酵母和l-乳酸的制造方法

专利名称：酵母和l-乳酸的制造方法
技术领域：
本发明涉及L-乳酸的制造方法。另外本发明还涉及导入了编码L-乳酸脱氢酶的基因的酵母。本发明还涉及包括对导入了编码L-乳酸脱氢酶的基因的酵母进行培养的L-乳酸的制造方法。

背景技术：
最近，对资源有效活用，资源使用后再利用引起社会的注目，特别是聚焦在以植物为原料的聚合物。其中聚乳酸作为植物原料的聚合物具有的优越性质正在变得明朗起来。
作为聚乳酸的原料乳酸在现有技术中一直是通过培养总称之乳酸菌的微生物制造的。乳酸菌以乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)为代表。这些乳酸菌虽然在由糖生产乳酸的收率有优势，但对酸的耐性低，由于作为酸性物质的乳酸大量蓄积，必须一边用碳酸钙或氢氧化铵、或氢氧化钠等碱中和，一边进行培养。
然而，如果使用该手段，由于要通过用碱的中和操作，生成乳酸钠或乳酸钙等乳酸盐，所以在后面的纯化步骤中需要将乳酸盐回复为乳酸的操作，这样的处理使得成本提高。
其中有以降低中和成本为目的尝试用耐酸的酵母生产乳酸的报道(参照专利文献1～5、非专利文献1～3)。由于酵母本来不具备生产乳酸的能力，为了通过酵母生产乳酸，必须要利用基因重组技术将编码使丙酮酸转换为L-乳酸的L-乳酸脱氢酶的基因(以下有时略记为L-ldh基因)导入酵母中。
导入酵母的L-ldh基因到现在为止据报道已研究了来自牛的L-ldh基因(参照专利文献3、专利文献5和非专利文献1～3)，比来自乳酸菌的L-ldh基因更合适。来自牛的L-ldh基因，L-乳酸的对等收率低，需要进一步使对糖收率提高(参照非专利文献3)。另外也进行了通过使酵母具有的基因突变使L-乳酸的生产效率提高的尝试。然而，如果使酵母具有的基因突变，则存在着发酵时间变长，糖的消费速度低下等不好的状况(参照专利文献3、专利文献6)。
如上所述，使用酵母制造L-乳酸是有用的方法。但希望进一步提高生产效率。
专利文献1特开2001-204464号公报
专利文献2特开2001-204468号公报
专利文献3特表2001-516584号公报
专利文献4特开2003-93060号公报
专利文献5特开2003-259878号公报
专利文献6特开2006-006271号公报
非专利文献1Danilo Porro等人Biotechnol.Prog，11p294-298(1955)
非专利文献2Danilo Porro等人Aplied and EnvironmentalMicrobiology，65(9)p4211-4211(1999)
非专利文献3Satoshi Saitoh等人Appied and EnvironmentalMicrobiology，71(5)p2789-2792(2005)

发明内容
本发明是导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母。
本发明优选导入了编码来自智人(Homo sapiens)或非洲爪蟾(Xenopus laevis)的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母。
另外，本发明优选 (1)酵母，其为导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母，且为具有突变型PDR13基因的酵母，其中所述突变型PDR13基因包含野生型PDR13基因的DNA序列的一部分通过缺失、插入或替换而被突变的可翻译成该基因编码的蛋白质的一部分的DNA序列， (2)酵母，其为导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母，且为具有突变型醇脱氢酶的、该突变型醇脱氢酶显示通过改变培养温度而使细胞内醇脱氢酶活性消失或降低的温度感受性的酵母，其中所述突变型醇脱氢酶为包含野生型醇脱氢酶的氨基酸序列的一部分被替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的突变型醇脱氢酶，或 (3)酵母，其为导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母，且为编码丙酮酸脱羧酶1的基因缺失、具有包含编码野生型丙酮酸脱羧酶5的基因的碱基序列的一部分被缺失、插入、替换和/或添加的碱基序列的突变型丙酮酸脱羧酶5基因的酵母。
附图的简单说明

图1是表示本发明中使用的L-ldh基因染色体导入用PCR片段制作方法的一例的概念图。
图2是表示作为本发明中使用的一例表达质粒-质粒pTRS11的构建图。
图3是表示作为本发明中使用的一例表达质粒-质粒pTRS57的构建图。
符号说明 1导入目的位点上游侧的同源序列(添加部分) 2共有序列 3酵母用选择标志基因 4导入目的位点上游侧的同源序列(添加部分) 5L-ldh基因的染色体导入用PCR片段 用于实施发明的最佳方案 本发明是导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)的酵母。
本发明中所谓的L-ldh基因指的是编码具有将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和丙酮酸转换为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和L-乳酸的活性的蛋白质的基因。作为本发明使用的编码L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)，可以是来自人或蛙的基因，并没有特别限定。作为来自人的，如来自智人(Homo sapiens)的L-ldh基因，作为来自蛙的，如来自属于树蛙科(Rhacophoridae)、赤蛙科(Ranidae)、雨蛙科(Hylidae)、姬蛙科(Microhylidae)、蟾蜍科(Bufonidae)、苇蛙科(Hyperoliidae)、锄足蟾科(Pelobatinae)、盘舌蟾科(Discoglossidae)、负子蟾科(Pipidae)的蛙的L-ldh基因。作为来自蛙的L-ldh基因，其中优选使用来自属于负子蟾科(Pipidae)的蛙的L-ldh基因，而在属于负子蟾科的蛙中优选来自非洲爪蟾(Xenopus laevis)的L-ldh基因。
编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)中已知有ldhA基因、ldhB基因、ldhC基因这3种同工型，本发明中可以使用任一种，优选ldhA基因。
具体来说，本发明的编码来自人的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)是具有序列编号1所示核酸序列的L-ldb基因。而本发明的编码来自蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)优选具有序列编号2所示核酸序列的L-ldh基因。
本发明的编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)中还包含遗传的多态性和由于诱发突变等产生的突变型的基因。本说明书中，所谓遗传的多态性指的是由于基因上的自然突然突变，基因的碱基序列一部分变化的产物。而所谓诱发突变指的是通过人工方式对基因导入突变。诱发突变有例如使用位点特异的突变导入用试剂盒(Mutan-K(Takara Bio公司生产))的方法和使用随机突变导入用试剂盒(BD多样化PCR随机诱变(CLONTECH公司生产))的方法等。另外，本发明中使用的来自人或蛙的L-ldh基因只要编码具有将NADH和丙酮酸转换为NAD+和L-乳酸的活性的蛋白质即可，即使碱基序列的一部分存在缺失或插入也没关系。
本发明的导入编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)的酵母优选地是通过具有突变基因可以以高的对糖收率制造L-乳酸。
本发明的导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)的酵母优选地为具有突变型PDR13基因的酵母，其中所述突变型PDR13基因包含野生型PDR13基因的DNA序列的一部分通过缺失、插入或替换而被突变的、可翻译成野生型PDR13基因编码的蛋白质的一部分的DNA序列。
本发明的野生型PDR13基因的碱基序列优选包含序列编号64所示碱基序列的基因。本发明的酵母具有的突变型PDR13基因优选地为包含序列编号22所示碱基序列的基因。而由野生型PDR13基因或突变型PDR13基因编码的蛋白质的一部分优选是包含序列编号23所示的氨基酸一级序列。
本发明的导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)的酵母优选可部分生产PDR13蛋白质的酵母。部分生产PDR13蛋白质的酵母具有在编码PDR13蛋白质的基因中产生突变的突变型PDR13基因。作为突变，例如酵母的编码PDR13蛋白质的染色体DNA的一部分缺损的突变，以及在蛋白质的氨基酸序列中1个以上的氨基酸被缺失或替换的突变等。
本发明中所谓编码PDR13蛋白质的染色体DNA的一部分缺损，如在染色体DNA的碱基序列中，至少具有使C末端侧的39个氨基酸残基不翻译的突变的突变DNA。所谓在PDR13蛋白质的氨基酸序列中至少C末端侧的39个氨基酸缺失的突变指的是对于编码PDR13蛋白质的染色体DNA，通过位点特异的突变导入法缺失可导入数的氨基酸的突变。
位点特异的突变的导入如使用位点特异的突变导入用试剂盒(Mutan-K(Takara Bio公司生产))的突变导入方法，本发明中突变导入方法并不限定于此。
本发明的导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)的酵母优选地为具有突变型醇脱氢酶，所述突变型醇脱氢酶包含野生型醇脱氢酶的氨基酸序列的一部分被替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列。
本发明的导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)的酵母优选地为野生型醇脱氢酶通过改变培养温度而使细胞内的醇脱氢酶活性表现出消失或下降的温度感受性的酵母。
本发明中所谓醇脱氢酶是具有将乙醛转换为乙醇的活性的蛋白质。
作为编码醇脱氢酶的基因，酵母有多个同源基因。本发明中，优选使用在生产中使用的在酵母细胞内具有最高醇脱氢酶活性的醇脱氢酶基因。
具体来说，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作为登录在酵母基因组数据库(Saccharomyces Genome Database)的醇脱氢酶基因的同源基因，已知有ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7等。其中优选使用ADH1基因。
本发明的导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)的酵母优选编码丙酮酸脱羧酶1的基因缺失、具有包含编码野生型丙酮酸脱羧酶5的基因的碱基序列的一部分被缺失、插入、替换和/或添加的碱基序列的突变型丙酮酸脱羧酶5基因的酵母。
本发明的导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)的酵母优选地为使PDC1基因缺失的酵母。通过使PDC1基因缺失，与PDC1基因野生型的比较，丙酮酸脱羧酶活性降低。已知如果使PDC1基因、PDC5基因一起缺失，可以使丙酮酸脱羧酶活性进一步降低，但在含有葡萄糖的培养基中，生长变得极差。因此，本发明中优选通过在PDC5基因导入突变，可以使来自PDC5基因的丙酮酸脱羧酶活性适度降低，使得控制酵母向乙醇的代谢途径成为可能。
具体来说，本发明的酵母优选酵母细胞内的丙酮酸脱羧酶的比活性降低到野生型酵母细胞内的比活性的3分之1以下。酵母细胞内的丙酮酸脱羧酶的比活性通过使PDC1基因缺失，有可能降低到野生型酵母的比活性的3分之1以下。酵母细胞内的丙酮酸脱羧酶的比活性可以通过下面的方法测定。
本发明中使用的酵母只要是可导入来自人或蛙的L-ldh基因的酵母即可，并没有限制，如属于酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母。优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，具体来说优选NBRC10505株、NBRC10506株。
下面对本发明的酵母的制备法进行更具体的说明，本发明的酵母的制备法可通过各种各样的方法实施。在此首先就酵母制备中使用的各种方法进行说明。
对于目的基因的克隆，如根据已知的基因情报，使用PCR(聚合酶链反应)法扩增取得必要的遗传区域的方法，或由基因组文库或cDNA文库以同源性或酶活性作为指标进行克隆的方法等。另外，根据已知的蛋白质情报也可使用化学合成或基因工程合成的方法。
作为整合克隆的目的基因的质粒，可以使用在酵母中广泛利用的质粒。在酵母中广泛利用的质粒具有在酵母细胞内自主复制必需的序列、在大肠杆菌细胞内自主复制必需的序列、酵母选择标志和大肠杆菌选择标志。而用于使整合的目的基因表达的表达质粒希望具有调节目的基因的表达的操纵基因、启动子、终止子或增强子等所谓的调节序列。所谓在酵母细胞内自主复制必需的序列，例如酵母的自主复制起点(ARS1)和着丝粒序列的组或酵母的2μm质粒的复制起点，所谓大肠杆菌内自主复制必需的序列是例如大肠杆菌的ColE1复制起点。
作为酵母选择标志，如URA3、LEU2、TRP1、HIS3等营养缺陷型互补的基因或G418抗性基因或新霉素抗性基因等药物抗性基因。作为大肠杆菌的选择标志如氨苄青霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因等抗生素抗性基因。
作为调节序列，只要是可表达目的基因的序列即可，并没有特别的限制，如已知在酵母高表达的编码醇脱氢酶(ADH)、丙糖磷酸脱氢酶(TDH)、丙酮酸脱羧酶(PDC)、细胞色素C1(CYC1)等基因的启动子和终止子区。但表达质粒不限于这些。
将上述质粒、表达质粒、线性化质粒、线性化表达质粒、PCR片段等DNA导入酵母的方法有转化、转导、转染、共转染和电穿孔等方法，具体来说，例如可通过使用乙酸锂的方法(Journal of bacteriology、1983年、153卷、p163-168)和原生质体法(原岛俊等人，Molecular Cell Biology、1984年、4卷、p771-778)等转化方法进行。另外也可使用BIO101公司生产的ALKALI CATION YEAST TRANSFORMATION KIT等实施。其中，在本发明中优选利用乙酸锂法的方法，但并不限定于此。
通过上述转化方法得到的转化酵母的培养方法可以运用例如(Methods In Yeast Genetics、1990年、M.D.Rose等人)等所述的公知的方法。选择培养基只要是不含有对应于在质粒、表达质粒和PCR片段导入的指标中利用的标志基因的营养成分的最小培养基，可以是任一种培养基。在本发明中最好是以下组成的培养基使用无氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogen base without amino acids)(DIFCO公司生产)0.67％，葡萄糖2.0％，除去标志基因的营养成分的撤除成分混合物(dropout mixture)(前面Methods in Yeast Genetics)所述的培养基，不限定于此。
另外作为目的基因的缺失方法，可通过使用通常酵母中使用的营养缺陷型标志基因或使用药物抗性基因等选择标志的目的基因座的同源重组进行。例如，可以利用URA3、LEU2、TRP1、HIS3等营养缺陷型标志基因(Methods in Enzymology，101卷，p.202-211，G-418)或药物抗性基因(Gene，1083年，26卷，p243-253)，不限定于此。
本发明的将来自人或蛙的L-ldh基因导入酵母的方法，例如克隆来自人或蛙的L-ldh基因，用整合了克隆有该基因的表达质粒转化酵母的方法，通过同源重组将克隆的该基因插入到染色体上的目的部位的方法等，但不限定于此。
通过在上述表达质粒的启动子下游导入来自人或蛙的L-ldh基因，获得可表达该基因的质粒。利用后述的方法通过用得到的来自人或蛙的L-ldh基因表达质粒转化酵母，可以将来自人或蛙的L-ldh基因导入酵母。
本发明的酵母优选编码L-乳酸脱氢酶的基因以在染色体上的丙酮酸脱羧酶1基因的启动子下游可表达的状态导入的酵母。
作为通过同源重组将来自人或蛙的L-ldh基因插入到染色体上的目的部位，优选插入到丙酮酸脱羧酶1基因(PDC1基因)的启动子下游的方法，例如使用所设计的为了在来自人或蛙的L-ldh基因的上游和下游添加与导入目的部位同源的部分的引物进行PCR(聚合酶链反应)，通过后述的方法用得到的PCR片段转化酵母的方法，但并不限定于该方法。另外，为了使转化酵母的选择容易进行，优选在上述PCR片段中含有酵母选择标志。
