液体加工装置和方法

专利名称：液体加工装置和方法
液体加工装置和方法
相关申请的交叉引用本发明涉及加工液体的装置、系统和方法。更具体地，本发 明涉及操作、加工或改变液体样品的装置。
概要根据不同实施方案，提供了下述液体加工装置，其中样品中 含有的多种不同核酸序列可被预扩增，以产生多种不同的经预扩增序 列，然后可以采用单一装置，对所述多种不同的经预扩增序列中的一种 或多种耙核酸序列进行扩增。该液体加工装置可包括微流装置。根据多种不同的实施方案，提供了下述液体加工装置，其可 包括可包括第一表面、相反的第二表面和厚度(thickness)的基底； 和一个或多个至少部分地由该基底所限定的液体加工通路；所述一个或 多个液体加工通路的每一个可包括第一区域和两个或多个第二区域，其 中第一区域可包括被置于其中的预扩增反应组分，其可适合于预扩增存 在于样品中的多种不同核酸序列，以产生多种经预扩增序列，第二区域 的每一个都与第一区域液体相通，并且可包括;故置于的扩增反应组分， 其可适合于对多种经预扩增序列中的一种或多种耙序列进行扩增，以产 生一种或多种经扩增靶序列。根据多种不同的实施方案，提供了下述液体加工装置，其可 包括具有第一表面和相反的第二表面的基底；和一个或多个可至少部 分地由基底所限定的液体加工通路，所述一个或多个液体加工通路的每 一个可包括至少一个热介导的、压力启动的阀，当坤黄3争该阀施加至少两 个大气压的压力以及该阀一皮加热至约100。C至约150°C (如约110。C至 约130。C)的温度时，所述阀可适于爆裂。根据一些实施方案，提供了下述液体加工装置，其可包括具有第一表面和相反的第二表面的基底；和一个或多个至少部分地由基 底所限定的液体加工通^各，所述一个或多个液体加工通^各的每一个可包 括第一区域和一个或多个置于第一区域下游并与其液体相通的密封区 域，所述一个或多个密封区域的每一个包括可包含氨气。在一些实施方 案中，所述一个或多个液体加工通路还可包括置于第一区域和所述一个 或多个密封区域之间并与它们液体相通的阀。根据一些实施方案，提供了下述液体加工系统，其可包括液 体加工装置和与所述液体加工装置的每一个液体加工通路的两个或多 个第二区域光学和/或电化学相通的检测器，该检测器可适合于检测所述 两个或多个第二区域中的一种或多种经扩增把序列，其中该靶序列的每 一种^皮各自的可片企测标记所标记。该液体加工系统可包4舌热循环装置。 如果包括的话，该热循环装置可包括例如半导体制冷装置(peltier device) 或其它已知的加热装置。可使用的示例性半导体制冷装置包括于2004 年8月26日提交的美国专利申请10/926,915中所描述的那些，在此通 过引用将其整体并入本文。该热循环装置可提供两个或多个不同的温度 区，例如，以-使将液体加工装置的两个部分加热至两种不同温度，和/ 或提供热区和冷区。根据一些实施方案，提供了下述液体加工方法，其包括提 供液体加工装置，其可包括一个或多个液体加工通路，每一个液体加工 通路包括与两个或多个第二区域液体相通的第一区域；向该液体加工装 置的第一区域引入可包含多种不同核酸序列的液体样品；在第一区域中 预扩增多种不同核酸序列，以产生包含多种经预扩增核酸序列的经预扩 增液体样品；将经预扩增液体样品从第一区域移至所述两个或多个第二 区域；以及，在所述两个或多个第二区域的每一个中对所述多种经预扩 增核酸序列的至少 一种各自的靶核酸序列进行扩增，以在所述两个或多 个第二区域的每一个中产生至少 一种各自的经扩增耙核酸序列。根据一些实施方案，提供了下述液体加工方法，其可包括 提供液体加工装置，其可包括一个或多个液体加工通^各，该液体加工通 路的每一个包括第一区域和至少一个被置于所述第一区域下游并与其
液体相通的密封区域，其中所述至少一个密封区域可包含氨气；在第一 区域中保留液体样品；以及使液体样品与氨气接触，使得随着氨气溶解 进液体样品从第一区域吸出液体样品。这种通过溶解作用进4亍的液体吸
出可发生多次，例如，以将液体和/或其反应产物顺序吸入两个或多个不 同区域。根据多种不同的实施方案，对一种或多种靶核酸序列进行的 预扩增和扩增可在单个液体加工装置(如单个微流加工装置)中完成。 在一些实施方案中，预扩增和扩增连同样品制备、测序反应和检测反应 中的 一种或多种都可在单个液体加工装置中完成。根据一些实施方案，提供了下述液体加工装置和方法，它们
