可包括和其它标记物可以区别检测出来的标记物。利用不同的包封的染料(例如焚光染料)或量子点，测定结果可为"色彩编码的"。特别地，可在捕获部分中使用多波长检测器。为方便起见，本设备可以以与预定数量的用于测定一种分析物或多种分析物的试剂的包装组合被提供在试剂盒中。试剂盒内包括稳定剂、緩冲剂等。可宽范围地改变各种试剂的相对数量，以提供能大大优化测定灵敏度的试剂溶液的浓度。试剂可作为干粉被提供，通常为冻干的，包括赋形剂，其在溶解时提供具有进行测定的合适浓度的试剂溶液。试剂盒或包装可包括其它组分，如所述一种或多种分析物的标准物(具有已知分析物浓度的分析物样品)。如上所述，本发明的方法和设备可用在各种测定中，如竟争结合测定和夹心法测定，如以下专利中所述Durst等的美国专利5789154、Durst等的美国专利5756362、Durst等的美国专利5753519、Roberts等的美国专利5958791、Durst等的美国专利6086748、Durst等的美国专利6248956、Roberts等的美国专利6159745、Roberts等的美国专利6358752、2000年10月27日提交的待审美国专利申请序列号09/698564和2002年10月2日提交的待审美国专利申请序列号10/264159，本文引入它们的全文作为参考。本发明的另一方面涉及检测或量化测试样品中分析物的方法，如下该方法包括提供至少一种测试混合物，测试混合物包括可能包含分析物的测试样品、包括捕获载体和第一偶联组中第一成员的捕获载体复合体、经选择以与分析物的一部分结合并包括所述第一偶联组中第二成员的第一结合材料、包括颗粒、标记物和第二偶联组中第一成员的标记复合体、和经选择以与分析物的不同于针对其选择第一结合材料的那部分之外的一部分结合并包括第二偶联组中第二成员的第二结合材料。该方法也包括提供微流体测试设备用于检测或量化测试样品中的分析物。测试设备包括非吸收性基底，基底具有从中延伸的至少一个进口和出口，其中进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接，和其中所迷至少一个微通道包括进口部分和分析部分。测试设备还包括位于分析部分处或其上游的非特异性捕获设备。测试设备还包括延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构。在微流体测试设备内，允许反应在所述至少一种测试混合物中在第一偶联组的第一和第二成员之间、在第二偶联组的第一和第二成员之间和在测试样品中存在的分析物和第一与第二结合材料之间发生。结果，形成包括测试样品中存在的分析物、捕获载体复合体、第一结合材料、标记缀合物和第二结合材料的产物复合体。使反应过的测试混合物接触到非特异性捕获设备(例如对捕获载体具有非特异性亲合力的设备)，于是从反应过的测试混合物中固定反应过的测试混合物中存在的产物复合体。在微流体测试设备分析部分处检测固定的产物复合体中标记物的存在或数量，并分别与测试样品中分析物的存在或数量关联。在优选实施方案中，标记物在接触前和在检测步骤后从固定的产物中释放。用于进行本发明这方面的部件和步骤与上述那些基本相同。本发明的另一方面涉及检测或量化测试样品中分析物的方法，如下该方法包括提供至少一种测试混合物，测试混合物包括可能包含分析物的测试样品、捕获缀合物(包括捕获载体和第一结合材料)和标记缀合物(包括颗粒、标记物和分析物类似物)，其中选择第一结合材料以与分析物的一部分结合。该方法也包括提供微流体测试设备用于检测或量化测试样品中的分析物。测试设备包括非吸收性基底，基底具有从中延伸的至少一个进口和出口，其中进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接，和其中所述至少一个微通道包括进口部分和分析部分。测试设备还包括位于分析部分处或其上游的非特异性捕获设备。测试设备还包括延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构。在微流体测试设备内，允许在所述至少一种测试混合物中在泪'J试样品中存在的分析物和所述分析物类4以物之间针对第一结合材料发生竟争。结果，形成包括捕获缀合物和标记缀合物的产物复合体。使反应过的测试混合物接触到非特异性捕获设备(例如对捕获载体具有非特异性亲合力的设备)，于是从反应过的测试混合物中固定反应过的测试混合物中存在的产物复合体。在分析部分处检测固定的产物复合体。将固定的产物复合体中标记物的存在或数量分别与测试样品中分析物的存在或数量关联。在优选实施方案中，标记物在接触前和在检测步骤后从固定的产物中释放。在本发明的这种实施方案中，使用分析物类似物，因为这种实施方案涉及竟争结合测定形式。因此，术语"分析物类似物，，意在包括结合到捕获缀合物上的类似物。但是，当使用类似物时，在竟争反应中被第一结合材料识别所需要的分析物特定特征必需存在于与标记物复合体结合的分析物类似物中。在所有其它方面中，用于进行本发明这方面的部件和步骤与上述那些基本相同。本发明还涉及微流体设备(在本文中也称为再循环微流体设备、微流体混合设备等)。该设备包括非吸收性基底和一个或多个固定式混合结构，非吸收性基底具有从中延伸的至少一个进口和出口。至少一个进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接。所述一个或多个固定式混合结构延伸到所述至少一个微通道内。