这里使用的制备PCR片段的方法可以通过例如下面(1)～(3)的步骤1～3的程序进行。其梗概如图1所示。
(1)步骤1以在来自人或蛙的L-ldh基因的下游连接了终止子的质粒作为模板，以引物1、引物2作为引物组，通过PCR对含有来自人或蛙的L-ldh基因和终止子的片段进行扩增。引物1按照能够添加40bp以上的与导入目的部位的上游侧同源的序列那样设计，引物2以从终止子开始的来自于下游质粒的序列为基础进行设计。添加在引物1的与导入目的部位的上游侧同源的序列优选是与PDC1基因上游同源的序列。
(2)步骤2以具有酵母选择标志的质粒例如pRS424、pRS426等作为模板，以引物3、引物4作为引物组，通过PCR对含有酵母选择标志的片段进行扩增。引物3按照能够添加30bp以上的与从步骤1的PCR片段的终止子开始的下游序列有同源性的序列那样进行设计，至于引物4按照能够添加40bp以上的与导入目的部位的下游侧同源的序列那样进行设计。添加在引物4的与导入目的部位下游侧同源的序列最好是与PDC1基因的下游同源的序列。
(3)步骤3通过以将步骤1，2得到的PCR片段混合后的混合物作为模板，以引物1、引物4作为引物组进行PCR，可以得到在两末端添加了与导入目的部位的上游侧和下游侧同源的序列的含有来自人或蛙的L-ldh基因、终止子和酵母选择标志的PCR片段。上述PCR片段优选是在两末端添加了与PDC1基因的上游以及下游同源的序列的含有来自人或蛙的L-ldh基因、终止子和标志基因的PCR片段。
将上述得到的来自人或蛙的L-ldh基因表达质粒或PCR片段导入酵母，当导入酵母选择标志时，以其标志为指标可以得到转化酵母。
通过对本发明的导入了来自人或蛙的L-ldh基因的酵母进行培养，在培养基中可以制造L-乳酸。当使导入的表达质粒保持在酵母内时，通过上述转化酵母的培养法可以在培养基中制造L-乳酸。在本发明中，所谓L-乳酸脱氢酶活性是表现出将丙酮酸和NADH转换为L-乳酸与NAD+的活性。L-乳酸脱氢酶活性有时以比活性作为指标进行比较。即，对L-ldh基因导入方法和遗传背景相同的酵母在相同条件下进行培养，使用从培养菌体提取的蛋白质，测定伴随着NADH的减少在340nm处的吸光度的变化。此时，通过在室温下以每1分钟使1μmol的NADH减少的酶量定义为1单位(Unit)，L-乳酸脱氢酶的比活性用数式1表示。其中，Δ340表示每1分钟的340nm的吸光度的减少量，6.22是NADH的毫摩尔分子吸光系数。


......(式1) 以下，对编码PDR13蛋白质的基因的一部分有突变的酵母的制作方法进行说明。
制备方法如 [1]使用在酵母的染色体DNA上通过转座子实施插入突变的基因突变酵母文库，从该文库选择与亲本株相比乳酸生产能力提高的酵母的方法， [2]使用同源重组法等，制造编码PDR13蛋白质的基因的一部缺损的酵母的方法，以及 [3]使用同源重组法等制造在染色体上具有这样的DNA的微生物的方法等，所述DNA编码具有在PDR13蛋白质的氨基酸序列中至少C末端侧的39个氨基酸残基不被翻译的缺失、替换或插入等突变的氨基酸序列。
上述[1]方法中所谓亲本株指的是供上述基因突变处理的原株，亲本株可以是野生型酵母，也可以是实施了产业上有用的改良的突变酵母、细胞融合酵母或使用基因重组技术制作的重组酵母。
作为[1]的基因突变文库的制作法，如由使用Yeast mTn PlasmidCollection(Open Biosystems公司生产)提供的转座子序列插入基因组文库通过限制性酶处理制备插入了转座子序列的DNA片段后，通过利用二次同源重组将该DNA片段导入染色体DNA而构建基因突变文库的方法。
通过将上述的基因突变文库作为筛选源使用，对转座子序列插入部位进行鉴定，可以观察向明确被限定的基因区域的插入突变对乳酸酸生产能力的影响。
作为从上述文库选择乳酸生产能力提高的酵母的方法，如对在该文库的各菌株中导入了编码乳酸生成酶的基因的表达质粒后得到的转化酵母进行培养，对生成的乳酸进行定量的方法。随着培养时间的推移的同时，乳酸蓄积越多，可认为乳酸的生成量越多。
在从上述文库选择乳酸生产能力提高的酵母中，可以以导入了L-ldh基因的酵母作为亲本株实施。导入的L-ldh的种类没有特别限制，但优选使用具有序列编号1、序列编号2或序列编号3所示的核酸序列的来自人、蛙或牛的L-ldh基因。
图3是表示本发明中使用的来自牛的L-Ldh表达用质粒pTRS57的结构图，图2是本发明中使用的质粒pTRS11的构建图。
作为L-ldh基因的表达方式，只要是在可以使基因表达的启动子的调控下连接该基因，通过向染色体导入进行表达或通过质粒进行表达等没有特别限定。例如，在醇脱氢酶1基因启动子的调控下，将连接了来自牛的L-Ldh基因的基因结构连接入pRS426的多拷贝表达质粒pTRS57、将来自人的L-Ldh基因连接入pTRS11的多拷贝表达质粒pTRS48。
按照常规方法将pTRS57导入文库的各菌株后制作转化酵母，通过对该转化酵母和供转化用的亲本株分别进行培养，然后通过测定生成的乳酸的生成量，可以选择较亲本株的乳酸生产能力提高的酵母。
具有pTRS57的转化酵母的培养只要是L-乳酸脱氢酶表达的培养法即可，并没有特别的限定，通过转化酵母的培养法可以实施。
培养液中的乳酸浓度可以通过使用HPLC的方法进行定量。例如，对培养液进行离心分离，取培养液上清，以该上清作为分析样品，使用乳酸分析用阴离子交换柱，通过测定电传导性对培养液的乳酸浓度进行定量。
通过进行同一时间培养，选择较亲本株表现出高的乳酸生产率的酵母，可以获得较亲本株的乳酸生产能力提高的酵母。
作为通过上述方法取得的乳酸生产能力提高的酵母，如在染色体DNA上具有将转座子DNA片段插入到编码PDR13蛋白质的基因(以下有时略称为PDR13基因)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[2]作为使用同源重组法等制造编码PDR13蛋白质的基因的一部分缺损的酵母的方法，如使用通过直链DNA可进行的染色体上同源重组的酵母的方法。作为直链DNA，例如，在TRP1基因的两端配置有与PDR13基因的内部或近旁的序列有同源性的DNA的直链DNA。
通过常规方法将该直链DNA导入到可通过直链DNA在染色体上进行同源重组的酵母，通过选择色氨酸缺陷型回复株，可以制作PDR13基因部分缺失酵母。
[3]作为使用同源重组法等制造在染色体上具有这样的DNA的微生物的方法，所述DNA编码具有PDR13蛋白质的氨基酸序列中至少C末端侧的39个氨基酸残基不被翻译的缺失、替换或插入等突变的氨基酸序列，如通过对PDR13基因导入位点特异的突变，制作编码在该基因编码的氨基酸序列中至少C末端侧的39个氨基酸残基不被翻译的缺失、替换或插入的氨基酸序列的突变型基因，通过使用同源重组法制作具有PDR13基因被替换为突变型PDR13基因的染色体DNA的酵母的方法等。
通过使用上述[1]、[2]、[3]公开的方法，可以制作这样的酵母，其为导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因、且具有包含野生型PDR13基因的DNA序列的一部分缺失、插入或替换而被突变的、该基因编码的蛋白质的一部分被翻译的DNA序列的突变型PDR13基因的酵母。
本发明的酵母优选为具有包含野生型醇脱氢酶的氨基酸序列的一部分被替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的突变型醇脱氢酶的、该突变型醇脱氢酶显示通过改变培养温度而使细胞内醇脱氢酶活性消失或降低的温度感受性的酵母。
本发明的酵母更优选具有包含野生型醇脱氢酶的氨基酸序列的一部分氨基酸的1个或数个氨基酸通过替换、缺失、插入和/或添加而被突变的氨基酸序列的突变型醇脱氢酶。其中替换、缺失、插入、添加的突变任一种可单独突变，或它们中的多个组合。
作为突变型醇脱氢酶，优选由ADH1基因编码的野生型醇脱氢酶的突变型，更优选包含序列编号39所示氨基酸一级序列的野生型醇脱氢酶1的突变型。还更优选突变型醇脱氢酶是在序列编号39所示的由野生型醇脱氢酶1的氨基酸序列中包含1个至数个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的突变型醇脱氢酶。
本发明的酵母具有的优选的突变型醇脱氢酶是包含序列编号40、序列编号41或序列编号42所示氨基酸序列的突变型醇脱氢酶。
所谓本发明的酵母具有的突变型醇脱氢酶的温度感受性指的是具有突变型醇脱氢酶的酵母与具有野生型醇脱氢酶的酵母比较，在某一培养温度时虽然表现出同等程度的醇脱氢酶活性，但如使培养温度变化，达到特定的培养温度以上时，表现出醇脱氢酶活性消失或降低的性质。由于细胞内醇脱氢酶的活性降低，糖同化能力下降，酵母在含糖培养基中的生长速度显著变慢，所以可以通过观察在含糖培养基的生长速度判断有无感受性。发明的酵母优选突变型醇脱氢酶在培养温度为摄氏30度以上，更优选在摄氏32度以上，进一步更优选在摄氏34度以上表现出温度感受性的酵母。
以下，有关具有有温度感受性的突变型醇脱氢酶的酵母的制作方法，虽然是以有温度感受性的突变型ADH1基因的酵母的情况为例叙述的，但这并不意味导入突变的基因限定于ADH1基因，另外上述酵母的制作方法也并不限定于此。
首先制作缺失了野生型ADH1基因的酵母。缺失可通过上述目的基因的缺失方法实施。酵母如果缺失了在细胞内担负主要的醇活性的ADH1基因座，对包含葡萄糖的糖的同化能力降低，在含糖培养基中的生长速度显著变慢。利用这一性质，可以由随机导入突变的ADH1基因群体筛选温度感受性的突变型ADH1基因。如果将导入了随机突变导入ADH1基因的转化酵母组在含葡萄糖的培养基上于通常的培养温度(室温～摄氏30度)进行培养，由于具有因导入突变而活性消失的ADH1基因的酵母变得不能生长，所以通过观察生长性，只选择在这个温度具有活性的ADH1基因的酵母。然后，将选择的酵母组在通常的培养温度以外(摄氏30度以上、或室温以下)使用含葡萄糖培养基进行培养，由于具有温度感受性突变型ADH1基因的酵母不能生长，就有可能进行导入了温度感受性突变型ADH1基因的酵母的负筛选。具体来说，例如将转化体在摄氏25度培养，对于生长的酵母，确认摄氏30度、34度、37度在含葡萄糖培养基中的生长，可以制作对于各个温度表现出感受性的酵母，培养温度并不限定于这些温度。
温度感受性突变酵母的制作方法有从自然界筛选、利用亚硝基胍、甲磺酸乙酯等药物处理、紫外线照射等突然突变的手法和利用PCR反应的基因工程的手法等。
作为利用基因工程手法在特定的基因导入突变的方法，有随机导入突变的方法和位点特异导入突变的方法。作为前者的随机导入突变的方法，通过使用随机突变导入用试剂盒(BD多样化PCR随机诱变(CLONTECH公司生产))；作为位点特异地导入突变的方法，通过使用位点特异的突变导入用试剂盒(Mutan-K(Takara Bio公司生产))的方法，制备具有突变的基因。其中，优选利用基因工程手法的制作方法，但并不限定于该方法。
至于这样得到的突变型ADH1基因的导入，可以利用缺口修复法(“酵母分子遗传学实验法”、学会出版中心、1996年)，即如果将突变型ADH1基因DNA片段和在克隆了ADH1基因的有自主复制能力的质粒中ADH1基因内缺失后线性化的产物同时导入酵母细胞，通过突变型ADH1基因DNA片段与缺失部分两端的同源性序列发生同源重组，进行缺失部分的修复，同时质粒闭环，恢复自主复制能力。具体来说，使用将克隆了ADH1基因的质粒用适当的限制性酶切得到的消除了突变导入靶区域DNA的质粒、以及使用适当的引物就ADH1基因区域在导入随机突变同时扩增的片段，通过同时导入到ADH1缺失的酵母，可以得到在突变导入靶区域导入了随机突变的突变型ADH1基因被克隆的环状质粒。
利用缺口修复法导入突变中使用的质粒可以使用在上述酵母中广泛利用的质粒。优选使用在酵母细胞内的拷贝数少的、例如YCp50、pRS315、pRS316、pAUR112或pAUR123等质粒，但不限定于此。此时在导入的ADH1基因区域，最好还含有存在于这个基因的上游区和下游区的调节该基因表达的操纵基因、启动子、终止子和增强子等所谓的调节序列。这样操作可以制作克隆到质粒的温度感受性突变型ADH1基因。
以下就具有温度感受性突变型ADH1基因的酵母的制作进行说明。
上述得到的温度感受性突变型ADH1基因已被克隆的质粒可以由经转化酵母取得。取得的方法没有特别限定，可以使用市售的酵母质粒回收试剂盒，例如YEASTMAKER酵母质粒分离试剂盒(Clonetech公司)等。如果用不切断得到的质粒的ADH1基因序列内的限制性酶消化、线性化后的产物转化上述那样制作的adh1缺失酵母，在与ADH1基因座邻接的DNA序列和线性化质粒的DNA序列的同源区域发生重组，在缺失ADH1的同时被替换为所用的标志基因和温度感受性突变型ADH1基因，可以得到具有目的的温度感受性突变型ADH1基因的酵母。这可通过应用“pop-in/pop-out法”(Methods in Enzymology、1987年、第154卷、p.164-174所述)实施。
作为确认醇脱氢酶表现出温度感受性的方法，如对于在感受性温度下培养的酵母细胞的破碎物，观测醇脱氢酶催化的由乙醇向乙醛的氧化反应，与具有野生型基因的酵母细胞比较，以具有突变型基因的酵母细胞的破碎物表现出的活性低作为指标的方法。
醇脱氢酶的活性在考虑了各醇脱氢酶同工酶催化反应的环境后决定测定的温度和pH条件，通过测定在该条件下的对乙醇的底物亲和性进行评价。例如，酿酒酵母的ADH1基因编码的醇脱氢酶的培养温度在摄氏34度的酶活性使用培养温度摄氏34度培养得到的培养的破碎物，用Tris盐酸缓冲液将pH调整到pH8.8，于反应温度定在摄氏30度的环境下以乙醇作为底物测定。活性可通过观测起因于与从乙醇向乙醛的氧化反应同时发生的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转换为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的还原反应的波长340nm处吸光度变化进行评价。此时通过将室温下每1分钟使1μmol的NADH减少的酶量定义为1单位(unit)，醇脱氢酶的比活性可用式(2)表示。其中Δ340nm表示每1分钟的波长340nm的吸光度的减少量，6.22是在光路长1cm时的NADH的毫摩尔分子吸光系数。


对于在各培养温度培养的本发明的突变型酵母细胞和野生型酵母细胞的破碎液，通过对在同样条件下进行醇脱氢酶活性的测定，对算出的醇脱氢酶的比活性进行比较，可以对在该培养温度的突变型醇脱氢酶的温度感受性进行评价。
通过使用上述公开的方法，可以制作导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)的酵母，所述酵母具有包含野生型醇脱氢酶的氨基酸序列的一部分被替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的突变型醇脱氢酶，该突变型醇脱氢酶由于改变培养温度，表现出细胞内的醇脱氢酶活性消失或降低的温度感受性。
作为编码酵母的丙酮酸脱羧酶的基因群体(PDC)，已知有编码丙酮酸脱羧酶1的基因(PDC1基因)、编码丙酮酸脱羧酶5的基因(PDC5基因)和编码丙酮酸脱羧酶6的基因(PDC6基因)这3种。其中，具有作为丙酮酸脱羧酶的主要功能的基因是PDC1基因和PDC5基因。
本发明的酵母优选PDC1基因缺失，而且具有包含野生型PDC5基因的碱基序列的一部分被缺失、插入、替换和/或添加的碱基序列的突变型PDC5基因的酵母。其中一部分碱基的缺失、插入、替换和/或添加的突变可以是任一种单独的突变，或它们的多个的组合。
本发明的酵母更优选编码野生型丙酮酸脱羧酶5的基因的碱基序列包含序列编号51所示的碱基序列的基因。
作为本发明的酵母具有的突变型PDC5基因，优选包含序列编号51所示的碱基序列的野生型PDC5基因的突变体。本发明的酵母更优选地编码突变型丙酮酸脱羧酶5的基因为包含序列编号52或53中任一个所示的碱基序列的基因。
本发明的酵母具有的突变型丙酮酸脱羧酶5最好是温度感受性的。这里的所谓丙酮酸脱羧酶5的温度感受性指的是具有突变型丙酮酸脱羧酶5的酵母与具有野生型丙酮酸脱羧酶5的酵母比较，在某一培养温度时，虽然表现出相同程度的丙酮酸脱羧酶活性，但如果使培养温度变化，达到特定的培养温度以上，丙酮酸脱羧酶5活性表现出消失或降低的性质。由于酵母细胞内的丙酮酸脱羧酶活性一旦降低，糖同化能力下降，在含糖培养基中的生长速度显著变慢，所以通过观察在含糖培养基中的生长速度可以判断有无感受性。本发明中优选突变型丙酮酸脱羧酶5在摄氏34度以上表现出温度感受性的酵母。
为了在PDC5基因导入突变，可利用通常运用的方法，通过改变PDC5基因的DNA序列实现。作为改变PDC5基因的方法，利用由那些突变株组制作具有温度感受性的ADH1基因的突变株的方法也可得到该酶活性下降的酵母。没有检测到丙酮酸脱羧酶活性的酵母当以葡萄糖作为唯一碳源时，生长显著变慢。如果利用这一性质制作了丙酮酸脱羧酶的酶活性低下酵母，在非限制温度条件下，由于丙酮酸脱羧酶活性残留，表现出与野生型酵母同等程度的生长能力。如果在限制温度条件下，制作由于该酶活性下降，生长能力显著下降的突变株，可以得到希望的具有温度感受性的突变型PDC5基因。