可加工多至50种不同液体样品，每一种都是针对一组病原体(如20种 病原体)多重化的(multiplexed)。根据一些实施方案，提供了下述液 体加工装置和方法，它们可鉴定病原体、抗生素抗性、物种起源、突变、 癌症或其它基因组病症。该液体加工装置和方法可对单种分子壽丈感，并 且可以是菌林特异性的。根据不同实施方案，提供了这样的方法，其可包括多重扩增 过程，例如多重PCR过程。该过程可包括在液体加工装置的液体加工 通路的第一或预扩增区域中，采用靶区域外侧引物，预扩增包含核酸分 子的一个以上片段的大区域，接着可以是在与该装置的第一或预扩增 区域液体相通的第二或扩增区域中，采用特异于每一位点的引物扩增每 一靶区域。这种方法使得能同时检测特定基因或几个基因中 一个以上的 多态区。以下说明书中示出了本发明的其它特征和优点中的部分，还 有部分会由于这种说明而显而易见，或可由本发明的实施而了解到。通 过在下文说明中特别指出的元件和组合，可意识到并实现本发明的目的 和其它优点。应当理解，前面的 一般性说明和以下的详细说明仅是示例性 的和解释性的，它们旨在为本发明提供进一步的解释。
附图在附图中举例说明了本发明的多种不同实施方案。本发明不 限于绘制在附图中的实施方案，其包括在以下说明中示出的以及本领域 普通技术人员结合本发明能够知道的类似结构和方法。附图中

图1显示了根据多种不同实施方案的液体加工装置的平面
图；图2显示了根据一些实施方案的液体加工装置的平面图；
图3显示了图2中显示的液体加工装置的4黄截面图；
图4显示了根据多种不同实施方案的液体加工装置的平面
图；图5-10显示了根据本发明的多种不同实施方案的系统，其包 括预扩增阵列、混合阵列和微流卡；以及图11显示根据本发明其它多种不同实施方案的系统。
应当理解，以下的说明仅为示例性和解释性的。附图^皮并入 本申请并构成其一部分，它们与说明书一起说明了若干示例性实施方 案。现在将参考多种不同的实施方案，它们的实例在附图中有图解。只 要可能，在附图和说明书中都用同样的附图标记来表示相同或相似的部 件。
说明书
I.概述整份本申请中，对各个实施方案的说明采用"包括"性用语； 但是本领域技术人员应理解，在一些特定情况下，备选地，实施方案可 采用"基本上由...组成"或"由...组成"的用语来描述。为更好地理解本发明而非限制本发明范围的目的，本领域技 术人员应清楚，除非另有明确说明，单数的使用包括复数。因此，术语 "一个/一种"("a" 、"an")和"至少一个，，在本申请中可互换使 用。除非另有指明，用在说明书和权利要求书中的所有表述数量、 百分比或比例的所有数字以及其它数值应被理解为在所有情况下都被 词语"约，，所修饰。因此，除非有相反说明，在以下说明书和所附权利 要求书中列出的数字参数为近似值，其可以根据所想获得的期望性质而 变化。在一些情况下，"约，，可一皮理解为给定值士5%。因此，例如约100 nl,可指95-105 nl。至少，每个数字参数应至少根据所报道的有效数字 值并通过应用通常的舍入技术来理解。用于本文中时，用语"数个"可^f皮理解为"两个或多个"。 这时，用语"两个或多个"与用语"数个"同义使用。
入。此外，当数量、浓度或其它值或参数以范围、优选范围或一系列较 高优选值和一系列较低优选值给出时，这应当被理解为明确公开了由任 何上限范围值或优选值和任何下限范围值或优选值的任何配对所形成 的所有范围，无论这些范围是否被独立公开。当在本文中提到数值范围 时，除非另有说明，该范围旨在包括其端点和该范围内的所有整数和分 数。这并不意味着本发明的范围被限制到在定义范围时提到的特定值。本文中，术语核酸序列指核苷酸碱基的任何序列，例如，通
过糖-磷酸酯骨架结合在一起的序列。用在本文时，术语"核苷酸碱基" 指被取代的或未被取代的芳族环或芳族多环。在某些实施方案中，芳族 环或芳族多环含有至少一个氮原子。在某些实施方案中，核苷酸碱基能
够与适当互补的核苦酸碱基形成Watson-Crick和/或Hoogsteen氢键。示 例性核苷酸碱基及其类似物包括但不限于，天然产生的核苷酸碱基腺嘌 呤、鸟噪呤、胞嘧啶、6甲基-胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶，以及天然产 生的核苷酸碱基类似物，例如，7-脱氮腺噪呤、7-脱氮乌嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、N6-A2-异戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6-A2-异戊烯基-2-甲硫基腺嘌呤(2ms6iA)、 N2-二甲基鸟嘌呤(dmG)、 7-曱基鸟 嘌呤(7mG)、次黄嘌呤核苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、 2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、 -假尿嘧啶核苷、Wi胞嘧啶、^i异胞嘧啶、
5- 丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-硫代嘧啶、