在所有其它方面中，用于进行本发明这方面的部件和步骤与上述那些基本相同。在一种具体实施方案中，微流体设备能再循环微升体积。设备的这种实施方案包括具有玻璃盖密封的压力进口和出口孔的模制聚二曱基硅氧烷(PDMS)通道。通过在多重锯齿结构上反复改变流向实现再循环。锯齿结构用于根据流体在结构上是向后流还是向前流而不同地改变单个流线的流体速度。按照这种方式，可相对于其它流线加速或减速单个流线以允许流体段相互作用，其通常是被线性分割的。低雷诺数表明过程可逆，忽略扩散。使用荧光指示剂确认数值模拟。发现羧基荧光素标记的DMSO塞和未标记的DMSO塞在不混溶烃塞上的混合在7.1min后在具有锯齿结构的通道内达到稳态，而在没有锯齿结构的通道内是在34.8min后，这验证了根据数值模拟会预期到的结果。实施例实施例1-使用荧光检测法研究脂质体裂解通过图8中所示和上述的微流体设备的进口102,引入包含珠-靶RNA-脂质体的复合体的样品混合物。通过进口102注入包含包封磺基罗丹明B(sulforhodamineB)的脂质体、磁珠、靶RNA和杂交緩沖液(60%曱酰胺、6xSSC、0.8%Ficoll型400、0.01%TritonX-IOO、0.15M蔗糖)的混合物。通过注入洗涤緩沖液(10%曱酰胺、3xSSC、0.2%Ficoll型400、0.01%TritonX-IOO、0.2M蔗糖)到入口102中从未结合的脂质体上洗涤被捕获的珠。此时，可使用连接到荧光显微镜的CCD相机检测信号。曝光时间被优化(l秒)，并使用ImageProExpress软件分析信号。或者，为了通过裂解脂质体和得到因释放磺基罗丹明B染料引起的明显更高的荧光信号而增加信噪比，将25mM|3-辛基吡喃葡糖苷(OG)的溶液注入到进口108内进行脂质体裂解。利用连接到显微镜上的CCD相机测量脂质体释放的染料的荧光强度。可在预定程序的0.01-80nL/min体积流速下操作设备。检测未裂解的(图16A)和裂解的(图16B)脂质体的荧光。实施例2-微流体通道中RNA4企测的优化进行一系列试验以优化在微流体通道中的RNA检测。在没有任何脂质体裂解的情况下进行这些试验，并使用荧光显微镜监测。针对信噪比优化具有固定的报道探针的脂质体的数量(对于在PBS+蔗糖緩冲液中1/100稀释，OD值为1.61,緩沖液pH7.0,同渗质量摩尔浓度630nmol/kg)(图17)、具有固定的捕获探针的珠(图18)和洗涤缓沖液(至多14pL)。因此，得到Dengue病毒RNA分析的检测极限。报道探针的量为脂类总量的0.013mol%。按照生产商规程，将生物素化的捕获探针固定在珠(DynabeadsMyOneStreptavin)表面上。lmg珠结合大约3000pmol的游离生物素。实施例3-微流体设备中脂质体捕获的电化学分析为测试樣i流体系统中的IDUA响应，如图10中所示，以ljil/min的流速将不同体积(20nL-100nL)的10pM六铁氰化钾/六亚铁氰化钾溶液注入到进口108内，而緩沖溶液以l|ul/min的流速通过进口102被引入。单次连续运行中IDUA响应的典型结果提供在图20中。这些结果表明，基于IDUA的系统确实能快速响应通道内的电化学组成变化。注射和达到的最大信号之间的延迟时间为约5-7秒。在全部试验中，IDUA自身都表现出良好的可再现性和能长时间工作而不需要机械清洗的能力。利用电化学检测的RNA分析的典型结果提供在图21中。在这个试验中，用l|dg附有捕获探针的超磁珠和脂质体(150mM六铁/亚铁氰化钾包封剂溶液)培育2^1Dengue血清型4扩增子(1:100稀释)。将杂交混合物以3pl/min注入到进口102内。在全部珠被捕获到磁体上后，用15|ul緩冲液洗涤，将25mM的OG溶液以0.8|ul/min注入到进口108内裂解脂质体。在杂交混合物中存在和不存在RNA时IDUA的电化学响应提供在图21中。可在其峰值处或以整个曲线的积分值估计IDUA对RNA存在的信号响应(表l)。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>开发了通过病原体的核酸序列来高度特异性和敏感性检测病原体的微流体生物传感器。生物传感器模块利用两种可替换的检测方法，荧光或电化学方法。微制造方法允许使用微升量的试剂进行单次分析。利用Dengue病毒靶序列模型测试和优化微流体系统。表明使用微流体平台、荧光检测方法和未裂解的脂质体可检测低至0.5fmol的合成靶。实施例4-具有新型锯齿结构的再循环被动式微混合器在该实施例4中和在下面的实施例5-9中，描述了能再循环毫微升至微升体积以便有效混合溶液的微流体设备有关的试验数据。设备由模制的聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道构成，所述通道具有用玻璃盖密封的压力进口和出口孔。通过多重锯齿结构上的反复往复流实现再循环。锯齿结构用于根据流体在结构上是向后流还是向前流而不同地改变单个流线的流体速度。因此，可相对于其它流线加速或减速单个流线以允许流体段相互作用，所述流体段通常是被线性分割开的。低雷诺数表明过程可逆，忽略扩散。使用FLUENT(Fluent,Inc.)进行计算机才莫拟。随后，使用荧光指示剂从试验上证实再循环原理的这些数值模拟。最后，研究跨越不混溶烃塞的羧基焚光素标记的DMSO塞和未标记的DMSO塞的混合。