以下，对在本发明的导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)的酵母中，PDC1基因缺失、具有突变型PDC5基因的酵母的制作方法进行更具体的说明。首先为了进行本发明的突变型PDC5基因的筛选，制作使PDC1基因与PDC5基因两方都缺失的Δpdc1Δpdc5二重缺失酵母。其中记号“Δ”意思是“缺失”。
Δpdc1Δpdc5二重缺失酵母的制作的方法可通过上述目的基因的缺失方法实施，但不限定于此。酵母如果是属于酵母属的酵母，使用目的基因的缺失方法，制作Δpdc1单独缺失株、Δpdc5单独缺失株，通过四分子分离法从它们的2倍体也可以制作Δpdc1Δpdc5二重缺失酵母。
以下就突变型PDC5基因的制备方法进行叙述。制备的方法可通过上述温度感受性突变株的制作方法实施。虽然给出了通过利用PCR反应的基因工程的手法的制作方法，但并不限定于该方法。通过使用随机突变导入用试剂盒BD多样化PCR随机诱变试剂盒(CLONTECH公司生产)的方法也可以得到突变型PDC5基因。
对于在像上述那样得到的突变型PDC5基因的导入，可以通过使用上述同样的缺口修复法(“酵母分子遗传学实验法”、学会出版中心、1996年)实施。即，将突变型PDC5基因DNA片段和克隆了PDC5基因的有自主复制能力的质粒中PDC5基因内缺失后线性化的质粒同时导入Δpdc1Δpdc5二重缺失酵母中，可以得到在突变导入靶区域导入了随机突变的突变型PDC5基因被克隆的环状质粒。
以下，就具有突变型PCD5基因、缺失了PDC1基因的Δpdc1改变pdc5酵母的制作进行说明。从经转化酵母可取得上述得到的克隆了突变型PDC5基因的质粒。取得的方法没有特别限定，可以使用市售的酵母质粒回收试剂盒、例如YEASTMAKER酵母质粒分离试剂盒(Clonetech公司)等。然后使用“pop-in/pop-out法”，通过用不切断得到的质粒的PDC5基因序列内的限制性酶进行消化、线性化的质粒转化像上述那样制作的Δpdc1Δpdc5二重缺失酵母，可以得到目的的Δpdc1改变pdc5酵母。
以下，就通过突变型PDC5基因的导入，细胞内的丙酮酸脱羧酶活性变化的酵母的挑选方法进行说明。
作为丙酮酸脱羧酶活性变化的确认方法，对用缺口修复法得到的各个转化细胞进行培养的破碎物测定丙酮酸脱羧酶比活性，可以以与具有野生型PDC5基因的酵母比较的变化作为指标进行挑选。
与具有野生型PDC5基因的酵母相比，丙酮酸脱羧酶比活性低下的具有突变型PDC5基因的转化酵母细胞的挑选可以测定具有突变型PDC5基因的酵母的丙酮酸脱羧酶比活性，挑选与具有野生型PDC5基因的酵母相比，该酶比活性低下的细胞。另外，或者通过挑选突变型PDC5基因表现出温度感受性的转化酵母，可以挑选更理想的酵母。
以下对具有突变型PCD5基因、PDC1基因缺失的Δpdc1改变pdc5酵母的制作进行说明。
从经转化酵母取得上述得到的突变型PDC5基因被克隆的质粒。取得的方法并没有特别限定，可以使用市售的酵母质粒回收试剂盒、例如YEASTMAKER酵母质粒分离试剂盒(Clonetech公司)等。如果用不切断得到的质粒的PDC5基因序列内的限制性酶消化、线性化的质粒转化上述那样制作的Δpdc1Δpdc5二重缺失酵母，PDC5基因座邻接的DNA序列与线性化质粒的DNA序列的同源区域发生重组，在缺失PDC5的同时被替换为所使用的标志基因和突变型PDC5基因，可以得到目的的Δpdc1改变pdc5酵母。这可通过应用“pop-in/pop-out法”(Methods inEnzymology)、1987年、第154卷、p.164-174」所述)实施。
对上述挑选的酵母细胞内的丙酮酸脱羧酶活性的评价方法进行说明。该酶活性可以将以下(1)～(3)给出概略的Pronk等人的方法(Yeast，1996年，第12卷，1607-1633页)适当改变之后进行测定。
(1)在丙酮酸脱羧酶催化下由底物丙酮酸生成乙醛。
(2)醇脱氢酶以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)作为辅酶将(1)中生成的乙醛转换为乙醇。
(3)测定(2)中醇脱氢酶将乙醛转换为乙醇时减少的NADH量。
其中，如果(2)中减少的乙醛的量与(1)中生成的乙醛的量相等，(3)中测定的NADH的减少量与(1)中丙酮酸的减少量应当相等。即酵母细胞内的丙酮酸脱羧酶活性可以由上述反应体系的NADH减少量测定。
另外，酵母细胞内的丙酮酸脱羧酶活性可以以比活性作为指标进行比较。即从在相同条件下培养的酵母提取蛋白质，使用该提取液测定伴随着NADH的减少于波长340nm的吸光度的变化。此时，通过将在30℃时每1分钟使1μmol的NADH减少的酶量定义为1单位(Unit)，丙酮酸脱羧酶的比活性可以用下面的数式3表示。其中Δ340是每1分钟的波长340nm的吸光度的减少量，6.22是光路长1cm的NADH的毫摩尔分子吸光系数。通过在相同条件下进行测定、算出的丙酮酸脱羧酶的比活性可以对该酶活性进行比较。


......(式3) 通过使用上述公开的方法，可以制作导入了编码来自人或非洲爪蟾的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母，编码丙酮酸脱羧酶1的基因缺失、具有包含编码野生型丙酮酸脱羧酶5的基因的碱基序列的一部分被缺失、插入、替换和/或添加的碱基序列的突变型丙酮酸脱羧酶5基因的酵母。
本发明是导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母，但还包括至少包含下述的(1)～(3)特征中的任意2个以上特征的酵母。
(1)酵母，其为导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母，且为具有突变型PDR13基因的酵母，其中所述突变型PDR13基因包含野生型PDR13基因的DNA序列的一部分通过缺失、插入或替换而被突变的可翻译成该基因编码的蛋白质的一部分的DNA序列， (2)酵母，其为导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母，且为具有突变型醇脱氢酶的、该突变型醇脱氢酶显示通过改变培养温度而使细胞内醇脱氢酶活性消失或降低的温度感受性的酵母，其中所述突变型醇脱氢酶为包含野生型醇脱氢酶的氨基酸序列的一部分被替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的突变型醇脱氢酶，和 (3)酵母，其为导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母，且为编码丙酮酸脱羧酶1的基因缺失、具有包含编码野生型丙酮酸脱羧酶5的基因的碱基序列的一部分被缺失、插入、替换和/或添加的碱基序列的突变型丙酮酸脱羧酶5基因的酵母。
对至少含有两个上述(1)～(3)特征的突变基因的酵母的制备法进行说明。
具体来说，以具有一个突变基因的酵母作为亲本株，通过使用上述给出的具有另外的突变基因的酵母的制备方法可以制作。更具体来说，例如当制作同时具有突变型PDR13和突变型ADH1基因的酵母时，以具有突变型PDR13基因的酵母作为亲本株，如果做成具有突变型ADH1基因的酵母，就可以制作同时具有突变型PDR13与突变型ADH1基因的酵母。有关其它的突变基因的组合也可同样制作。
而酵母如果是属于酵母属的酵母，也可以由具有各个突变型基因的酵母接合后的2倍体通过四分子分离法制作。具体来说，当制作例如同时具有突变型PDR13与突变型ADH1基因的酵母时，由具有突变型PDR13的酵母与突变型ADH1基因的酵母接合后的2倍体通过四分子分离法可以制作同时具有突变型PDR13与突变型ADH1基因的酵母。其它突变基因的组合也可同样制作。
本发明还提供有效的L-乳酸的制造法。本发明的L-乳酸的制造方法优选包括对本发明的导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因(L-ldh基因)的酵母进行培养。
在对本发明的酵母进行培养制造L-乳酸的方法中，作为培养酵母的培养基，只要是含有该酵母可吸收利用的碳源、氮源、无机盐类等，可有效进行该酵母培养的培养基即可，可以使用天然培养基、合成培养基中的任一种。
作为碳源，只要是该酵母可吸收利用的即可，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖等糖类、含有这些糖类的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物。碳源可以在培养开始时一起添加，或在培养中分批地，或连续地添加，可以使用10g/l～200g/l的浓度。
作为氮源，可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆粕、大豆粕水解物、各种发酵菌体消化物等。
作为无机盐类，可以使用磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养可以通过振荡培养或搅拌培养等进行。氧供给条件并没有特别限定，可以在好氧条件下或微好氧条件下进行。培养温度在摄氏25～35度为好，培养时间通常为24小时～5天。培养中的培养液pH希望保持在2.5～5.0，pH的调整可以使用碱溶液、氨、碳酸钙等进行。
在制造L-乳酸时，首先通过对本发明的酵母进行前培养，然后将前培养液转移到新的培养基后进行本培养，可以在培养液中制造L-乳酸。培养温度只要是菌株的增殖没有被实质抑制，能够生产乳酸的范围即可，并没有特别限制，优选摄氏20～40度范围的温度，更优选摄氏25～37度范围的温度，最优选摄氏30～34度。培养可以采用静置、搅拌或振荡中的任一种方法。
通过在上述那样的条件下进行培养，在培养基中可以得到1～20％的乳酸。对于得到的L-乳酸的测定法没有特别限制，例如有使用HPLC的方法，或使用F-试剂盒(Roche公司生产)的方法等。
得到的培养液中的乳酸可以通过现有已知的方法进行纯化。例如，将对微生物进行离心分离的发酵液调整到pH1以下后用二乙醚或乙酸乙酯等萃取的方法，吸附于离子交换树脂、进行清洗后，进行洗脱的方法，在酸催化剂存在下与醇反应，成酯后进行蒸馏的方法，做成钙盐或锂盐晶析的方法等。
根据本发明，通过对导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母进行培养，与现有的导入了来自牛的编码L-乳酸脱氢酶的基因的酵母的培养相比，可以以高的对糖收率制造L-乳酸。另外作为来自导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母，通过对该酵母基因导入突变，进行培养，有可能进一步使收率提高。
实施例 以下通过实施例对本发明的实施方案进行说明，这些例子只是例示，对本发明没有任何限制。
下面有关分子遗传学的实施手法，只要没有特别指出，都是根据“分子克隆第3版(Molecular cloning，第3版)、1991年、(美国)”、“Methodsin Enzymology、1991年、美国、第194卷”、“Method in Yeast Genetics2000出版、2000年、美国”。
另外，PCR法只要没有特别指出，都是使用KOD-Plus聚合酶(东洋纺公司生产)或LA-Taq(宝酒造公司生产)，详细操作根据附带的程序进行。
(实施例1来自人或蛙的L-ldh基因表达质粒的制作) 在本发明中，作为来自人的L-ldh基因，使用具有序列编号1所示的核酸序列的L-ldh基因，而作为来自蛙的L-ldh基因使用具有序列编号2所示的核酸序列的来自于非洲爪蟾(Xenopus laevis)的L-ldh基因。来自人或蛙的L-ldh基因的克隆通过PCR法进行。作为取得来自人的L-ldh基因的PCR的模板，使用来自人乳癌株化细胞cDNA。由人乳癌株化细胞制备cDNA是通过对人乳癌株化细胞(MCF-7)进行培养回收后，使用TRIZOL试剂(Invitrogen公司生产)提取总RNA，以得到的总RNA作为模板，通过使用SuperScript选择系统(Invitrogen公司生产)的逆转录反应进行cDNA的合成。这些详细的操作根据附带的各个程序进行。作为取得来自蛙的L-ldh基因的PCR的模板，使用由非洲爪蟾的肾脏的cDNA文库(STRATAGENE公司生产)制备的噬菌粒DNA。噬菌粒DNA的制备根据附带的程序进行。
对于来自人的L-ldh基因扩增用引物(序列编号4，5)，按照在5末端侧添加XhoI识别序列、3末端侧添加NotI识别序列那样制作，对于来自蛙的L-ldh基因扩增用引物(序列编号6，7)，按照在5末端侧添加SalI识别序列、3末端侧添加NotI识别序列那样制作。对PCR扩增片段进行纯化，对末端用T4多核苷酸激酶(Takara Bio公司生产)进行磷酸化后，与pUC118质粒(用限制性酶HincII切，对切断处进行脱磷酸化处理的产物)连接。连接使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Bio公司生产)进行。用连接溶液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara Bio公司生产)，播在含有50μg/mL抗生素氨苄青霉素的LB板上，培养过夜。对于生长的菌落，回收质粒DNA，用限制性酶XhoI与NotI或SalI与NotI切，挑选插入了来自人或蛙的L-ldh基因的质粒。这一系列操作都根据附带的程序进行。
将上述的插入了来自人或蛙的L-ldh基因的pUC118质粒用限制性酶XhoI与NotI或SalI与NotI切，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，根据通用的方法纯化含有来自人或蛙的L-ldh基因的片段。将得到的含有L-ldh基因的片段与图2所示的表达质粒pTRS11的XhoI/NotI酶切位点连接，用与上述同样的方法回收质粒DNA，通过用限制性酶XhoI与NotI切，挑选插入了来自人或蛙的L-ldh基因的表达质粒。以后将这样制作的整合了来自人的L-ldh基因的表达质粒定为pTRS48、而将整合了来自蛙的L-ldh基因的表达质粒定为pTRS102。
(比较例1来自牛L-ldh基因的表达质粒的制作) 作为比较对象，制备导入了来自牛的L-ldh基因的酵母。
来自牛的L-ldh基因(序列编号3)的克隆用PCR法进行。由来自牛骨骼肌的cDNA文库(STRATAGENE公司生产)根据附带的程序制备的噬菌粒DNA作为模板，与实施例1同样进行PCR。而对于基因扩增用引物(序列编号8，9)，按照在5末端侧添加XhoI识别序列、在3末端侧添加NotI识别序列那样制作。
以下，通过与实施例1的插入了来自人的L-ldh基因的表达质粒同样的方法制作插入了来自牛的L-ldh基因的表达质粒。以后将这样制作的整合了来自牛的L-ldh基因的表达质粒定为pTRS49。
(实施例2pdc1基因缺失株的制作) 使用同源重组法制备将存在于酿酒酵母NBRC10505株的基因组DNA上的PDC1基因替换为TRP1基因的株(以下略记为Δpdc1株)。Δpdc1株像以下那样制作。通过以质粒pRS424为模板，使用包含序列编号10和11表示的碱基序列的DNA作为引物组的PCR，对在TRP1基因的5’上游添加了序列编号12所示的序列、3’下游添加了序列编号13所示的序列的DNA片段进行扩增。对扩增的DNA片段进行纯化，使用该DNA1μg对NBRC10505株进行色氨酸非缺陷型转化。将得到的转化株定为SW029株。
(实施例3来自人或蛙的L-ldh基因表达质粒向酵母的导入) 使用实施例1得到的pTRS48或pTRS102对SW029株进行尿嘧啶非缺陷型转化。来自人或蛙的L-ldh基因表达质粒导入这样得到的转化株的确认通过从转化株提取基因组，以它作为模板的PCR进行。对于确认用引物，使用克隆各个L-ldh基因时使用的引物(来自人的L-ldh基因序列编号4，5、来自蛙的L-ldh基因序列编号6，7)。结果在用pTRS48或pTRS102转化的株中，确认了分别导入了来自人或蛙的L-ldh基因。以下将上述导入pTRS48或pTRS102的转化株分别定为SW029/pTRS48株、SW029/pTRS102株。
(比较例2来自牛的L-ldh基因表达质粒向酵母的导入) 使用像比较例1那样得到的pTRS49，对SW029进行尿嘧啶非缺陷型转化。而来自牛的L-ldh基因表达质粒导入的确认用与实施例3同样的方法进行，作为引物使用序列编号8，9所示的寡核苷酸。以下将上述导入了pTRS49的转化株定为SW029/pTRS49株。
(实施例4来自人或蛙的L-ldh基因向酵母染色体的导入) 通过以实施例1得到的pTRS48或pTRS102作为扩增模板，寡核苷酸(来自人的L-ldh基因序列编号14，16、来自蛙的L-ldh基因序列编号15，16)作为引物组的PCR对含有来自人或蛙的L-ldh基因和GAPDH终止子序列的约1.3kb的DNA片段进行扩增(相当图1的步骤1)。其中序列编号14和15按照添加序列编号17所示的相当于PDC1基因的上游60bp的序列那样设计。