6- 石危代鸟噤呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫脲嘧啶、06-曱基鸟嘌呤、N6-甲 基腺嘌呤、04-甲基胸腺嘧啶、5,6-二氢胸腺嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶、吡 唑并[3,4-D]嘧咬(参见，例如美国专利6,143,877和6,127,121以及PCT 公布的申请WO 01/38584)、亚乙烯基腺。票呤、吲咮类如硝基吲咮和4-甲基巧l咮、以及吡咯类如硝基吡咯。某些示例性核普酸碱基可例如在 Fasman, 1989, Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, pp. 385-394, CRC Press, Boca Raton, Fla.以及其中引用的文献中找到。用于本文中时，术语"核苷酸"指这样的化合物，其包含连
接至糖(诸如核糖、阿拉伯糖、木糖、吡喃糖)及其糖类似物的c-r石友 上的核苷酸碱基。术语核苷酸也包括核苷酸类似物。糖可以是被取代的 或未被取代的。被取代的核糖包括但不限于其中 一 个或多个碳原子如2'-
碳原子被一个或多个相同或不同Cl、 F、 -R、 -OR、 ^112或卤素基团取 代的那些核糖，其中每个R独立地为H、 Cl-C6烷基或C5-C14芳基。
示例性核糖包括但不限于2'-(Cl-C6)烷氧基核糖、2'，3'-二脱氲核糖、2'-脱氧-3'-卣代核糖、2'-脱氧-3'-氟核糖、2'-脱氧-3'-氯核糖、2'-脱氧-3'-氨基 核糖、2'-脱氧-3'-(Cl-C6)烷基核糖、2'-脱氧-3'-(Cl-C6)烷氧基核糖和2'-脱氧-3'-(C5-C14)芳氧基核糖、核糖、2'-脱氧核糖、2',3'-二脱氧核糖、2'-卣代核糖、2'-氟代核糖、2'-氯代核糖、以及2'-烷基核糖，例如2'-0-曱 基，4'-异头核苷酸、l'-异头核苷酸、2'-4'-和3'-4'-连接的以及其它"锁定 的，，或"LNA",双环糖修饰物(参见，例如PCT公开的申请WO 98/22489， WO 98/39352;和WO 99/14226)。示例性的多核香酸中LNA糖类似物包 括但不限于以下结构
<formula>formula see original document page 10</formula>
其中B为任何核苦酸碱基。在核糖2'-或3'-位进行的修饰包括但不限于氬、羟基、曱氧基、 乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、曱氧基乙基、烷氧 基、苯氧基、叠氮基、氨基、烷基氨基、氟、氯和溴。核苷酸包括但不 限于天然D光学异构体以及L光学异构形式(参见，例如Garbesi (1993) Nucl. Acids Res. 21:4159-65; Fujimori (1990) J. Amer. Chem. Soc. 112:7435; Umta, (1993) Nucleic Acids Symposium Ser. No. 29:69-70)。当 核苷酸碱基为噤呤即A或G时，核糖连接到核苷酸碱基的N9位。当核 普酸碱基为嘧啶即C、 T或U时，除了假尿嘧啶核苷以外，戊糖连接到 核苷酸碱基的Nl位，在假尿嘧咬核苷中，戊糖连接到尿嘧咬核普酸碱 基的C5位(参见，例如Romberg and Baker, (1992) DNA Replication, 2nd Ed., Freeman, San Francisco, CA)。核苦酸的一个或多个戊糖石灰可以 一皮具有下式的》岸酸酯取代<formula>formula see original document page 11</formula>其中a是0至4的整数。在一些实施方案中，a是2并且该^畴酸酯连接到戊糖的3'或 5'碳。在一些实施方案中，核苷酸是其中核苷酸碱基是嘌呤、7-脱氮嘌 呤、嘧咬或其类似物的那些核普酸。"核苦酸5'-三磷酸"指在5'位具有 三磷酸酯基团的核苷酸，其有时被表示为"NTP"或"dNTP"和"ddNTP", 以特别指出该核糖的结构特点。三磷酸酯基团可以包括对多种不同的氧 进行的石危取代，例如-硫代-核苦酸5'-三磷酸。关于核苷酸化学的综述， 参见Shabarova, Z. and Bogdanov， A. Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, VCH, New York, 1994。用于本文中时，术语"核苦酸类似物"指下述实施方案，其 中核苷酸的戊糖和/或核苷酸碱基和/或一个或多个磷酸酯可以被其各自 的类似物所替换。在某些实施方案中，示例性的戊糖类似物为上文描述 的那些。在某些实施方案中，核苷酸类似物具有上文描述的核苷酸碱基 类似物。