在经过5个锯齿单元的lHz循环率下，记录通道中达到稳态的时间，即直到两个DMSO塞都具有相同的荧光强度。在锯齿结构情况下，比在没有锯齿结构的通道中5倍快达到稳态，这证实了基于数值模拟所预期的结果。微流体混合器是独特的，因为它在按比例缩放方面的通用性、还能混合包含小颗粒如珠和细胞的溶液方面的潜力，以及易于制造和使用。实施例5-微流体混合器的制造4吏用L-Edit(TannerResearch,Inc.)CAD软件设计樣i流体结构，并使用硅母模和PDMS弹性体(DowCorning,Corning,NY)制造。在Cornell-NanoScaleScienceandTechnologyFacility通过DRIE在光刻胶图案化的100mmSi晶片内形成模具。清洗后，倒入TeflonAF(601S1-100-6),旋转，并在烘箱中在17(TC固化30分钟。通过将7份PDMS弹性体和1份固化剂倒在平整的硅模具上至lmm厚度并在真空烘箱中在0.5bar在6(TC下焙烧55分钟，形成通道。固化后，使用打孔器在PDMS中打出0.75mm孑L。然后将PDMS切成独立通道，使用Tesla线圈氧化，并放置接触清洁的玻璃盖，在玻璃盖处使其停留至少30分钟以永久密封。使用丙烯酸树脂底座和盖来紧闭通道，并将它们精确地与一组压力进口和出口对齐(图22)。一个进口连接到KDScientific型210注射泵上。实施例6-混合试-睑羧基焚光素得自Sigma-AldrichCo。DMSO得自FisherScientific。矿物油得自本地。在纯DMSO和lmM羧基荧光素标记的DMSO的流之间注入矿物油塞，在所述塞的两侧都有具有羧基荧光素标记的DMSO的流，使用Leica型DMLB显微镜和Coolsnap相机和软件包观察，曝光时间为ls，使用300WUV弧光灯，随后只使用自动对比和自动校平功能在Photoshop7.0(AdobeSystems,Inc.)中增强颜色。实施例7-模拟使用FLUENT软件(Fluent,Inc.)进行才莫拟。使用GAMBIT(Fluent,Inc.)构建网眼。冲莫拟具有固定壁和压力进口-出口口的二维通道。使用才莫拟的颗粒注入追踪在140lum通道长度和50jam通道宽度上的三十个流线(在进口和出口处，在锯齿顶端处25|um)。应注意，模拟的结构仅仅是一个锯齿单元(出于计算实践性的原因)，而试验设备由200个锯齿单元构成，每个150jum长，在3cm通道上连接在一起，总体积为大约0.5nL。制造具有更大长度的相同设备，以便容納约15pL溶液。实施例8-结果和讨论具有新型锯齿结构的再循环被动式微混合器设计微混合器的锯齿结构以使微通道中的溶液基于再循环来混合。因此，通过反复往复溶液流，部分溶液将相对于它们相邻的体积元被重新定位。通过产生平行于通道长度的横流发生混合，从而可使通道不同长度处的流线段可以彼此接触。使用利用GAMBIT和FLUENT的计算模拟来理解锯齿单元对流动分布的影响。图23显示了从上面观察的向左和向右流的二维速度分布。冲莫拟中两个通道入口处可见的形成区是由于通道外部的有限尺寸模型假设(le-2m/s的恒定流速)。抛物线型流动分布发展到通道内大约10pm，距离必须考虑锯齿单元的影响还很远(wellbeforetheeffectsofthesawtoothunitmustbeconsidered)。各个流线速度和它们的分布显示在图24和25中。每个流线的最大速度值提供在表2中，为了比较，最高速度流线(中间，右至左流)指定为100%的值。表2-显示了六个流线中每一个的最大速度、每个流线和最高速度流线之间的差异百分数。最高速度流线是R至L中间流线。使用这个速度作为参比点用于与其它流线速度比较并因此设定为100%。最大流线速度[m/s]R至L中间流线速度的百分数[%]<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>选择三种流线用于分析锯齿单元对流线的分隔效率。这三个流线代表通道中不同的位置，即在上部四分之一中(x=0pm,y=0.75*50pm)、通道中间(x=0|um,y=0.50*50^m)和下部四分之一(x=0fim,y=0.25*50|um)。由于压力驱动的微流体系统的抛物线型流动分布，"中间"流线具有最高速度。在左至右流中，与右至左流相比，观察到在"下部"和"中间"流线速度中每个锯齿单元10%的显著降低。正是这种在向右和向左流动分布中的差异允许产生基于平行于通道长度的横流的独特再循环混合。基于流动模型研究的发现，通过改变单元长度和锯齿角度设计最佳锯齿混合器。锯齿角度以5。增量从20。变化到70°,长度以2.5|iim增量从10pm变化到40nm。选择45。的最佳角度和25pm的最佳长度。随后使用标准光刻和软刻工艺制造设备。组装由粘结到玻璃盖上的成型PDMS组成的微流体系统，并使用机械加工的丙烯酸树脂组装连接到KDScientificModel210注射泵上，如图22B中所示。选4奪PDMS作为弹性材料，因为需要的零件尺寸在这种材料中容易实现。单个泵用于微混合器，以便简化最终设计的要求。因此，使用流体流的正和负压。通过在整个微通道上施加压力梯度，形成抛物线型流分布。发现具有未氧化PDMS的设备在正压流下泄漏。因此，通过使用Tesla线圏氧化来改性PDMS的表面以允许永久粘结到玻璃盖上，这形成足够强的粘结以允许从相同口施加正和负压。