接下来，通过以质粒pRS424作为扩增模板，以寡核苷酸(序列编号18，19)作为引物组的PCR对含有作为酵母选择标志的TRP1基因的约1.2kb的DNA片段进行扩增(相当于图1的步骤2)。其中序列编号19按照添加序列编号20所示的相当于PDC1基因的下游60bp的序列那样设计。
对各个DNA片段进行纯化，通过将得到的含有L-ldh基因的各1.3kb片段、含有TRP1基因的1.2kb片段的混合物作为扩增模板，以寡核苷酸(来自人的L-ldh基因序列编号14，19、来自蛙的L-ldh基因序列编号15，19)作为引物组的PCR法对连接了来自人或蛙的L-ldh基因、GAPDH终止子和TRP1基因的约2.5kb的DNA片段进行扩增(相当于图1的步骤3)。
通过使用对上述约2.5kb的DNA片段进行了纯化的片段转化NBRC10505株，用没有添加色氨酸的培养基进行培养，选择来自人或蛙的L-ldh基因被导入到染色体上PDC1基因启动子下游的转化株。
像上述那样得到的转化株是在染色体上的PDC1基因启动子的下游导入了来自人或蛙的L-ldh基因的酵母的确认像下面那样进行。首先提取转化株的基因组，通过以此基因组作为扩增模板，以寡核苷酸(来自人的L-ldh基因序列编号14，21、来自蛙的L-ldh基因序列编号15，21)作为引物组进行PCR，确认得到的约2.8kb的扩增DNA片段。而在非转化株通过上述PCR得到约2.1kb的扩增DNA片段。以下将上述的在染色体上的PDC1基因启动子的下游导入了来自人的L-ldh基因的转化株定为L5株、在染色体上的PDC1基因启动子的下游导入了来自蛙的L-ldh基因的转化株定为B2株。
(实施例5、比较例3L-乳酸发酵试验1) 使用像实施例3、比较例2那样得到的SW029/pTRS48株、SW029/pTRS102株和SW029/pTRS49株进行L-乳酸生产率试验。
将从表1所示组成的培养基(以下作为乳酸发酵培养基)除去了尿嘧啶的培养基10mL加入到试管中，在试管中分别接种少量的SW029/pTRS48株、SW029/pTRS102株与SW029/pTRS49株，于30℃下培养过夜(前前培养)。然后将除去尿嘧啶的新鲜的乳酸发酵培养基100mL加入到500ml容量的三角烧瓶中，将各前前培养液分别全量接种，于30℃下振荡培养24小时(前培养)。然后在投入了1L的除去了尿嘧啶的乳酸发酵培养基的小型发酵罐(丸菱バイオエンジ公司生产、容量5L)，将从前培养开始24小时后的前培养液分别全量接种，在搅拌速度(120转/分钟)、通气量(0.1L/分钟)、温度(30℃)、pH(pH5)的条件下进行培养(本培养)。对本培养开始后40小时的培养液进行离心分离，对得到的上清进行膜过滤后，于下述所示的条件下通过HPLC测定L-乳酸量。
柱Shim-PackSPR-H(岛津公司生产) 移动相5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟) 反应液5mM对甲苯磺酸、20mM bis-Tris、0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/分钟) 检测方法电传导性 温度45℃。
葡萄糖浓度的测定使用葡萄糖Test Wako C(和光纯药)。
由测定结果算出的L-乳酸的对糖收率如表2所示。
表1


单位(/升) 表2
根据表2的结果，通过对导入了来自人或蛙的L-ldh基因的酵母进行培养，与导入了来自牛的L-ldh基因的酵母进行培养相比，可以以高的对糖收率制造L-乳酸。
(实施例6L-乳酸发酵试验2) 使用像实施例4那样得到的L5株和B2株，通过与实施例5同样的方法进行L-乳酸生产率试验。作为培养基使用表1给出的乳酸发酵培养基。
将乳酸发酵培养基10mL加入到试管中，在试管中分别接种少量的B2株和L5株，于30℃培养过夜(前前培养)。然后将新鲜的乳酸发酵培养基100mL加入到500ml容量的三角烧瓶中，将各前前培养液分别全量接种，于30℃振荡培养24小时(前培养)。然后在加入了1L乳酸发酵培养基的小型发酵罐(丸菱バイオエンジ公司生产、容量5L)中，将从前培养开始24小时后的前培养液分别全量接种，在搅拌速度(120转/分钟)、通气量(0.1L/分钟)、温度(30℃)、pH(pH5)的条件下进行培养(本培养)。对本培养开始后30小时的培养液进行离心分离，对得到的上清进行膜过滤后，在与实施例5同样条件下通过HPLC测定L-乳酸量。由测定结果算出的L-乳酸的对糖收率如表3所示的。
表3
根据表2和表3的结果，通过对在染色体上的PDC1基因启动子的下游导入了来自人或蛙的L-ldh基因的酵母进行培养，可以以与导入了L-ldh基因表达质粒的酵母进行培养的同等以上的对糖收率制造L-乳酸。
(实施例7、比较例4L-乳酸脱氢酶的活性) 使用实施例3、比较例2中得到的SW029/pTRS48株，SW029/pTRS102株和SW029/pTRS49株，比较pH5～7时的来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶活性和来自牛的L-乳酸脱氢酶活性。
(a)从菌体提取蛋白质 在试管中加入10mL的SC-Ura培养基，然后接种少量的SW029/pTRS48株、SW029/pTRS102株和SW029/pTRS49株，于30℃培养过夜(前培养)。然后将20mL的SC-Ura培养基加入到100mL容量的坂口烧瓶中，然后以2％接种量接种前培养液，振荡培养24小时(本培养)。通过对10mL的本培养液进行离心、集菌，用10mL的磷酸缓冲液清洗后，悬浮于1mL的磷酸缓冲液。将上述菌体悬浊液移到Eppendorf管，再加等量的玻璃珠(SIGMA公司生产、直径0.6mm)，用MicroTubeMixer(TOMY公司生产)于4℃破碎菌体。像上述那样操作破碎菌体后，将离心得到的上清作为L-乳酸脱氢酶液(以下略记为L-Ldh酶液)。
(b)L-乳酸脱氢酶活性测定 以牛IgG(1.38mg/mL、BIO-RAD公司生产)作为标准制作的校准线作为基础，使用BCA蛋白测试试剂盒(PIERCE公司生产)测定(a)中得到的L-Ldh酶液的浓度，各L-Ldh酶液按照终浓度达到0.5mg/mL那样用灭菌水稀释。然后，将表4所示的6水准比例的混合液(除去L-Ldh酶液和NADH)分注到半微量比色杯，在开始测定前加L-Ldh酶液和NADH，并混合。这里所谓2xBR缓冲液是用5N NaOH分别将0.08M乙酸、磷酸、硼酸溶液调到pH5，6，7的缓冲液。
表4

用分光光度计(Ultrospec3300Pro Amersham公司制)测定各水准下340nm处的吸光度的减少，将得到的Δ340的值带入式(1)，分别算出比活性。测定在pH5，6，7等3水准下进行。在上述测定中，作为比较对象的L-乳酸脱氢酶的比活性与来自牛的L-乳酸脱氢酶的比活性相比，当3个pH水准中2个水准以上高时，确定在pH5～7，作为该比较对象的L-乳酸脱氢酶比来自牛的L-乳酸脱氢酶活性具有更高的活性。算出结果如表5所示。
表5
由该结果可知在pH5～7，来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶活性比来自牛的L-乳酸脱氢酶的活性高。另外，由表2的结果可知通过对本发明的导入了来自人或蛙的L-ldh基因的酵母进行培养，可以以比对导入了来自牛的L-ldh基因的酵母进行培养还高的对糖收率制造L-乳酸。
由表2和表5的结果可知通过对导入了编码在pH5～7的L-乳酸脱氢酶活性比来自牛的L-乳酸脱氢酶活性高的L-乳酸脱氢酶的酵母进行培养，可以以比对导入了来自牛的L-ldh基因的酵母进行培养还高的对糖收率制造L-乳酸。
(实施例8通过转座子序列插入进行基因突变株文库的制作) 用同源重组制备存在于NBRC10505株的基因组DNA上的PDC1基因座缺失的基因重组株(以下略记为pdc1Δ0株)。pdc1Δ0株像以下那样制备。通过以NBRC10505株的基因组DNA作为模板，使用包含序列编号24和25表示的碱基序列的引物组的PCR，对由含有PDC1基因的5’上游约500碱基对的序列编号26表示的碱基序列构成的DNA片段进行扩增。另外通过使用由序列编号27和28表示的碱基序列构成的引物组的PCR对由含有PDC1基因的3’下游500碱基对的序列编号29表示的碱基序列构成的DNA片段进行扩增。对扩增的DNA片段进行纯化，通过将2种该DNA片段等量混合，以该混合液作为模板，使用包含序列编号24和28表示的碱基序列的引物组的PCR，对包含连接了PDC1基因的5’上游500碱基对和3’下游500碱基对的序列编号30表示的碱基序列的DNA片段进行扩增。对扩增的DNA片段进行纯化，将该DNA用限制性酶KpnI处理，将得到的DNA片段与质粒pRS416连接(以下略记为pdc1-pRS416)。将pdc1-pRS416质粒DNA用限制性酶EcoRV消化，使用该DNA片段100ng对NBRC10505株进行尿嘧啶非缺陷型转化。将得到的转化体涂布于1g/L的添加了5-氟乳清酸的培养基，以生长下来的转化体的基因组DNA作为模板，使用包含序列编号31和32表示的碱基序列的引物组进行PCR，选择缺失了PDC1基因的株。
然后，使用pTRS57质粒DNA10ng对pdc1Δ0株进行色氨酸非缺陷型转化。pTRS57是将在ADH1启动子的调控下连接了来自牛的L-ldh基因的结构导入到pRS424的多拷贝表达质粒，图3给出了它的结构。
接下来，以用pTRS57转化的株作为宿主，将由Yeast mTn PlasmidCollection(Open Biosystems公司生产)制备的转座子文库用限制性酶NotI处理，使用得到的DNA片段进行尿嘧啶非缺陷型转化。
(实施例9以乳酸生产作为指标的L-乳酸生产能力提高的酵母株的筛选) 将实施例8中制作的重组株用SC-Ura培养基于30℃温度振荡培养过夜。将10μl的该培养液接种在1ml的SC-Ura培养基，于30℃温度振荡培养。培养开始40小时后，对培养液进行离心分离，测定上清的乳酸浓度。乳酸的定量使用F-kit(L-乳酸)(J·K International公司生产)。
测定结果就像表6所示那样，作为亲本株的pdc1Δ0株导入了pTRS57的株在40小时生成3.6g/l的乳酸。在此，作为在反应40小时乳酸的生成比pdc1Δ0/pTRS57株更多的株，选择在PDR13基因插入了转座子的株(以下略记为pdr13::mTn株)。
表6
(实施例10PDR13基因插入突变株的制作和L-乳酸生产能力的评价) DNA碱基序列解析的结果表明实施例9取得的pdr13::mTn株，转座子序列被插入到了从基因组DNA上的PDR13基因的起始密码子开始第1599位与第1560位碱基间。为了再构建对PDR13基因的插入突变，通过以质粒pRS424为模板，使用包含序列编号33和34表示的碱基序列的DNA作为引物组的PCR，对在TRP1基因的5’上游添加了序列编号35表示的序列、3’下游添加了序列编号36表示的序列的DNA片段进行扩增。对PCR扩增片段进行纯化，使用10μg该DNA对pdc1Δ0株进行色氨酸非缺陷型转化。将得到的转化株定为pdr13_1599株。然后使用实施例1中得到的pTRS48对pdr13_1599株进行尿嘧啶非缺陷型转化。将得到的转化株定为pdr13_1599/pTRS48株。
将制作的重组株pdr13_1599/pTRS48株使用10mlSC-Ura培养基于30℃温度振荡培养过夜。将100μl的该培养液接种在10ml的SC-Ura培养基，于30℃温度振荡培养。于培养开始16小时后、24小时后和40小时后分别取1ml培养液样品，对该培养液进行离心分离，测定上清的乳酸浓度。乳酸的定量使用F-kit(L-乳酸)(J·K International公司制)。结果如表7所示。
表7
(实施例11PDR13基因部分缺失株的制作和L-乳酸生产能力的评价) 制备缺失PDR13基因的1560碱基至1716碱基区域的突变株pdr13_100株，测定乳酸生产率。将pdc1Δ0/pTRS48株和pdr13_1599/pTRS48株用10ml的SC-Ura液体培养基于30℃温度振荡培养过夜。将100μl该培养液接种在10ml的新的SC-Ura液体培养基，从培养开始16小时后、24小时后和40小时后分别取1ml样品，通过利用实施例5所述的HPLC的方法对乳酸的产量进行定量。
结果就像表8所示的那样，与作为亲本株的pdc1Δ0/pTRS48株相比乳酸生成量增加了。
表8
上述区域缺损株像以下那样制作。通过以质粒pRS424为模板，使用包含序列编号33和37表示的碱基序列的DNA作为引物对进行PCR，使TRP1基因的5’上游添加了序列编号35表示的序列、3’下游添加了序列编号38表示的序列的DNA片段扩增。对PCR扩增片段进行纯化，用该DNA1μg对pdc1Δ0株进行色氨酸非缺陷型转化。将得到的转化株定为pdr13_100株。然后用pTRS48对pdr13_100株进行尿嘧啶非缺陷型转化。将得到的转化株定为pdr13_100/pTRS48株。
(实施例12PDR13基因部分缺失株的制作和L-乳酸生产能力的评价) 通过以质粒pRS423为模板，使用包含序列编号33和37表示的碱基序列的DNA作为引物对的PCR，使在HIS3基因的5’上游添加了序列编号35表示的序列、3’下游添加了序列编号38表示的序列的DNA片段扩增。纯化PCR扩增片段，用该DNA1μg对实施例2得到的SW029株进行组氨酸非缺陷型转化。将得到的转化株定为Δpdr13100株。接下来用pTRS48对Δpdr13_100株进行尿嘧啶非缺陷型转化。将得到的转化株定为pdr13_100/pTRS48株。
将制作的重组株pdr13_100/pTRS48株于10ml SC-Ura培养基在30℃温度振荡培养24小时。将10ml的该培养液接种至100ml的SC-Ura培养基，于30℃温度振荡培养24小时。将100ml的该培养液接种至2.0L的SC-Ura培养基，于30℃温度使用小型发酵罐进行培养，对L-乳酸的产量进行定量。培养在以下的条件下进行。
·发酵装置Bioneer-N(丸菱バイオエンジ公司制) ·培养温度30℃ ·通气量0.5vvm ·搅拌速度800转/分钟 ·pH5.0 ·中和剂2N NaOH溶液 结果如表9和表10所示的那样，与作为亲本株的Δpdc1/pTRS48株相比，L-乳酸的生成量增加了。
表9
表10
(实施例13具有温度感受性突变型ADH1基因的酵母的制作) 利用同源重组制备将存在于NBRC10505株的基因组DNA的ADH1基因替换为URA3基因的酵母。通过以质粒pRS313为模板，使用包含序列编号43和序列编号44表示的碱基序列的DNA作为引物对的PCR，使在HIS3基因的5’上游添加了序列编号45表示的序列、3’下游添加了序列编号46表示的序列的DNA片段扩增。对扩增的DNA片段进行纯化，用1μg该DNA对NBRC10505株进行尿嘧啶非缺陷型转化。将得到的转化株定为Δadh1株。
然后以NBRC10505株的基因组DNA为模板，使用序列编号47与序列编号48所示的引物使含有ADH1基因的上游区700bp与ADH1结构基因、以及下游区200bp的DNA片段扩增。基因扩增用引物(序列编号47，48)按照在5末端侧添加SacI识别序列、在3末端侧添加SmaI识别序列那样制作。将扩增的片段与pUC118的HincII/BAP处理片段连接。根据通用的方法得到目的质粒pUC118_ADH1。
然后将pUC118_ADH1用限制性酶SacI/SmaI切，对反应溶液进行琼脂糖电泳。将约2kb的片段切出，从切出的凝胶提取DNA片段。将提取的DNA片段通过连接反应插入到pRS316，得到目的质粒pRS316_ADH1。
然后为了使用缺口修复法向质粒上的ADH1基因导入突变，对于pRS316_ADH1用限制性酶BalI与PflFI切，制作ADH1结构基因内缺失的开环质粒。限制性酶反应溶液进行琼脂糖电泳，切出约7kb的片段，从切出的凝胶中提取DNA片段。再根据常法进行乙醇沉淀。
接下来，制作用于利用缺口修复法导入突变的突变导入ADH1基因片段。片段的制作使用序列编号49与50所示的引物和随机突变导入用试剂盒BD多样化PCR随机诱变试剂盒(CLONTECH公司生产)进行。详细操作根据附带的说明书进行。得到的片段根据常法进行乙醇沉淀，浓缩至200ng/μl。
用得到的开环质粒500ng与突变导入ADH1基因片段1mg对Δadh1株进行尿嘧啶非缺陷型转化。作为宿主的Δadh1株由于是糖的吸收利用能力低下的株，所以在含有葡萄糖的培养基中不能很快生长。因此，转化后，将在SC-Ura培养基上在第2天为止形成菌落的株当作处于导入的pRS316_ADH1的DNA上的突变型ADH1基因在培养的温度具有醇脱氢酶活性的株进行挑选。