在某些实施方案中，示例性磷酸酯类似物包括但不限于烷基 磷酸酯、甲基磷酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidates)、磷酸三酯、硫代磷 酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、 phosphoroanilothioates 、 phosphoroanilidates 、 石寿 酰 胺 酉旨 (phosphoroamidates)、石朋石舞酸酉旨(boronophosphates)等，并且可以包4舌结 合的平衡离子。包括在核苦酸"类似物"定义内的还有核苷酸类似物单体， 其可被聚合成多核苷酸类似物，在该多核苷酸类似物中DNA/RNA磷酸 酯/或糖磷酸酯骨架被不同类型的核苷酸间键合所替换。示例性的多核苷 酸类似物包括但不限于肽核酸，其中多核苷酸的糖磷酸酯骨架被肽骨架 替换。还包括嵌入(intercalating)核酸(INAs, Christensen and Pedersen, 2002中所描述的)和AEGIS碱(Eragen,美国专利5,432,272)。用于本文中时，术语"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸" 可互换使用，它们指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括通过核苷酸 间^寿酸二酯腱或核苷酸间类似物连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核 糖核苦酸以及结合的平tf离子，例如H+、 NH4+、三烷基4妄、Mg2+、 Na+,等等。核酸可以完全由脱氧核糖核苷酸组成、完全由核糖核苷酸 组成或由其嵌合混合物组成。核苷酸单体单元可以包括本文描述的任何 核苷酸，其包括但不限于天然产生的核苷酸和核苷酸类似物。核酸的典 型大小范围从数个单体单位(例如，当它们在现有技术中常常被称为寡核 苷酸时，5-40个)到数千个单体核苷酸单元。除非另有说明，每当表述 核苷酸时，应理解核苷酸从左到右为5'至3'顺序，以及除非另有说明，
"A"指脱氧腺苷或其类似物、"C"指脱氧胞苷或其类似物、"G"指 脱氧乌苷或其类似物、以及"T"指胸腺嘧啶脱氧核苷或其类似物。核酸包括但不限于基因组DNA、 cDNA、 hnRNA、 mRNA、 rRNA、 tRNA、片断化核酸、从诸如线粒体或叶绿体的亚细胞器获得的 核酸以及/人可能存在于生物样品上或样品中的樣￡生物或DNA或RNA病 毒获得的核酸。核酸可以由单一类型的糖部分构成(例如，在RNA和DNA 的情况下)，或者由不同糖部分的混合物构成(例如，在RNA/DNA嵌 合体的情况下)。在某些实施方案中，核酸为以下结构式的核糖多核苷 酸和2'-脱氧核糖核苷酸其中每个B独立地为核苷酸或类似物核苷酸的碱基部分，例如噤
呤、7-脱氮嘌呤、嘧啶；每个m定义各核酸的长度，范围从0至数千、 数万或更大；每个R独立地选自氢、卣素、—R"、 —OR"、和—NR"R"， 其中每个R"独立地为(C1-C6)烷基或(C5-C14)芳基，或者两个邻近的R 合起来形成键以使得核糖为2',3'-二脱氧核糖；以及每个R'独立地为羟基 或
<formula>formula see original document page 13</formula>其中a为0、 1或2。在以上图解说明的核糖多核苷酸和2'-脱氧核糖多核苷酸的某 些实施方案中，核苷酸石咸基B共价连接到糖部分的Cl'碳，如之前所描 述的。术语"核酸"、"多核苷酸"和"寡核苷酸"还可包括核酸
类似物、多核苷酸类似物和寡核苦酸类似物。术语"核酸类似物"、"多 核苷酸类似物"和"寡核苷酸类似物"在本文中可互换使用，它们指含 有至少一个核苷酸类似物和/或至少一个磷酸酯类似物和/或至少一个戊 糖类似物的核酸。包括在核酸类似物定义中的还有磷酸酯和/或糖磷酸酯
键被其它类型键替换的核酸，所述其它类型键例如为N-(2-氨基乙基)-甘氨酸酰胺和其它酰胺(参见,例如Nielsen et al., 1991, Science 254: 1497-1500; WO 92/20702; U.S. Pat. No. 5,719,262; U.S. Pat No. 5,698,685);吗啉4戈(参见，例如U.S. Pat. No. 5,698,685; U.S. Pat. No. 5,378,841; U.S. Pat. No. 5,185,144);氨基曱酸脂类(参见，例如Stirchak & Summerton, 1987, J. Org. Chem. 52: 4202);亚曱基(甲基亚氨基)(参见， 例如Vasseur