理论上，产生图24和25中所示改变的流线速度分布的向右(向前)和向左(向后)流之间的背压差异，将引起溶液的实际再循环混合。对此i殳计两个试-睑来证实。首先，z使用双溶液系统，以证实在向前泵送方向上留在锯齿结构后的溶液会在向后泵送方向期间祐j兆选到流体的不同体积位置中。因此，使用这样的系统，其具有用烃塞隔开的两个羧基荧光素标记的DMSO的塞。烃和DMSO之间;敗性的差异防止了这两种溶液单独通过扩散混合。认识到DMSO/烃塞的表面张力和粘度与最终要在设备中混合的水溶液有很大不同。但是，目标是以可视方式证实再循环混合器原理，因此不混溶塞体系对于完成此是最方便的。典型的试验显示在图26中，其显示了在羧基荧光素标记的DMSO的两个大得多的塞之间向右然后向左移动的烃塞的时间流逝图象。尽管在理论上预测的再循环难以在这个具体图象中观察到，但基于锯齿结构的锐角中保留的样品可观察到再循环混合的替代形式；流体被临时捕集在这个锐角中，并随开始不在附近的体积元一起自由扩散。在第二个试验中，进行再循环过程的照相研究，以便证实锯齿结构通过混合两个DMSO塞产生的再循环的存在，两个DMSO塞中一个用荧光标记，一个未标记，各占通道的一半。然后以lHz的频率才黄跨锯齿结构前后快速移动流体(以10lul/min的设定流速)。在这个过程中，取200口m段的照片(图27A)。在给定时间，可观察到至少四种不同的荧光强度，其对应于四种不同的荧光指示剂浓度。这图示在图27B中。同一200ium窗口中这四种不同浓度的存在可以通过再循环得到最佳解释。最后，将微混合器的混合效率与在通道长度、高度和宽度方面具有相同尺寸的直线型通道(没有锯齿单元的通道)相比较。将烃塞注入在两个DMSO流之间，不过这次只焚光标记一个DMSO流。因此，第二个DMSO塞中荧光的出现同样为基于不同流线间混合的再循环混合原理的指示。达到相同焚光强度的均匀荧光DMSO塞所需要的时间是混合效率的指示。通过利用由未标记的DMSO/烃/羧基荧光素标记的DMSO组成的塞在PDMS通道中保持不动48小时，确定通过溶液塞的扩散是不明显的。在48小时结束时，未标记的DMSO仍没有表现出荧光。在表3中，通过提供达到稳态需要的时间汇总了得到的典型试验数据，达到稳态需要的时间被定义为在经过5个锯齿单元(在直线型通道中750pm)的大约lHz连续混合下，两个DMSO塞表现出相等荧光所需要的时间量。表3-达到稳态的时间在大约1Hz下前后横跨5个锯齿单元，混合由未标记的DMSO/烃/羧基荧光素标记的DMSO组成的塞。稳态被定义为最初未标记的DMSO塞中荧光水平等于最初羧基荧光素标记的塞中荧光水平所需的时间。"直线型"通道为具有与锯齿通道等同尺寸的微通道，没有锯齿元件。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>实施例9-结论具有新颖锯齿结构的再循环被动式微混合器混合过程中的再循环对于许多微流体应用如酶催化反应、杂交和结合反应是必需的。这可通过本文描述的锯齿结构容易地实现。利用结构得到再循环，因为这些结构在向后和向前流中引入不对称性，这种不对称性用于在邻近流线中的先前相邻元之间引入分隔。通过流体建模和利用三个独立试验证实得到溶液再循环的事实。这个设计可在长度上容易地放大以容纳微升体积，并可在混合器段的任何一端承受更宽的直线型通道以允许全部溶液通过锯齿结构的整个长度。可利用锯齿放置上的更激进变化，如在通道两侧上放置锯齿、在单一通道中使用一个以上的锯齿长度、宽度和角度等。本文描述的微流体混合器是独特的，这是因为它在按比例缩放方面的通用性、还能混合包含小颗粒如珠和细胞的溶液的潜力、以及易于制造和使用。实施例10-电化学微流体生物传感器实施例10-15涉及关于本发明的电化学微流体生物传感器和再循环微流体混合器的试验。开发了用于检测核酸序列的电化学生物传感器(Goral等，"Electrochemicalmicrofluidicbiosensorforthedetectionofnucleicacidsequences",LabonaChip6(6):414-421(2006)，在此全文引入作为参考)。总之，首先将靶分子与被固定在顺磁珠上的捕获探针和缀合到脂质体上的报道探针杂交。脂质体包封了铁六氰化物和亚铁六氰化物，Fe2+/3+(CN)6。然后通过100pm通道泵送杂交溶液。将磁体放置在通道上以捕获磁珠。未杂交的脂质体将流过磁体并流出出口。然后向捕获区泵送包含表面活性剂辛基吡喃葡糖苷(OG)的溶液。一旦OG在捕获区中，通过核酸杂交结合到磁珠上的脂质体就裂解，释放氧化还原溶液到通道内。正好在捕获区下游，交指型超微电极阵列(IDUA)能测量与被捕获的脂质体浓度成比例的电流。剂量响应曲线估计lfmol合成DNA耙的检测极限。这种电化学检测系统的优点包括易于使用、节约成本和便携性。同等的荧光系统除了激发源和过滤器外还要求使用复杂的检测设备如光电倍增管或CCD相才几。实施例ll-微:流体混合器在微流体混合器上进行试验，微流体混合器可被包括在微流体设备的全部三个模块中，以便增强反应和结合动力学和避免基于扩散的限制。例如，研究了它的混合特性、更大尺寸的制造(从而能有效地进行NASBA和脂质体-RNA结合反应)和使用热压印而不是软刻(soft-lithogmphy)的制造。可设计生物传感器进行三种不同的步骤mRNA分离、RNA扩增和RNA检测。设计单一流通道样式适应全部三种步骤需要的特性(见图28)。