将挑选的具有pRS316_ADH1的转化体按照每1板100个菌落程度那样涂布在SC-Ura培养基上，于25℃培养48小时，将它复制在4块新的SC-Ura平板培养基，于25℃、30℃、34℃、37℃进行培养，对生长状况进行对比比较。将在30℃、34℃、37℃任一培养温度都不生长的菌落当作质粒上的ADH1变成了温度感受性的株进行分离。其中，取得了于34℃变为温度感受性的酵母株“pADH1ts-1株”、“pADH1ts-2株”、“pADH1ts-3株”这3株。
对于得到的3株温度感受性pADH1ts株，分别提取质粒。使用提取的质粒转化大肠杆菌DH5α，根据常法从培养液取得质粒。将得到的质粒用限制性酶SacI/SmaI切，使用切断溶液进行ΔADH1株的转化。得到的培养液涂在YPAD平板培养基上，于25℃培养48小时。由于Δadh1株在含有葡萄糖的板不生长，生长的菌落当作Δadh1基因座重组了温度感受性ADH1基因，将它作为温度感受性ADH1基因被整合在染色体上的酵母(ADH1ts-1株、ADH1ts-2株、ADH1ts-3株)。
另外，对于得到的温度感受性酵母ADH1ts-1株、ADH1ts-2株、ADH1ts-3株具有的温度感受性ADH1ts基因座，确定DNA碱基序列，由该序列确定氨基酸序列，判明分别具有序列编号40、41、42所示的氨基酸一级序列。
(实施例14具有温度感受性突变型ADH1基因的酵母的醇脱氢酶活性的测定) 对于实施例13得到的具有温度感受性突变型ADH1基因的酵母ADH1ts-1株、ADH1ts-2株、ADH1ts-3株，测定醇脱氢酶活性。将各株分别接种于20mL的YPD液体培养基，于30℃培养20小时。对培养液进行集菌，加50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)200μl和玻璃珠(SIGMA公司生产，直径0.6mm)0.2g，于4℃进行30分钟涡旋。涡旋后通过离心分离收取上清。对于各个破碎液上清，以牛IgG(1.38mg/mL，BioRad公司制)作为标准制作的校准线为基础通过BCA蛋白测试试剂盒(Pierce公司生产)进行测定，确定蛋白质浓度。
然后测定各株的醇脱氢酶活性。活性测定是通过在含有53mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、20mM丙酮酸钠、0.19mM还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、0.21mM硫胺素焦磷酸、5.3mM氯化镁的反应液190μl中添加10μl得到的上清，通过分光光度计(Ultraspec3300Pro，Amersham Bioscience公司制)测定添加后于波长340nm处的吸光度的变化。将得到的吸光度变化量相当于上面式(2)的Δ340nm，通过将醇脱氢酶活性分别用各个蛋白质浓度除，算出各醇脱氢酶比活性。结果如表11所示。
(比较例5野生型酵母的醇脱氢酶活性的测定) 然后对于NBRC10505，与实施例14同样测定醇脱氢酶活性。测定结果如表11所示。
表11
根据表11所示的实施例14和比较例5的结果判明实施例13中得到的具有温度感受性突变型ADH1基因的酵母(ADH1ts-1株、ADH1ts-2株、ADH1ts-3株)在30℃的醇脱氢酶活性比野生株(NBRC10505株)低。
(实施例15通过具有温度感受性突变型ADH1基因的酵母进行乳酸发酵) 向实施例13中制作的转化体导入L-ldh基因，使用得到的酵母利用小型发酵罐进行发酵试验，测定L-乳酸产量，测定具有温度感受性突变型ADH1基因的酵母的乳酸产量和乙醇产量。
在本实施例中，作为L-ldh基因使用具有序列编号1所示的核酸序列的来自人的L-ldh基因。
用与实施例4同样的方法，制备将来自人的L-ldh基因分别导入到ADH1ts-1株、ADH1ts-2株、ADH1ts-3株染色体上PDC1基因启动子下游的转化株。另外，来自人的L-ldh基因被导入到染色体上PDC1基因启动子下游的酵母的确认也用与实施例4同样的方法进行。以下将上述来自人的L-ldh基因导入到染色体上PDC1基因启动子的下游的转化株分别定为ADH1ts-1-L株、ADH1ts-2-L株、ADH1ts-3-L株。
将10mL乳酸发酵培养基加到试管中，然后接种少量ADH1ts-1-L株、ADH1ts-2-L株、ADH1ts-3-L株，于30℃、120转/分钟振荡培养过夜，作为前前培养液。然后，将100mL新鲜的乳酸发酵培养基加到500mL容量的三角烧瓶中，将各前前培养液全量接种，于30℃振荡培养24小时(前培养)。然后使用加入了1L乳酸发酵培养基的小型发酵罐进行培养，对L-乳酸的产量进行定量。使用小型发酵罐的培养按照以下条件进行。
·发酵装置Bioneer-N(丸菱バイオエンジ公司生产) ·培养温度30℃ ·通气量0.1vvm ·搅拌速度120转/分钟 ·pH5.0 ·中和剂1N NaOH溶液 收集培养开始后40小时的培养液，测定L-乳酸和乙醇产量。另外，乙醇产量的测定使用Shimadzu GC-2010毛细管GC TC-1(GL science)15meter L.*0.53mm I.D.，df＝1.5μm，通过氢焰离子化检测器检测、评价。这些结果如表12所示。
(比较例6通过具有野生型ADH1基因的酵母进行乳酸发酵) 使用实施例4制作的具有野生型醇脱氢酶的L5株与实施例15同样通过小型发酵罐进行发酵试验，测定L-乳酸产量和乙醇产量。这些结果如表12所示。
(实施例16通过具有在培养温度32℃的温度感受性突变型ADH1基因的酵母进行乳酸发酵) 使用实施例15中制作的转化体ADH1ts-1-L株，在ADH1ts-1-L株具有的醇脱氢酶表现出温度感受性的培养温度32℃利用小型发酵罐进行发酵试验，测定L-乳酸产量，测定具有温度感受性突变型ADH1基因的酵母的乳酸产量与乙醇产量。
将10mL乳酸发酵培养基加到试管中，然后接种少量ADH1ts-1-L株，于30℃、120转/分钟振荡培养过夜，作为前前培养液。然后，将100mL新鲜的乳酸发酵培养基加到500mL容量的三角烧瓶中，将各前前培养液全量接种，于30℃振荡培养24小时(前培养)。然后使用加入了1L乳酸发酵培养基的小型发酵罐进行培养，对L-乳酸的产量进行定量。培养按照以下条件进行。
·发酵装置Bioneer-N(丸菱バイオエンジ公司生产) ·培养温度32℃ ·通气量0.1vvm ·搅拌速度120转/分钟 ·pH5.0 ·中和剂1N NaOH溶液 采取培养开始后40小时的培养液，测定L-乳酸和乙醇产量。结果如表12所示。
表12
就像表12所示那样，具有本发明的温度感受性突变型ADH1基因的酵母(ADH1ts-1-L株、ADH1ts-2-L株、ADH1ts-3-L株)在培养温度30℃培养(实施例15)来说，与具有野生型醇脱氢酶的酵母(L5株)在同样温度培养(比较例6)比较，确认获得了L-乳酸产量上升，乙醇产量降低的效果。
另外就具有本发明的温度感受性突变型ADH1基因的酵母(ADH1ts-1-L株)在培养温度32℃培养(实施例16)来说，与培养温度30℃的发酵试验结果(实施例15)相比，确认获得了L-乳酸产量进一步上升，乙醇产量降低的效果。
(实施例17Δpdc1、Δpdc5二重缺失株的制作) 像下述那样制作缺失了存在于NBRC10506株的基因组DNA上的PDC5基因的酵母。通过以质粒pRS406作为扩增模板，寡核苷酸(序列编号54，55)作为引物组的PCR对1.3kb的URA3基因DNA片段进行扩增。对扩增的DNA片段进行纯化，用该DNA片段对NBRC10506株进行尿嘧啶非缺陷型转化。得到的转化细胞应当是基因组DNA上的PDC5基因被URA3基因替换的Δpdc5缺失株。为了确认是否替换，通过对以基因组DNA作为扩增模板，序列编号56和序列编号57表示的寡核苷酸作为引物组的PCR得到的扩增产物进行琼脂糖电泳。当基因组DNA上的PDC5基因被URA3基因替换时，可得到1.2kb的扩增产物。而当没有被替换时，可得到1.9kb产物。根据得到的1.2kb产物，将该转化体定为PDC5基因缺失的SW011株。Δpdc1Δpdc5二重缺失株像下面那样制作。使上述得到的SW011株和实施例2中得到的SW029株接合获得2倍体细胞。使该2倍体细胞在子囊形成培养基中形成子囊。用显微操作设备解剖子囊，用YPAG培养基使各个胞子生长，得到各自的一倍体细胞。对得到的一倍体细胞的营养缺陷型进行研究。目的Δpdc1Δpdc5二重缺失株应当表现出尿嘧啶和色氨酸非缺陷型。研究营养供给性的结果显示尿嘧啶和色氨酸非缺陷型。通过以得到的尿嘧啶和色氨酸非缺陷型株的基因组DNA作为扩增模板，序列编号58与序列编号59表示的寡核苷酸、以及序列编号56与序列编号57表示的寡核苷酸作为引物组的PCR可确认PDC1基因和PDC5基因被缺失。将这个Δpdc1Δpdc5二重缺失株定为SW012株。确认SW012株在以葡萄糖作为唯一碳源不能生长。
通过以质粒pRS403作为扩增模板，以序列编号54和序列编号55表示的寡核苷酸作为引物组的PCR对1.3kb的HIS3基因DNA片段进行扩增。对扩增的DNA片段进行纯化、用该DNA片段对NBRC10506株进行组氨酸非缺陷型转化。得到的转化细胞应当为基因组DNA上的PDC5基因被HIS3基因替换的Δpdc5缺失株。为了确认，对通过以基因组DNA作为扩增模板，序列编号56和序列编号57表示的寡核苷酸作为引物组的PCR得到的扩增产物进行电泳。当基因组DNA上的PDC5基因被HIS3基因替换时可得到1.3kb的扩增产物。而当未被替换时可得到1.9kb产物。根据得到的1.3kb产物可将该转化体定为pdc5缺失的SW013株。Δpdc1Δpdc5二重缺失株像下面那样制作。使上述得到的SW013株和实施例2中得到的SW029株接合，得到2倍体细胞。使该2倍体细胞在子囊形成培养基形成子囊。用显微操作设备解剖子囊，在YPAG培养基中使各个子囊生长，得到各自的一倍体细胞。对得到的一倍体细胞的营养缺陷型进行研究。目的Δpdc1Δpdc5二重缺失株应当表现出组氨酸和色氨酸非缺陷型。研究营养供给性的结果表明通过以得到的组氨酸和色氨酸非缺陷型株的基因组DNA作为扩增模板，序列编号58与序列编号59表示的寡核苷酸、以及序列编号56与序列编号57表示的寡核苷酸作为引物组的PCR可确认PDC1和PDC5基因缺失。将该Δpdc1Δpdc5二重缺失株定为SW014株。确认SW014株在以葡萄糖作为唯一碳源不能生长。
(实施例18pdc5温度感受性突变基因的取得) 通过以BY4741株的基因组DNA作为模板，序列编号60与序列编号61表示的寡核苷酸作为引物组的PCR可得到含有PDC5基因的2.7kb的扩增DNA片段。将该片段用NotI消化，插入到预先用NotI消化的质粒pRS316的NotI间隙。用得到的质粒pRS316-PDC5对SW013株进行尿嘧啶非缺陷型转化。确认该转化体以葡萄糖作为唯一碳源，生长能力恢复，而且在37℃下具有生长能力。利用常法从该转化体回收质粒pRS316-PDC5，利用常法确定插入到pRS316的2.7kb的碱基序列，确认pRS316-PDC5含有PDC5基因。
然后通过以质粒pRS316-PDC5作为扩增模板，序列编号62与序列编号63表示的寡核苷酸作为引物组，使用BD多样化PCR随机诱变试剂盒(Clonetech公司生产)的PCR得到编码PDC5的1.7kb的扩增DNA片段。通过使用该试剂盒的PCR，在DNA扩增时导入突变频率变高，上述得到的1.7kb片段与通过通常的PCR得到的片段比较，含有含突变的片段的频率高。用得到的1.7kb片段与将质粒pRS316-PDC5用限制性酶Van91I、Bpu1102I消化成线性的质粒片段对SW014株进行尿嘧啶非缺陷型转化，通过使用SC-Ura培养基，于25℃保温，选择生长的转化体。通过应用缺口修复法的方法引起上述1.7kb片段与线性化质粒同源重组，只有获得了再环化的质粒的细胞在生长。将得到的转化体群体在新鲜的SC-Ura培养基中繁殖，于34℃保温。在繁殖的转化体群体中，选择2株在34℃不生长的转化体，作为pdc5温度感受性突变pdc5ts-9、和pdc5ts-11。利用常法从该转化体回收质粒，确定对应于上述1.7kb扩增DNA片段的碱基序列。结果表明pdc5ts-9是序列编号52表示的结构基因DNA的第1697位的碱基由C替换为T的一碱基替换突变，而pdc5ts-11是序列编号53表示的结构基因DNA的第701位的碱基由C替换为T的一碱基替换突变。将各个该质粒定为具有pdc5温度感受性突变等位基因的pRS316-pdc5ts9和pRS316-pdc5ts11。
(实施例19pdc5ts突变株的制作) 将质粒pRS316-pdc5ts9和pRS316-pdc5ts11用NotI消化，得到含有pdc5ts9和pdc5ts11突变基因的2.7kb片段。用该片段对SW012株进行尿嘧啶缺陷型转化，选择在5-FOA培养基于25℃保温时生长的转化体。将得到的转化体群体在新鲜的SC培养基繁殖，于34℃保温。在繁殖的转化体群体中选择于34℃下不生长的转化体，定为pdc5ts9温度感受性突变株SW015株、pdc5ts11温度感受性突变株SW016株。
(实施例20pdc5ts突变株的诸性质) 对PDC野生型株、Δpdc1缺失株和Δpdc1pdc5温度感受性株的PDC活性进行测定。
(a)从菌体提取蛋白质 从琼脂培养基上分别取少量NBRC10505株、SW029株、SW015株和SW016株，接种到3mL的YPD液体培养基，培养过夜(前培养)。在20mL新的YPD液体培养基中以1％接种量接种前培养液，使用100mL容量的坂口烧瓶于30℃温度振荡培养24小时(本培养)。通过对10mL本培养液进行离心分离集菌，用10mL的磷酸缓冲液清洗后，悬浮于1mL的磷酸缓冲液。将上述菌体悬浊液移至Eppendorf管，再加等量的玻璃珠(SIGMA公司生产、直径0.6mm)，使用MicroTubeMixer(TOMY公司生产)于4℃破碎菌体。通过这样操作破碎菌体后，将离心分离得到的上清作为PDC酶液。
(b)PDC活性测定 以牛IgG(1.38mg/mL、BIO-RAD公司生产)作为标准制作的校准线为基础，使用BCA蛋白测试试剂盒(PIERCE公司生产)测定上述(a)中得到的PDC酶液的浓度，用灭菌水按照各个PDC酶液终浓度达到2mg/mL那样进行稀释。然后，按照表13给出的比例将除去PDC酶液和NADH的混合液分注到半微量比色杯，在开始测定前加PDC酶液和NADH，并混合。
表13

用分光光度计(Ultrospec3300Pro，Amersham公司生产)测定各PDC酶液在340nm处吸光度的减少，将得到的Δ340值带入式(1)，就5mM丙酮酸钠算出各PDC的比活性。结果如表14所示。
表14
上述结果表明具有突变型PDC5基因的pdc5ts9温度感受性突变株SW015株、pdc5ts11温度感受性突变株SW016株的PDC比活性为NBRC10505株的1/3以下，而且比SW029株更低，通过取得PDC5基因的温度感受性突变酵母，可以得到PDC比活性低下的酵母。
(实施例21使用pdc5温度感受性突变株的乳酸发酵试验(1)) 进行上述取得的pdc5温度感受性突变株的乳酸发酵试验。通过使用实施例1中得到的来自人的L-ldh基因表达质粒pTRS48对SW015株和SW016株进行尿嘧啶非缺陷型转化，将来自人的L-ldh基因导入pdc5温度感受性突变株。乳酸发酵试验使用表1所示的乳酸发酵培养基。
产物乳酸的浓度的评价通过实施例5所述的HPLC法进行。
另外，L-乳酸的光学纯度测定在以下条件下通过HPLC法测定。
柱TSK-gel Enantio L1(东曹公司生产) 移动相1mM硫酸铜水溶液 流速1.0ml/分钟 检测方法UV254nm 温度30℃。
而L-乳酸的光学纯度用下式计算。
光学纯度(％)＝100×(L-D)/(L+D) 其中，L表示L-乳酸的浓度、D表示D-乳酸的浓度。
葡萄糖浓度测定使用葡萄糖Test Wako C(和光纯药)。
以下给出了乳酸发酵试验条件。
发酵装置Bioneer-N(丸菱バイオエンジ公司生产) 培养基1L乳酸发酵培养基 培养温度30℃ 通气量100ml/分钟 搅拌速度2001/分钟 pH5.0 中和剂1N NaOH溶液。
首先，将pTRS48转化的SW015和SW016株在试管于5ml的乳酸发酵培养基振荡培养过夜(前前培养)。将前前培养液接种到100ml新鲜的乳酸发酵培养基，用500ml容量的坂口烧瓶振荡培养24小时(前培养)。将前培养液接种到发酵装置，进行乳酸发酵试验。结果如表15所示。
(实施例22使用pdc5温度感受性突变株的乳酸发酵试验(2)) 对上述取得的pdc5温度感受性突变株进行乳酸发酵试验。通过用实施例1中得到的来自蛙的L-ldh基因表达质粒pTRS102转化SW015株、和SW016株，导入来自蛙的L-ldh基因。乳酸发酵试验中对表1所示的乳酸发酵培养基进行高压蒸气灭菌(121℃、15分)。
产物乳酸浓度的评价通过实施例5所述的HPLC法进行。
而L-乳酸的光学纯度测定通过实施例21所述的HPLC法进行。
首先，将经pTRS102转化的SW015和SW016株在试管中于5ml的乳酸发酵培养基振荡培养过夜(前前培养)。将前前培养液接种于100ml新鲜的乳酸发酵培养基，用500ml容量的坂口烧瓶振荡培养24小时(前培养)。于发酵装置中接种前培养液，进行乳酸发酵试验。其结果如表15所示。