et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114: 4006); 3'-碌u甲缩醛 (thioformacetals)(参见,例如Jones et al., 1993, J. Org. Chem. 58: 2983); 氨基磺酸脂类(参见，例如U.S. Pat. No. 5,470,967); 2-氨基乙基甘氨酸， 常常称为PNA (参见，例如Buchardt, WO 92/20702; Nielsen (1991) Science 254:1497-1500);以及其它键(参见，例如U.S. Pat. No. 5,817,781; Frier & Altaian, 1997, Nucl. Acids Res. 25:4429以及其中引用的参考文 献)。磷酸酯类似物包括但不限于(i) C1C4烷基磷酸酯，例如甲基磷酸酯； (ii)磷酰胺酯；(iii) C1C6烷基-磷酸三酯；(iv)硫代磷酸酯；以及(v)二硫 代磷酸酯。根据多种不同的实施方案，耙核酸序列可包括任何目的核酸 序列，例如核酸、SNP、含有全长或部分目的基因多态区的核酸，等等。根据多种不同的实施方案，提供了与样品制备和分析中涉及 的过程或行为有关的方法。应当理解，在多种不同的实施方案中，方法 可以以所指出过程的顺序来进行，但是在相关实施方案中，为了实现希 望的目的，本领域技术人员可认为适当而改变该顺序。根据多种不同的实施方案，液体样品可包括含水或非水样品。 含水或非水样品可包括任何含有核酸的材料，例如生物材料。含有核酸
的材料可包括例如以下材料中的一种或多种血液；细胞样品；亚细胞 的细胞器，例如线粒体或叶绿体；细胞裂解液；组织样品，例如皮月夫； 细胞培养基；体液，例如唾液、尿或渗出液；活检培养液等。这类含有 核酸的材料可包括任何来源，例如，人类来源、动物来源、植物来源、
细菌来源、病毒来源，等等。含有核酸的样品可在预扩增之前或在预扩 增的同时被处理以获得核酸。可在预扩增之前采用本领域技术人员已知 的方法获得核苷酸和核酸。才艮据多种不同的实施方案，加工或反应组分可包括在一个或
多个过程中使用所需或所希望的一种或多种组分，例如以任何方式影响 所期望反应的进展的组分。加工组分可包括反应性组分。但是，该组分 不是必须要参与反应。加工组分可包括非反应性组分。加工组分可包括 可回收组分，其可包4舌例如溶剂和/或催4匕剂。加工组分可包括启动剂、 促进剂或延缓剂，它们不是反应所必需的，但是会影响到反应，例如影 响反应速率。术语"反应组分"与术语"加工组分"同义使用，如本文 所述。合适的过程可包括一个或多个样品制备过程、样品纯化过程、样 品扩增过程、预扩增过程、预扩增产物纯化过程、扩增过程、扩增产物 纯化过程、分离过程、测序过程、测序产物纯化过程、标记过程、；险测 过程，等等。加工组分可包括样品制备组分、纯化组分、预扩增反应组 分、扩增反应组分、测序反应组分，等等。无需过度实验，技术人员可 容易地选择和采用适于所期望的反应或过程的组分。根据一些实施方案，可采用现有技术中任何已知的方法将加 工组分或反应组分配置在一个或多种区域或通道中。例如，组件可,皮喷 雾和干燥，采用稀释剂递送，采用毛细管、移液器和/或自动移液器注入， 或以其它方式#1配置在所述区域或通道中。根据一些实施方案，所提供的液体加工装置可包括一个或多 个液体加工通路，它们每一个可包括一个或多个元件，例如一个或多个 区域、通道、分支通道、阀、分流器、排气口、孑L、入口区、通路、小 珠、含有反应物的小珠、覆盖层、反应组件、混流器(flow combiner)、 集流器(flow merger)、交叉流通路、它们的任意组合等等。任何元件可 与另一元件液体相通，其中"液体相通"可-皮理解为直接的液体相通，
为可适合于液体相通，例如当两个区域通过包括有置于其中的密闭阀的
立液体相通)，其中这两个区域为可适合于液体相通。用在本文时，术语 "液体相通"指直接液体相通和/或可适合于直接液体相通，除非另有明 确说明。本文也使用术语"有阀的液体相通"，指有阀置于其间的元件，
4吏得在打开或开动阀时，可在该元件间建立液体相通。根据多种不同的实施方案，可按照本文所述来使用的阀可例