因此，可串联使用具有一定独立改进的三个类似通道用于检测，这将简化成为单一设备的总体集成。选择lOO^mxlOOiLim的通道横截面尺寸，以便保持小的样品体积，产生更快的装载时间。这里研究的微混合器为允许溶液和溶液内分子在微通道层流区中快速混合的关键部件。将锯齿型微混合器(Nichols等，"Recirculating,passivemicromixerwithanovelsawtoothstructure",LabonaChip6(2):242-246(2006),本文引入其全文作为参考)的成比例形式(图29)设计到容积为IOiuL的通道内。通道引入各自5cm长并包含166个锯齿的20行。在出口上引入500|um宽度的检测区以允许放置IDUA(Goral等，"Electrochemicalmicrofluidicbiosensorforthedetectionofnucleicacidsequences"，LabonaChip6(6):414-421(2006)，本文引入其全文作为参考)，这只是检测步骤所需要的。还在检测区中引入第二个进口，以允许在RNA检测过程中引入另外的试剂。掩^t设计允许同时蚀刻两个独立的设备。靠近有锯齿的通道放置没有锯齿的通道，以便允许进行平行测定来比较混合效果。使用原始往复混合器完成了初步工作，往复混合器使用宽度为50^im的锯齿型通道，所述通道使用结合到玻璃显微镜载玻片上的聚二曱基硅氧烷(PDMS)主体。这种通道具有两个独立的进口和单个出口(图30)。—个进口加载DI水，而另一个进口加载50mM荧光素。荧光素的浓度高得足以经历自猝灭。因此，用DI水对荧光素的任何稀释都导致激发过程中荧光的增加。使用注射泵控制流量。两个进口的流速都为lpL/min。使用装有CCD相机的显微镜观察整个通道的荧光。随后使用Image-ProExpress(MediaCybernetics,SilverSpring,MD)量4IM象素强度。在第一个2厘米的锯齿之间的中点处测量像素强度(图31)。然后可在直线型和锯齿型通道之间进行并行比较。在与锯齿通道等同距离处进行直线型通道上的测量。并行比较表明，和仅仅依靠扩散进行混合的直线型通道相比，锯齿结构在更短的距离内混合溶液(图32)。还可使用横跨通道的不同距离处的像素强度的标准偏差作为荧光素浓度均匀性的度量(图33)。这种比较证实，当与直线型通道比较时，这种设计能有效作为静态混合器。实施例124敖流体设备:光刻该设备部分在CornellNanoScaleFacility(Ithaca,NY)制造。使用剥离光刻法(liftoffphotolithography)将通道的负片(negativeprint)蚀刻到硅晶片上。开始时，用底漆层然后是S1813光刻胶层涂敷空白晶片。焙烧步骤后，使用接触校准器(HTG系统in-HR，HybridTechnologyGroup)将掩模暴露到UV光下10秒。覆盖的掩模允许仅仅暴露通道结构之间的区域。UV光暴露的区域变得可溶于光刻胶显影剂。经过1分钟的9CTC暴露后焙烧，使用自动MIF300在1165显影器中使晶片显影以除去光刻胶的暴露区域，导致下面的硅被暴露。然后将晶片放在UnaxisSLR770中蚀刻通道。以大约2)um/min的速度蚀刻暴露于室内部感应耦合等离子/反应离子环境的硅。使蚀刻过程运行足够长时间以得到100|um深的蚀刻，产生该深度的通道高度。蚀刻后，用丙酮清洗晶片上任何残余的光刻胶。使用TencorP10表面光度仪证实通道高度和宽度。实施例13-微流体设备:热压印使用EV520HE半自动热压印系统将通道图案热压印到聚曱基丙烯酸曱酯(PMMA)基底内。这种系统允许控制的温度、高压缩力和高真空。PMMA^t夹在两个晶片之间，结构化晶片在上面，空白晶片在下面。将夹层结构放在两个温度控制的板之间。液压控制上板以提供所需的压缩力。在将室设到高真空后，在施加4000N力前加热上和下板到115°C。高温4吏PMMA软化，同时施加的力将通道结构压印到PMMA上面。高真空环境确保在软化PMMA中不会捕集空气泡而导致通道变形。在使上和下压板两者的温度达到10(TC前保持压缩15分钟。在软化温度以下，可释放压力而不会破坏新压印的通道结构。在使室压力正常后，取出PMMA,钻成进口和出口孔。实施例14-微流体设备:粘合有几种方法用于将两片PMMA粘合到一起同时保存通道。最常用的方法是热粘合(Yahng等，"Fabricationofmicrofluidicdevicesbyusingafemtosecondlasermicromachiningtechniqueandmu-PIVstudiesonitsfluiddynamics,，,JournaloftheKoreanPhysicalSociety47(6):977-981(2005);Li等，"Low-temperaturethermalbondingofPMMAmicrofluidicchips",AnalyticalLettersmicrochipimprintedwithstainlesssteeltemplate，，,JournalofChromatographyA1038(l画2):239-245(2004);和Keynton等，"Designanddevelopmentofmicrofabricatedcapillaryelectrophoresisdeviceswithelectrochemicaldetection"，AnalyticaChimicaActa507(1):95-105(2004),本文引入它们的全文作为参考，本文引入它们的全文作为参考，本文引入它们的全文作为参考，本文引入它们的全文作为参考)。