(比较例7使用PDC5野生型株的乳酸发酵(1)) 另外，作为对照比较例，进行使用PDC5野生型株的发酵试验。使用实施例3中得到的SW029/pTRS48，在与pdc5温度感受性突变株同样的条件下进行发酵试验。试验结果如表15所示。
(比较例8使用PDC5野生型株的乳酸发酵(2)) 进一步地，作为对照比较例使用实施例3中得到的SW029/pTRS102，在与pdc5温度感受性突变株同样的条件下进行发酵试验。试验结果如表15所示。
表15
以上结果表明如果使用导入了来自人或蛙的L-ldh基因的pdc5ts9温度感受性突变株SW015株、pdc5ts11温度感受性突变株SW016株进行乳酸发酵，与使用PDC5基因缺失的SW029株相比，乳酸的对糖收率提高了。这表明通过使用本发明的具有突变型PDC5基因的比活性低下的酵母可以有效地进行乳酸的生产。
产业上利用的可能性 本发明的酵母以及通过使用该酵母的乳酸的制造方法得到的乳酸可用在酒、豆酱、酱油、咸菜、乳制品等酿造制品以及作为代替柠檬酸、酒石酸的酸味料用于清凉饮料、医药品等中，具有广泛用途。另外，在树脂领域中，非常适合作为聚乳酸的原料，是极其有用的物质。
如果使用本发明的酵母、以及用该酵母制造乳酸的制造法来制造乳酸，由于可以有效地制造有广泛用途的乳酸，所以可以提供价格更便宜的乳酸。
序列表
<110>东丽株式会社
<120>酵母和L-乳酸的制造方法
<130>06042
<160>64
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>999
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
atggcaactc taaaggatca gctgatttat aatcttctaa aggaagaaca gaccccccag 60
aataagatta cagttgttgg ggttggtgct gttggcatgg cctgtgccat cagtatctta120
atgaaggact tggcagatga acttgctctt gttgatgtca tcgaagacaa attgaaggga180
gagatgatgg atctccaaca tggcagcctt ttccttagaa caccaaagat tgtctctggc240
aaagactata atgtaactgc aaactccaag ctggtcatta tcacggctgg ggcacgtcag300
caagagggag aaagccgtct taatttggtc cagcgtaacg tgaacatatt taaattcatc360
attcctaatg ttgtaaaata cagcccgaac tgcaagttgc ttattgtttc aaatccagtg420
gatatcttga cctacgtggc ttggaagata agtggttttc ccaaaaaccg tgttattgga480
agtggttgca atctggattc agcccgattc cgttacctga tgggggaaag gctgggagtt540
cacccattaa gctgtcatgg gtgggtcctt ggggaacatg gagattccag tgtgcctgta600
tggagtggaa tgaatgttgc tggtgtctct ctgaagactc tgcacccaga tttagggact660
gataaagata aggaacagtg gaaagaggtt cacaagcagg tggttgagag tgcttatgag720
gtgatcaaac tcaaaggcta cacatcctgg gctattggac tctctgtagc agatttggca780
gagagtataa tgaagaatct taggcgggtg cacccagttt ccaccatgat taagggtctt840
tacggaataa aggatgatgt cttccttagt gttccttgca ttttgggaca gaatggaatc900
tcagaccttg tgaaggtgac tctgacttct gaggaagagg cccgtttgaa gaagagtgca960
gatacacttt gggggatcca aaaggagctg caattttaa 999
<210>2
<211>999
<212>DNA
<213>非洲爪蟾(Xenopus laevis)
<400>2
atggcaactg tgaaggataa actcatccac aatgtggtca aggaggagtc gctcccccag 60
aacaaggtca ccattgtggg tgtgggggcc gtgggcatgg cctgtgccat cagtgtcctg120
cagaaggatt tggcagatga gcttgcactt gttgatgtga tagaagacaa actgaagggg180
gaaatgatgg atctccagca tggcagtctg ttccttcgta cccccaagat tgtctcaggg240
aaagattaca gcgtcactgc aaactccaag ctggtagttg tgacggccgg ggcccgtcag300
caggagggag agagtcgcct gaatctggtt cagcgcaatg tcaacatctt caaattcatc360
attcccaaca ttgtcaagta cagccccaac tgcaccctgc tcatcgtctc caacccagtg420
gacattctga catatgtggc ctggaagatc agtggattcc ccaaaaaccg tgtcattggc480
agcggctgca atttggactc tgcccgtttc cgttacctca tggggcagaa gtttgggatc540
cacacccaga gctgccacgg ttgggtcatt ggggaacacg gagactcgag tgtgccagtg600
tggagtgggg tgaatgtggc tggcgtgtcc ctgaaaaccc tgcaccccga tattgggagt660
gacgcagaca aggagaactg gaaggaggtg cacaagcagg ttgtggacag cgcctatgaa720
gtgatcaagc tgaagggcta cacctcctgg gctattggcc tgtccgtagc tgacctgtct780
gagagtatcc tgaagaacct ccgccgagtc catcccattt ccacaatggt caagggcatg840
tacggcgtga ataatgatgt tttcctcagt gtcccctgtg tgttgggcaa cttgggcatc900
acagacgtgg ttaacatgac gctgaaggca gatgaagagg atcgcttacg caagagcgca960
gacaccctgt gggccatcca gaaggagctg cagttctag 999
<210>3
<211>999
<212>DNA
<213>牛(Bos taurus)
<400>3
atggcaactc tcaaggatca gctgattcag aatcttctta aggaagaaca tgtcccccag 60
aataagatta caattgttgg ggttggtgct gttggcatgg cctgtgccat cagtatctta120
atgaaggact tggcagatga agttgctctt gttgatgtca tggaagataa actgaaggga180
gagatgatgg atctccaaca tggcagcctt ttccttagaa caccaaaaat tgtctctggc240
aaagactata atgtgacagc aaactccagg ctggttatta tcacagctgg ggcacgtcag300
caagagggag agagccgtct gaatttggtc cagcgtaacg tgaacatctt taaattcatc360
attcctaata ttgtaaaata cagcccaaat tgcaagttgc ttgttgtttc caatccagtc420
gatattttga cctatgtggc ttggaagata agtggctttc ccaaaaaccg tgttattgga480
agtggttgca atctggattc agctcgcttc cgttatctca tgggggagag gctgggagtt540
cacccattaa gctgccatgg gtggatcctt ggggagcatg gtgactctag tgtgcctgta600
tggagtggag tgaatgttgc tggtgtctcc ctgaagaatt tacaccctga attaggcact660
gatgcagata aggaacagtg gaaagcggtt cacaaacaag tggttgacag tgcttatgag720
gtgatcaaac tgaaaggcta cacatcctgg gccattggac tgtcagtggc cgatttggca780
gaaagtataa tgaagaatct taggcgggtg catccgattt ccaccatgat taagggtctc840
tatggaataa aagaggatgt cttccttagt gttccttgca tcttgggaca gaatggaatc900
tcagacgttg tgaaagtgac tctgactcat gaagaagagg cctgtttgaa gaagagtgca960
gatacacttt gggggatcca gaaagaactg cagttttaa 999
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>4
ctcgagatgg caactctaaa ggatca 26
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>5
gcggccgctt aaaattgcag ctcctttt28
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>6
gtcgacatgg caactgtgaa ggataa 26
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>7
gcggccgcct agaactgcag ctcctt 26
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>8
ctcgagatgg caactctcaa ggatca 26
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>9
gcggccgctt aaaactgcag ttctttct28
<210>10
<211>65
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>10
accgttttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccttgt tggacagatt gtactgagag 60
tgcac 65
<210>11
<211>65
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>11
atcgaagact ggcaacatga tttcaatcat tctgatctta gagttctgtg cggtatttca 60
caccg 65
<210>12
<211>65
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的DNA
<400>12
accgttttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccttgt tggacagatt gtactgagag 60
tgcac 65
<210>13
<211>65
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的DNA
<400>13
atcgaagact ggcaacatga tttcaatcat tctgatctta gagttctgtg cggtatttca 60
caccg 65
<210>14
<211>85
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>14
tctcaattat tattttctac tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa 60
atggcaactc taaaggatca gctga 85
<210>15
<211>85
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>15
tctcaattat tattttctac tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa 60
atggcaactg tgaaggataa actca 85
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>16
aggcgtatca cgaggccctt20
<210>17
<211>60
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的DNA
<400>17
tctcaattat tattttctac tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa60
<210>18
<211>60
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>18
gaattaattc ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct agattgtact gagagtgcac 60
<210>19
<211>80
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>19
tatttttcgt tacataaaaa tgcttataaa actttaacta ataattagag attaaatcgc 60
ctgtgcggta tttcacaccg 80
<210>20
<211>60
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的DNA
<400>20
tatttttcgt tacataaaaa tgcttataaa actttaacta ataattagag attaaatcgc 60
<210>21
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>21
caaatatcgt ttgaatattt ttccg 25
<210>22
<211>1602
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>22
atgaagtaca tggtagtcag ctcgcctata caagaggttt taagattaca taaatatatt 60
gagatctcta ctaccacaat cacagttaaa attacaaata agatgtcctc tccagtgatt120
ggtatcacct ttggtaacac ctcttcttct attgcctaca tcaacccaaa gaacgatgtt180
gatgtcattg ccaacccaga tggtgagcgt gccattccat ccgctttatc ctatgtcggt240
gaagatgaat accacggtgg tcaagctttg caacaattaa tcagaaatcc taagaatact300
atcattaact tccgtgactt cattggtttg ccatttgaca agtgtgatgt cagcaagtgc360
gctaacggtg ccccagctgt cgaagttgat ggcaaagttg gatttgttat ttcaagaggc420
gaaggtaagg aagaaaaact tactgtagat gaagtggtct ccagacattt aaacagatta480