如包括可分解阀、可溶胀岡和/或复合阀，例如2005年10月18日提交 的美国专利申请11/252,821、 2005年10月18日提交的美国专利申请 11/252,912、2005年10月18日提交的美国专利申请11/252, 915以及2005 年10月18日提交的美国专利申请11/252,914中所描述的，在此通过引 用将它们整体并入本文。根据不同实施方案，阀可包括油封通道，例如 美国专利申请11/380,327中所描述的，在此通过引用将其整体并入本文。涉及核酸的反应可包括酶促反应，其中核酸^皮扩增以增加覃巴 核酸的量用于分析。其它的反应可例如包括引物延伸反应、测序反应、 断裂反应(例如采用特异的内切核酸酶)、核酸错配异型双链的切割反应、 寡核苦酸连接反应和单链构象反应。根据多种不同的实施方案，相对于 靶序列扩增反应，第二或下游扩增反应可以是产物扩增反应。就此而言， 靶序列并不被扩增，而是其一种或多种反应产物以成倍方式产生，最终 形成成倍的可检测产物。这种类型的示例性检测法为可从Third Wave Technologies of Madison, Wisconsin获4寻的Invader 4全测法。示例十生才企测 法在Brow等人的美国专利6,706,471和2004年1月22日公布的美国专 利申请US 2004/0014067中有描述，在此通过引用将它们整体并入本文。核酸扩增反应可包括聚合酶链式反应(PCR)，其可根据现有技 术中已知的任何方法进行。例如，在一种PCR方案中，使细胞基因组 DNA与两种引物接触，并进行多轮扩增以足以产生所需量的经扩增的 DNA。两引物位置可例如间隔约50至350、约50至500、多至约IOOO 或更多石咸基对、多至约10,000石咸基对，或多至100,000或更多石咸基对。如果要进行多重PCR扩增，开始将包括核酸分子 一个以上片 段的大区域用该区域外侧引物扩增，然后采用各位点特异引物扩增每一 亚区域或片段，例如嵌套PCR。多重PCR的一些缺点包括PCR引物间 的部分结合或PCR引物和其它引物或基因组DNA不同于靶位点的其它 区域之间的部分结合，由此导致产生副产物，并且期望PCR产物的产量 降低。本领域技术人员熟悉多重PCR的设计和限制。可与本发明联合使用的示例性多重方法和装置包括例如在 2004年9月9日公布的美国专利申请US2004/0175733中描述的那些， 在此通过引用将其整体并入本文。扩增核酸的其它方法可包4舌^旦不限于孩iPCR (mim-PCR)、 连接酶链反应(LCR) [Wiedmann et al. (1994) PCR Methods Appl. Vol. 3, Pp. 57-64;Barnay(1991)Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189-93]、链置换扩 增(SDA) [Walker et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2670-77]、 RT-PCR [Higuchi etal. (1993) Bio/Technology 11 :1026-1030]、滚环扩增、重组酶 聚合酶扩增(Armes et al., WO03072805; Piepenburg et al., US2005112631)、 EXPAR (van Ness et al., WO2004067726)、产生空间定 位产物(spatially localized product)的等温核酸扩增(Saba, http:〃wbabin.net/saba/sabal7.htm)、诸如采用QJ复制酶的自身催化方法、 TAS、 3SR和本领域技术人员已知的任何其它适合的方法。其它扩增方法可包括自主序列复制(Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173-1177)、Q卩复制酶(Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197)或任何其它核酸扩增方法，之后采用本领域技术 人员熟知的和本文公开的技术检测经扩增的分子。如果核酸分子以极小 的数量存在时，这些^r测方案尤其可用于对这些分子加以;险测核酸分 子。或者，可以采用等位基因特异性扩增技术，其依赖于选择性PCR 扩增。用作特异性扩增引物的寡核苷酸可以在分子中部带有目的等位变 体(使得扩增依赖于差异杂交)，或者在一个引物的3'末端带有目的等位 变体，其中在合适的条件下，4昔配可防止或减少聚合酶延伸(Prossner (1993) Tibtech 11:238; Newton et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:2503)。此 外，有可能希望在突变区域中引入限制性位点，以产生基于切割的检测 (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1)。引物延伸反应引物延伸反应包括聚合酶介导的核酸链延伸 的特异终止，这通过向延伸反应引入链终止剂(如二脱氧核苷酸)来实 现。现有技术中已知若干种基于引物延伸的方法，它们已被用于测定核 酸序列中特定核苷酸的身份。通常，制备的引物在特定核酸分子中邻近 目的位点如多态位点处特异杂交。然后，在一种或多种二脱氧核苷酸存 在下延伸，其中通常有至少一种二脱氧核普酸是该多态位点核苷酸的互 补物。片断化反应在包括PCR产物或其它扩增产物在内的特异核 酸内是否存在一种或多种突变如多态性，可从这些核酸的片断来确定。