该过程使用类似于热压印中所用设备的设备。两个加热的板将夹层的PMMA片加热直到它们软化。在压力下，软化允许两个塑料的界面熔合。这是粘合两个PMMA片的快速简单方法。缺陷在于在过程中观察到通道变形。用于热粘合的另一技术利用接近10(TC的理想粘合温度的优点。将两片PMMA紧紧夹在一起并浸在沸水中1小时(Kelly等，"Thermalbondingofpolymericcapillaryelectrophoresismicrodevicesinwater",AnalyticalChemistry75(8):1941-1945(2003)，本文引入其全文作为参考)。优点在于良好的热控制。缺点在于商业上可得到的PMMA依赖于生产商而具有不同的热性质。用OptixPMMA(Plaskolite,Inc.,Columbus,OH)测试这种技术，发现由于太高的温度而在通道中引起塌缩。这些粘合技术的条件将导致微混合器的锯齿结构变形并失去预定设计。因此，需要更低温度的技术。溶剂辅助热粘合包括在未结构化的PMMA片的表面上施加非常薄的溶剂层(Klank等，"C02-lasermicromachiningandback-endprocessingforrapidproductionofPMMA-basedmicrofluidicsystems",LabonaChip2(4):242-246(2002)，本文引入其全文作为参考)。当挤压到结构化片内时，溶剂将两个片熔合到一起。如果这在8(TC环境中进行，其低于未用溶剂塑化的PMMA的热变形范围，制成非常均匀的密封。为了在未结构化PMMA上具有非常薄的溶剂层，使用4500rpm的旋涂机3秒。由于PMMA的表面相当疏水，并且大多数溶剂是才及性的，因此首先用02等离子处理表面以便氧化表面。已表明这增加了PMMA表面的亲水性。使用通常用于通过电晕放电活化PDMS的Tesla线圈(型号BD-10A,Electro-TechnicProductsInc.,Chicago,IL)作为电源构建实验室设计的02等离子装置。将Tesla线圈的端点放置通过钻孔的橡胶塞子。然后将塞子放在PVC圓筒上，降低圓筒内的压力到低于100mbar。使用TantecCAM-Plus(Schaumburg，111.)水接触角计发现10分钟处理足以将水接触角从大约60度改变到42度。不使用丙酮作为溶剂，因为发现它太易挥发，并且在旋涂后几乎完全挥发。发现较高分子量溶剂，2，4-戊二酮，具有理想的挥发性(Wang等,"Towardsdisposablelab-on-a-chip:Poly(methylmethacrylate)microchipelectrophoresisdevicewithelectrochemicaldetection",Electrophoresis23(4):596-601(2002),本文引入其全文作为参考)。在等离子处理后，将未结构化的PMMA放置在旋涂机上。在PMMA上放足够的溶剂以完全覆盖表面。15秒后，以1250rpm旋涂PMMA6秒，包括变速时间。然后取下PMMA,并与结构化PMMA片夹在一起。然后将夹持的片放在80。C烘箱中l小时。实施例15-微流体设备:设备设置—旦设备被固化，就将进口和出口口插入到预先钻好的孔内。管由不锈钢构成，并通过环氧树脂固定就位。再次将设备放到80。C烘箱中保持24小时以确保任何剩余溶剂挥发。在0.5mm玻璃晶片上使用金沉积过程(Goral等，"Electrochemicalmicrofluidicbiosensorforthedetectionofnucleicacidsequences",LabonaChip6(6):414-421(2006),本文引入其全文作为参考)制造IDUA(图34)。使用金刚石尖端划片机从晶片上切割单独的IDUA至大约1.6cmx20cm的尺寸。只在检测设备上而不在核酸分离或NASBA设备上使用IDUA。尽管本文详细描绘和描述了优选实施方案，但对于相关领域的那些技术人员来说，在不脱离本发明精神的情况下作出各种改变、添加、替代等是显而易见的，因此，这些都被认为在下面权利要求中所限定的本发明范围内。权利要求1.用于检测或量化测试样品中分析物的微流体测试设备，包括非吸收性基底，所述基底具有从中延伸的至少一个进口和出口，所述进口和出口通过嵌在所述基底中的至少一个微通道连接，其中所述至少一个微通道包括进口部分和分析部分；位于所述分析部分处或其上游的非特异性捕获设备；和延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构。2.根据权利要求1的微流体测试设备，其中所述非吸收性基底由选自硅、石英、玻璃、聚曱基丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷和聚合材料中的材料形成。3.根据权利要求1的微流体测试设备，其中所述微通道还包括位于所述分析部分上游的培育部分。4.根据权利要求1的微流体测试设备，其中所述捕获设备在所述分析部分上游。5.根据权利要求1的微流体测试设备，其中所述捕获设备在所述分析部分处。6.根据权利要求1的微流体测试设备，其中所述捕获设备为磁场产生设备或过滤器。