aagttagccg cggaagatta catcggttct gccgtaaagg aagctgtatt gacagttcca540
acaaacttca gtgaagaaca aaagactgca ctaaaggctt ctgccgccaa aattggtctg600
caaattgttc aattcatcaa tgaaccttct gctgctttat tagcccacgc tgaacaattc660
ccatttgaaa aagatgttaa cgttgttgtt gctgacttcg gtggtattag atctgacgct720
gctgtcattg ccgttcgtaa cggtattttc actattttgg ccactgctca tgacctcagc780
ttaggtggtg acaatttgga tactgaatta gtcgaatatt ttgctagtga gttccaaaag840
aagtatcaag ccaatccaag aaagaacgct agatccttgg ccaagttaaa ggctaactct900
tcaattacca agaagacttt gtccaacgca acttctgcca ctatttccat cgattcctta960
gctgatggtt tcgactatca cgcttctatc aacagaatga ggtacgaatt ggtagctaac 1020
aaggtcttcg cccaattttc ctctttcgtt gattctgtca ttgccaaggc tgaattagac 1080
ccattggaca tcgatgctgt tcttttgact ggtggtgtat catttactcc aaaattaacc 1140
actaacttgg aatacacttt accagaatca gtcgaaattc ttggtccaca gaacaagaac 1200
gcttctaaca atccaaacga attagctgca tccggtgccg cattacaagc aagattgatt 1260
agcgattacg atgctgacga attggctgaa gctttacaac cagttatcgt caatactcca 1320
catttaaaga agcctattgg tttgattggt gctaagggcg aattccaccc agtattgttg 1380
gctgaaactt cgttccctgt acaaaagaaa ttgactttga aacaagccaa gggtgatttc 1440
ttgattggtg tttacgaagg tgaccatcac atcgaggaaa agactttgga gccaattcca 1500
aaagaagaaa atgctgaaga ggacgatgaa agtgaatggt ccgacgatga acctgaagtc 1560
gtcagagaaa aactatacac tttgggtacc aagttgatgt aa 1602
<210>23
<211>533
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>23
Met Lys Tyr Met Val Val Ser Ser Pro Ile Gln Glu Val Leu Arg Leu
1 5 10 15
His Lys Tyr Ile Glu Ile Ser Thr Thr Thr Ile Thr Val Lys Ile Thr
20 25 30
Asn Lys Met Ser Ser Pro Val Ile Gly Ile Thr Phe Gly Asn Thr Ser
35 4045
Ser Ser Ile Ala Tyr Ile Asn Pro Lys Asn Asp Val Asp Val Ile Ala
50 55 60
Asn Pro Asp Gly Glu Arg Ala Ile Pro Ser Ala Leu Ser Tyr Val Gly
65 70 75 80
Glu Asp Glu Tyr His Gly Gly Gln Ala Leu Gln Gln Leu Ile Arg Asn
85 90 95
Pro Lys Asn Thr Ile Ile Asn Phe Arg Asp Phe Ile Gly Leu Pro Phe
100 105 110
Asp Lys Cys Asp Val Ser Lys Cys Ala Asn Gly Ala Pro Ala Val Glu
115 120 125
Val Asp Gly Lys Val Gly Phe Val Ile Ser Arg Gly Glu Gly Lys Glu
130 135 140
Glu Lys Leu Thr Val Asp Glu Val Val Ser Arg His Leu Asn Arg Leu
145 150 155 160
Lys Leu Ala Ala Glu Asp Tyr Ile Gly Ser Ala Val Lys Glu Ala Val
165 170 175
Leu Thr Val Pro Thr Asn Phe Ser Glu Glu Gln Lys Thr Ala Leu Lys
180 185 190
Ala Ser Ala Ala Lys Ile Gly Leu Gln Ile Val Gln Phe Ile Asn Glu
195 200 205
Pro Ser Ala Ala Leu Leu Ala His Ala Glu Gln Phe Pro Phe Glu Lys
210 215 220
Asp Val Asn Val Val Val Ala Asp Phe Gly Gly Ile Arg Ser Asp Ala
225 230 235 240
Ala Val Ile Ala Val Arg Asn Gly Ile Phe Thr Ile Leu Ala Thr Ala
245 250 255
His Asp Leu Ser Leu Gly Gly Asp Asn Leu Asp Thr Glu Leu Val Glu
260 265 270
Tyr Phe Ala Ser Glu Phe Gln Lys Lys Tyr Gln Ala Asn Pro Arg Lys
275 280 285
Asn Ala Arg Ser Leu Ala Lys Leu Lys Ala Asn Ser Ser Ile Thr Lys
290 295 300
Lys Thr Leu Ser Asn Ala Thr Ser Ala Thr Ile Ser Ile Asp Ser Leu
305 310 315 320
Ala Asp Gly Phe Asp Tyr His Ala Ser Ile Asn Arg Met Arg Tyr Glu
325 330 335
Leu Val Ala Asn Lys Val Phe Ala Gln Phe Ser Ser Phe Val Asp Ser
340 345 350
Val Ile Ala Lys Ala Glu Leu Asp Pro Leu Asp Ile Asp Ala Val Leu
355 360 365
Leu Thr Gly Gly Val Ser Phe Thr Pro Lys Leu Thr Thr Asn Leu Glu
370 375 380
Tyr Thr Leu Pro Glu Ser Val Glu Ile Leu Gly Pro Gln Asn Lys Asn
385 390 395 400
Ala Ser Asn Asn Pro Asn Glu Leu Ala Ala Ser Gly Ala Ala Leu Gln
405 410 415
Ala Arg Leu Ile Ser Asp Tyr Asp Ala Asp Glu Leu Ala Glu Ala Leu
420 425 430
Gln Pro Val Ile Val Asn Thr Pro His Leu Lys Lys Pro Ile Gly Leu
435 440 445
Ile Gly Ala Lys Gly Glu Phe His Pro Val Leu Leu Ala Glu Thr Ser
450 455 460
Phe Pro Val Gln Lys Lys Leu Thr Leu Lys Gln Ala Lys Gly Asp Phe
465 470 475 480
Leu Ile Gly Val Tyr Glu Gly Asp His His Ile Glu Glu Lys Thr Leu
485 490 495
Glu Pro Ile Pro Lys Glu Glu Asn Ala Glu Glu Asp Asp Glu Ser Glu
500 505 510
Trp Ser Asp Asp Glu Pro Glu Val Val Arg Glu Lys Leu Tyr Thr Leu
515 520 525
Gly Thr Lys Leu Met
530
<210>24
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>24
atgcggtacc gtgatgaggc tcgtggaaaa 30
<210>25
<211>66
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>25
tgcttataaa actttaacta ataattagag attaaatcgc gatatctttg attgatttga 60
ctgtgt66
<210>26
<211>530
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>26
atgcggtacc gtgatgaggc tcgtggaaaa aatgaataat ttatgaattt gagaacaatt 60
ttgtgttgtt acggtatttt actatggaat aatcaatcaa ttgaggattt tatgcaaata120
tcgtttgaat atttttccga ccctttgagt acttttcttc ataattgcat aatattgtcc180
gctgcccctt tttctgttag acggtgtctt gatctacttg ctatcgttca acaccacctt240
attttctaac tatttttttt ttagctcatt tgaatcagct tatggtgatg gcacattttt300
gcataaacct agctgtcctc gttgaacata ggaaaaaaaa atatataaac aaggctcttt360
cactctcctt gcaatcagat ttgggtttgt tccctttatt ttcatatttc ttgtcatatt420
cctttctcaa ttattatttt ctactcataa cctcacgcaa aataacacag tcaaatcaat480
caaagatatc gcgatttaat ctctaattat tagttaaagt tttataagca 530
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>27
gatatcgcga tttaatctct aattattagt 30
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>28
atgcggtacc gcaccaagtg gcgtagaaat 30
<210>29
<211>482
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>29
gatatcgcga tttaatctct aattattagt taaagtttta taagcatttt tatgtaacga 60
aaaataaatt ggttcatatt attactgcac tgtcacttac catggaaaga ccagacaaga120
agttgccgac agtctgttga attggcctgg ttaggcttaa gtctgggtcc gcttctttac180
aaatttggag aatttctctt aaacgatatg tatattcttt tcgttggaaa agatgtcttc240
caaaaaaaaa accgatgaat tagtggaacc aaggaaaaaa aaagaggtat ccttgattaa300
ggaacactgt ttaaacagtg tggtttccaa aaccctgaaa ctgcattagt gtaatagaag360
actagacacc tcgatacaaa taatggttac tcaattcaaa actgccagcg aattcgactc420
tgcaattgct caagacaagc tagttgtcgt agatttctac gccacttggt gcggtaccgc480
at 482
<210>30
<211>966
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的DNA
<400>30
atgcggtacc gtgatgaggc tcgtggaaaa aatgaataat ttatgaattt gagaacaatt 60
ttgtgttgtt acggtatttt actatggaat aatcaatcaa ttgaggattt tatgcaaata120
tcgtttgaat atttttccga ccctttgagt acttttcttc ataattgcat aatattgtcc180
gctgcccctt tttctgttag acggtgtctt gatctacttg ctatcgttca acaccacctt240
attttctaac tatttttttt ttagctcatt tgaatcagct tatggtgatg gcacattttt300
gcataaacct agctgtcctc gttgaacata ggaaaaaaaa atatataaac aaggctcttt360
cactctcctt gcaatcagat ttgggtttgt tccctttatt ttcatatttc ttgtcatatt420
cctttctcaa ttattatttt ctactcataa cctcacgcaa aataacacag tcaaatcaat480
caaagatatc gcgatttaat ctctaattat tagttaaagt tttataagca tttttatgta540
acgaaaaata aattggttca tattattact gcactgtcac ttaccatgga aagaccagac600
aagaagttgc cgacagtctg ttgaattggc ctggttaggc ttaagtctgg gtccgcttct660
ttacaaattt ggagaatttc tcttaaacga tatgtatatt cttttcgttg gaaaagatgt720
cttccaaaaa aaaaaccgat gaattagtgg aaccaaggaa aaaaaaagag gtatccttga780
ttaaggaaca ctgtttaaac agtgtggttt ccaaaaccct gaaactgcat tagtgtaata840
gaagactaga cacctcgata caaataatgg ttactcaatt caaaactgcc agcgaattcg900
actctgcaat tgctcaagac aagctagttg tcgtagattt ctacgccact tggtgcggta960
ccgcat 966
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>31
gaagggacaa ccaggacgta20
<210>32
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>32
agcccaactg aaaggttgc 19
<210>33
<211>83
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>33
tccgacgatg aacctgaagt cgtcagagaa aaactataca ctttgggtac caagttgatg60
tagagattgt actgagagtg cac83
<210>34
<211>80
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>34
accgtctttg ttaatgttaa agataatttc aacaccgtta gcgtttttaa ttcccaattc 60