可通过不同的化学和/或酶学反应产生这些片断。对于这些片断化反应的 任一种，可通过例如电泳、毛细管电泳、质i普等确定反应后获得的核酸 片段的分子量。可通过其表征全序列的整体片断化模式来表征靶核酸，或通 过片断化^t式的所选部分来表征。核酸的某些片断可^f皮选择性分离和纯 化，例如通过在基底上的杂交或者通过其它特异性相互作用(如一条或多 条片断的生物素/链霉亲和素亲和力)来捕获。用于分离和纯化所产生的 全部或大部分片断的方法例如包括通过在一种以及多种基底上的杂交 来特异和非特异(例如，通过使用聚肌苷)捕获，所述基底通过离子键、 氢键或疏水相互作用、螯合配体、亲和相互作用或通过本领域技术人员 已知的其它手段与片断结合。产生核酸片断(优选从扩增产物产生片断)的一种方法是使 用一种或多种限制酶。对该反应的产物的数量、大小和/或组成的分析将 提供关于该核酸和其在一个或多个位点变体的信息。例如，测序反应内 的特异核苷酸多态性多种核酸测序反应在现有技术中是已知的，并可 用于鉴定特定核酸。示例性测序反应包括基于Maxam和Gilbert [(1977) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 74:560]或Sanger [Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463]开发的技术的那些反应。对于一些实施方 案，在测序反应中仅需确定一个、两个或三个核苷酸碱基的存在，这对 本领域技术人员来i兌显而易见。例如，可进4亍A追踪(A-track)测序或类 似测序，其中仅片企测一种核苷酸。其它的测序方法是已知的(参见，例如 标题为 "Method of DNA sequencing employing a mixed DNA- polymer chain probe " 的美国专利 5,580,732和标题为 "Method for mismatch-directed in vitro DNA sequencing" 的美国专利5,571,676)。
多重反应可在第一和第二区域中的一个或多个中进行。在示例性实 施方案中，100重(100-plex)反应可在第一区域中进行，例如由此使得100 种不同的靶核酸序列^f皮扩增。然后，所述100重产物可被输送至数个第 二区域，例如输送至25个反应区域。所述输送可包括形成/人第一区域 到每个第二区域的流体连通，例如使用数个通道和第一分流器和/或打开 阀。在该25个第二区域中，可进行其它的多重反应。例如在该25个第 二区域每一个中进行不同的4重反应。在其它实施方案中，可在第一区 域中进行20重反应，然后在五个独立的第二区域中进4亍五个不同的4
重反应。在另一实施方案中，最初的cDNA样品被分进24个不同的第 一区域。在该24区i或的每一个中，可进4亍不同的独立1280重反应。然 后，每个第 一 区域中的扩增产物可被转移进256个独立的第二反应区域 中，其中可发生不同的独立5重扩增和/或检测。根据一些实施方案，可进行多重反应，用于检测单核苷酸多 态性(SNP's)。在一些实施方案中，反应产物可被连接到分子比例 (molecular rate )修饰剂，然后在毛细管电泳分析仪上解析或4企测。根 据一些实施方案，单核苷酸多态性可在第二区域中被检测。在一些实施 方案中，SNP-plex反应可在第一和/或第二区域中进行。寡核苷酸连接反应在纟皮称为核苷酸连接的另 一核酸反应方 案中，将两种设计来能够与靶核酸的单链的邻近序列杂交的寡核苷酸与 样品核酸混合。如果在样品核酸中存在精确的互补序列，则该寡核苷酸 将杂交，使得它们的末端邻接并产生连接底物。于是，样品中的核酸可 采用寡核苷酸连接测定法(OLA)才企测，如Landegren et al., Science 241:1077-1080 (1988)中所描述的。Nickerson等人描述了一种核酸4全测 法，其合并了 PCR和OLA的特点[Nickerson et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:8923-89271。在该方法中，PCR被用于实现靶DNA的指 数扩增，然后采用OLA对其进行检测。在另一实施方案中，可先使用 OLA,然后是PCR,例如高度多重PCR。通过引用将上述参考文献都并 入本文。基于该OLA方法的若干种技术已被开发出来，其可用于检测 基因多态区的特异等位基因变体。例如，美国专利5,593,826公开了一 种OLA,其采用具有3'-氨基基团的寡核苷酸和5'-磷酸寡核苷酸形成具 有石寿酰胺酯键的偶联物。可使用的其它4支术包括OLA-PCR纟支术和 PCR-OLA技术。在其它方案中，基于连接酶链反应(LCR)， 4吏耙核酸与一套连 接引物(hgation educts)和热稳定DNA连接酶杂交，使得连接酶引物成为 彼此共价连接，形成连接产物。可用于核酸反应中的试剂由涉及核酸 的反应的类型显而易见的是，多重试剂可用在这类反应中。反应物包括 酶(例如，聚合酶、内切酶、外切酶、核酸酶S1、连接酶)、引物、寡核 普酸、脱氧核苷三A寿酸(dNTPs)和二脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)。在其它实施方案中，核酸序列可一皮连接至蛋白、抗体和抗原。