7.根据权利要求1的微流体测试设备，其中所述分析部分包括电化学检测组装。8.根据权利要求7的微流体测试设备，其中所述电化学检测组装包括电极阵列，所述电极阵列包括具有多个指的第一导体和具有多个指的第二导体，其中第一导体的指与第二导体的指交叉，第一和第二导体通过电压源和读出设备彼此电连接，并且所述阵列经定位以诱发电活性标记物的氧化还原循环。9.根据权利要求7的微流体测试设备，其中所述电化学检测组装包括基于微控制器的分析系统。10.根据权利要求1的微流体测试设备，其中所述分析部分包括光学检测组装。11.根据权利要求1的微流体测试设备，其中所述至少一个微通道纵向暴露在所述基底的表面上，所述微流体测试设备还包括附连在所述基底的所述表面上并盖住所迷至少一个微通道的盖板。12.根据权利要求1的微流体测试设备，其中有多个所述延伸到所述至少一个微通道内的固定式混合结构。13.根据权利要求12的微流体测试设备，其中所述固定式混合结构延伸不同长度到所述至少一个微通道内。14.根据权利要求12的微流体测试设备，其中每个微通道都具有相对侧，至少一些所述固定式混合结构沿着大体上彼此面对的方向从所述相对侧上延伸到所述孩i通道内。15.根据权利要求1的微流体测试设备，其中所述一个或多个固定式混合结构成倾角延伸到所述一个或多个微通道内。16.根据权利要求15的微流体测试设备，其中存在多个所述固定式混合结构，其中至少一些以不同角度延伸到所述一个或多个微通道内。17.根据权利要求1的微流体测试设备，其中每个微通道有多个进口。18.检测或量化测试样品中分析物的方法，包括提供至少一种测试混合物，包括测试样品，其中所述测试样品可能包含分析物；捕获缀合物，其中所述捕获缀合物包括捕获载体和第一结合材料，其中所述第一结合材料经选择以与所述分析物的一部分结合；和标记缀合物，其中所述标记缀合物包括颗粒、标记物和第二结合材料，其中所述第二结合材料经选择以与所述分析物的一部分结合，并且所述一部分不同于针对其选择第一结合材料的那部分；提供微流体测试设备用于检测或量化测试样品中的分析物，所述微流体测试设备包括非吸收性基底，具有从中延伸的至少一个进口和出口，所述进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接，其中所述至少一个微通道包括进口部分和分析部分；延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构；在所述微流体测试i殳备内，允许反应在测试混合物中在测试样品中存在的分析物和第一与第二结合材料之间发生，从而形成包括测试样品中存在的分析物、捕获缀合物和标记缀合物的产物复合体；使反应过的测试混合物接触非特异性捕获设备，由此从反应过的测试混合物中固定反应过的测试混合物中存在的产物复合体；在分析部分处检测来自固定的产物复合体的标记物的存在或数量；和将来自固定的产物复合体的标记物的存在或数量分别与测试样品中分析物的存在或数量关联。19.根据权利要求18的方法，其中通过在所述至少一个微通道中在相对方向上循环所述测试混合物来进行所述允许反应发生和所述接触。20.根据权利要求18的方法，其中第一和第二结合材料中的每一种都为抗体、抗原、核酸序列、适体或细胞受体。21.根据权利要求18的方法，其中分析物为耙核酸分子，第一结合材料为经选择以与一部分靶核酸分子杂交的捕获探针，第二结合材料为经选择以与靶核酸分子的一部分杂交的报道探针，并且所述一部分不同于针对其选择捕获探针的那部分。22.根据权利要求2]的方法，其中靶核酸分子存在于选自细菌、真菌、酵母、病毒、原生动物、寄生虫、动物和植物中的有机体中。23.根据权利要求18的方法，其中颗粒选自脂质体、胶乳珠、金颗粒、二氧化硅颗粒、枝状大分子、量子点、荧光分子、染料分子和磁珠。24.检测或量化测试样品中分析物的方法，包括提供至少一种测试混合物，包括测试样品，其中测试样品可能包含分析物；捕获载体复合体，其中捕获载体复合体包括捕获载体和第一偶联组中的第一成员；第一结合材料，其中第一结合材料经选择以与分析物的一部分结合，并且其中第一结合材料包括第一偶联组中的第二成员；标记复合体，其中标记复合体包括颗粒、标记物和第二偶耳关组中的第一成员；和第二结合材料，其中第二结合材料经选择以与分析物的不同于针对其选择第一结合材料的那部分的一部分结合，并且其中第二结合材料包括第二偶联组中的第二成员；提供微流体测试设备用于检测或量化测试样品中的分析物，微流体设备包括非吸收性基底，所述基底具有从中延伸的至少一个进口和出口，所述进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接，其中所述至少一个樣i通道包括进口部分和分析部分；延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构；在微流体测试设备内，允许反应在所述至少一种测试混合物中在第一偶联组中的第一和第二成员之间、在第二偶联组中的第一和第二成员之间、和在测试样品中存在的分析物和第一与第二结合材料之间发生，从而形成包括测试样品中存在的分析物、捕获载体复合体、第一结合材料、标记缀合物和第二结合材料的产物复合体；使反应过的测试混合物接触非特异性捕获设备，由此从反应过的测试混合物中固定反应过的测试混合物中存在的产物复合体；在分析部分处检测来自固定的产物复合体的标记物的存在或数量；和将来自固定的产物复合体中的标记物的存在或数量分别与测试样品中分析物的存在或数量关联。