这些方法在文献中一皮称为免疫PCR (Sano et al, Science 258, 120-122 (1992)， Sims et al., Anal. Biochem 281, 230-232 (2000))和邻近连接测定 法(Fredriksson et al., Nature Biotechnology 20, 473-477 (2002))。它们比常 规用于蛋白测定的ELISA方法更灵敏。与本文描述的装置和方法联合使 用这些方法扩展了蛋白检测的有效性并有助于多重蛋白检测。引物引物指能够在邻近目的区域(如多态区)位置处与核酸序 列(经常称为^t板)特异杂交的核酸。引物可通过酶(如聚合酶)的作用在一 过程中被延伸，其中互补于邻近引物的模板的核苷酸或其类似物被添加 至生长的核苷酸链。例如，如果使用RNA模板，则可通过逆转录酶的 作用延伸寡聚脱氧核苷酸引物，以生成互补于RNA模板的cDNA。如果 使用DNA冲莫板，则可通过DNA聚合酶的作用延伸。引物可单独使用，例如在设计为提供关于草巴核酸的鉴定和/或 存在方面信息的引物延伸反应中，或者引物可与至少一种其它引物或探 针一起使用，例如在扩增反应中。为了扩增至少一部分核酸，优选使用 正向引物(即，5'引物)和反向引物(即，3'引物)。正向和反向引物杂交至 双链核酸的互补链，使得在从每一引物延伸时，扩增双链核酸。在不改变其作用本质情况下，可以通过末端添加核苷酸来4多 饰本文描述的引物(RNA、 DNA(单链或双链)、PNA及其类似物)，所述 核苷酸被设计用来例如并入限制性位点或其它有用序列。可才艮据现有技术中熟知的以及例如在Sambrook, J. and Russell, D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y中描述的方 法来制备引物。例如，可使用限制酶制备和克隆DNA的不连续片断。 或者，可采用具有合适序列的引物通过聚合酶链式反应制备引物，或者 引物可一皮合成。引物，尤其是在检测等位基因变体方法中进行的反应所使用 的引物，具有足够的长度，以与等位基因多态位点部分特异杂交。通常， 这种长度取决于源生物体基因组的复杂性。对于人类而言，这种长度至 少为14-16核苦酸，通常可以为20, 30, 50, 100个或更多核苷酸。核普/核普酸很多涉及核酸的反应包括作为建筑块(building blocks)的脱氧核普三磷酸(dNTPS)和二脱氧三磷酸(ddNTPs),它们可例
如^L用在延伸、扩增和测序反应中来延伸引物。在某些实施方案中，可
能希望使用经修饰的dNTPS来促进反应产物的鉴定和/或检测，或者区
分不同反应的产物。例如，不同反应的核酸产物之间分子量差异可通过 其自身核酸序列(组成或长度)或通过向产物引入质量修饰官能团而实 现。例如，可在核酸扩增过程其间引入质量修饰。寡核苷酸类型寡核苷酸的序列、长度和组成将随待捕获的 核酸的性质而变化。寡核苷酸可特异于每一测定产物或者可互补于两个 或多个多态位点等位基因变体的共同区域。例如，在引物延伸反应测定 中，表面固定的互补寡核苷酸可与源自两多态位点等位基因的延伸产物 杂交。这是因为不与多态区形成杂交。寡核苷酸与多态区的5'延伸产物 杂交。但是每个寡核苷酸只与单个多态区的等位基因杂交。根据多种不同的实施方案，可将通用寡核苷酸("zip code" 寡核苷酸)固定在基底上。zip code寡核苷酸可为任何长度，典型地为6 至25核苷酸长度。所捕获的测定产物具有zip code互补序列，使得其能 与表面结合的寡核普酸杂交。根据不同实施方案，zip code可用在非固定化技术中。例如 zip code可用作用于第二扩增反应的引物。根据不同实施方案，可进行 的采用通用PCR和/或zip code的各种方法可包括例如Andersen等人的 美国专利申请11/090,830和Lao等人的美国专利申请11/090,468(都于 2005年3月24日提交)、Marmaro等人的美国专利6,6O5,451以及 Andersen等人的
发明者., K·福尔斯蒂赫, M·奥尔当 申请人:阿普尔拉公司