25.根据权利要求24的方法，其中通过在所述至少一个微通道中在相对方向上循环测试混合物进行所述允许反应发生和所述接触。26.根据权利要求24的方法，其中第一和第二结合材料中的每一种都为抗体、抗原、核酸序列、适体或细胞受体。27.根据权利要求24的方法，其中分析物为耙核酸分子，第一结合材料为经选择以与靶核酸分子的一部分杂交的捕获探针，第二结合材料为经选择以与靶核酸分子的不同于针对其选择捕获探针的那部分的一部分杂交的报道探针。28.根据权利要求27的方法，其中靶核酸分子存在于选自细菌、真菌、酵母、病毒、原生动物、寄生虫、动物和植物中的有机体中。29.根据权利要求24的方法，其中颗粒选自脂质体、胶乳珠、金颗粒、二氧化硅颗粒、枝状大分子、量子点、荧光分子、染料分子和磁珠。30.检测或量化测试样品中分析物的方法，包括提供至少一种测试混合物，包括测试样品，其中测试样品可能包含分析物；捕获缀合物，其中捕获缀合物包括捕获载体和第一结合材料，其中第一结合材料经选择以与分析物的一部分结合；标记缀合物，其中标记缀合物包括颗粒、标记物和分析物类似物；提供微流体测试设备用于检测或量化测试样品中的分析物，微流体测试设备包括非吸收性基底，所述基底具有从中延伸的至少一个进口和出口，所述进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接，其中所述至少一个微通道包括进口部分和分析部分；延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构；在微流体测试设备内，允许竟争在所述至少一种测试混合物中在测试样品中存在的分析物和第一结合材料用分析类似物之间发生，从而形成包括捕获缀合物和标记缀合物的产物复合体；使反应过的测试混合物接触非特异性捕获设备，由此从反应过的测试混合物中固定反应过的测试混合物中存在的产物复合体；在分析部分处检测来自固定的产物复合体的标记物的存在或数量；和将来自固定的产物复合体的标记物的存在或数量分别与测试样品中分析物的存在或数量关联。31.根据权利要求30的方法，其中通过在所述至少一个微通道中在相对方向上循环所述测试混合物进行所述允许反应发生和所述接触。32.根据权利要求30的方法，其中第一和第二结合材料中的每一种都为抗体、抗原、核酸序列、适体或细胞受体。33.根据权利要求30的方法，其中分析物为靶核酸分子，第一结合材料为经选择以与靶核酸分子的一部分杂交的捕获探针，第二结合材料为经选择以与靶核酸分子的不同于针对其选择捕获探针的那部分的一部分杂交的报道探针。34.根据权利要求33的方法，其中靶核酸分子存在于选自细菌、真菌、酵母、病毒、原生动物、寄生虫、动物和植物中的有机体中。35.根据权利要求30的方法，其中颗粒选自脂质体、胶乳珠、金颗粒、二氧化硅颗粒、枝状大分子、量子点、荧光分子、染料分子和磁珠。36.樣i流体设备，包括非吸收性基底，所述非吸收性基底具有从中延伸的至少一个进口和出口，所述进口和出口通过嵌在基底中的至少一个微通道连接，其中所述至少一个孩i通道包括进口部分，和延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构。37.根据权利要求36的微流体设备，其中所述非吸收性基底由选自硅、石英、玻璃、聚曱基丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷和聚合材料中的材料形成。38.根据权利要求36的微流体设备，其中所述至少一个微通道纵向暴露在所述基底的表面上，所述微流体测试设备还包括附连在所述基底的所述表面上并盖住所述至少一个微通道的盖板。39.根据权利要求36的微流体设备，其中有多个所述固定式混合结构延伸到所述至少一个微通道内。40.根据权利要求39的微流体设备，其中所述固定式混合结构延伸不同长度到所述至少一个微通道内。41.根据权利要求39的微流体设备，其中每个微通道都具有相对侧，至少一些所述固定式混合结构沿着大体上彼此面对的方向从所述相对侧延伸到微通道内。42.根据权利要求36的微流体设备，其中所述一个或多个固定式混合结构成倾角延伸到所述一个或多个微通道内。43.根据权利要求42的微流体设备，其中存在多个所述固定式混合结构，其中至少一些以不同角度延伸到所述一个或多个微通道内。44.根据权利要求36的微流体设备，其中每个通道有多个进口。45.根据权利要求36的微流体设备，其中每个通道有多个出口。全文摘要本发明涉及用于检测或量化测试样品中分析物的微流体测试设备。该设备包括具有嵌在基底中的至少一个微通道的非吸收性基底、非特异性捕获设备和延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构。本发明还涉及使用微流体测试设备检测或量化测试样品中分析物的各种方法。本发明还涉及微流体设备，其包括具有嵌在基底中的至少一个微通道的非吸收性基底和延伸到所述至少一个微通道内的一个或多个固定式混合结构。文档编号C12M1/14GK101243176SQ200680029471公开日2008年8月13日申请日期2006年6月9日优先权日2005年6月10日发明者A·J·博伊姆纳,K·尼科尔斯,N·V·扎伊特塞瓦,S·D·S·克瓦奇,S·R·努根,V·N·戈拉尔申请人:康乃尔研究基金会有限公司