ctgtgcggta tttcacaccg 80
<210>35
<211>63
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的DNA
<400>35
tccgacgatg aacctgaagt cgtcagagaa aaactataca ctttgggtac caagttgatg 60
tag 63
<210>36
<211>60
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的DNA
<400>36
gaattgggaa ttaaaaacgc taacggtgtt gaaattatct ttaacattaa caaagacggt 60
<210>37
<211>80
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>37
tagttccatc atgtatgtat ttttctatat acgtatacat accgtttttc ttagagcgct 60
ctgtgcggta tttcacaccg 80
<210>38
<211>60
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的DNA
<400>38
agcgctctaa gaaaaacggt atgtatacgt atatagaaaa atacatacat gatggaacta 60
<210>39
<211>348
<212>PRT
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>39
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn
20 25 30
Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu
3540 45
His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val
50 55 60
Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val
65 70 75 80
Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Ser Asn Cys
100 105 110
Pro His Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln
115 120 125
Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Gln Gly Thr
130 135 140
Asp Leu Ala Gln Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
210 215 220
Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
245 250 255
Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro
260 265 270
Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
305 310 315 320
Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly
325 330 335
Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345
<210>40
<211>348
<212>PRT
<213>酿河槽酵母
<400>40
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn
20 25 30
Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu
3540 45
His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val
50 55 60
Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val
6570 75 80
Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Ser Asn Cys
100 105 110
Pro His Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln
115 120 125
Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Thr Pro Gln Gly Thr
130 135 140
Asp Leu Ala Gln Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
210 215 220
Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
245 250 255
Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro
260 265 270
Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Ala Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
305 310 315 320
Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly
325 330 335
Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345
<210>41
<211>348
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>41
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn
20 25 30
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35 40 45
His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val
50 55 60
Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val
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Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Ser Asn Cys
100 105 110
Pro His Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln
115 120 125
Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Gln Gly Thr
130 135 140
Asp Leu Ala Gln Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Leu Lys Pro Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
210 215 220
Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
245 250 255
Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro
260 265 270
Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Ala Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
305 310 315 320
Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly
325 330 335
Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345
<210>42
<211>348
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>42
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn
20 25 30
Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu
3540 45
His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val
50 55 60
Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val
65 70 75 80
Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Ser Asn Cys
100 105 110
Pro His Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln
115 120 125
Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Gln Gly Thr
130 135 140
Asp Leu Ala Gln Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
210 215 220
Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
245 250 255
Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro
260 265 270
Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Ala Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
305 310 315 320
Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly
325 330 335
Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
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gcacaatatt tcaagctata ccaagcatac aatcaactat ctcatataca atgtcgaaag 60
ctacatataa 70
<210>44
<211>70
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>44
atttttttta taacttattt aataataaaa atcataaatc ataagaaatt ttagttttgc 60
tggccgcatc 70
<210>45
<211>50
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>45
gcacaatatt tcaagctata ccaagcatac aatcaactat ctcatataca50
<210>46
<211>53
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>46
taaaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aat53
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<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>47
gggtgtacaa tatggacttc ctcttttctg 30
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<211>30
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>48
catttgctcg gcatgccggt agaggtgtgg 30
<210>49
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>49
atgtctatcc cagaaactca aaaag 25
<210>50
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>50
ttatttagaa gtgtcaacaa cgtatct 27
<210>51
<211>1692
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>51
atgtctgaaa taaccttagg taaatattta tttgaaagat tgagccaagt caactgtaac 60
accgtcttcg gtttgccagg tgactttaac ttgtctcttt tggataagct ttatgaagtc120
aaaggtatga gatgggctgg taacgctaac gaattgaacg ctgcctatgc tgctgatggt180
tacgctcgta tcaagggtat gtcctgtatt attaccacct tcggtgttgg tgaattgtct240
gctttgaatg gtattgccgg ttcttacgct gaacatgtcg gtgttttgca cgttgttggt300
gttccatcca tctcttctca agctaagcaa ttgttgttgc atcatacctt gggtaacggt360
gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc catgatcact420
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agaccagtct acttgggttt gccagctaac ttggttgact tgaacgtccc agccaagtta540
ttggaaactc caattgactt gtctttgaag ccaaacgacg ctgaagctga agctgaagtt600
gttagaactg ttgttgaatt gatcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct660
tgtgcttcta gacatgatgt caaggctgaa actaagaagt tgatggactt gactcaattc720
ccagtttacg tcaccccaat gggtaagggt gctattgacg aacaacaccc aagatacggt780
ggtgtttacg ttggtacctt gtctagacca gaagttaaga aggctgtaga atctgctgat840
ttgatattgt ctatcggtgc tttgttgtct gatttcaata ccggttcttt ctcttactcc900
tacaagacca aaaatatcgt tgaattccac tctgaccaca tcaagatcag aaacgccacc960
ttcccaggtg ttcaaatgaa atttgccttg caaaaattgt tggatgctat tccagaagtc 1020
gtcaaggact acaaacctgt tgctgtccca gctagagttc caattaccaa gtctactcca 1080
gctaacactc caatgaagca agaatggatg tggaaccatt tgggtaactt cttgagagaa 1140
ggtgatattg ttattgctga aaccggtact tccgccttcg gtattaacca aactactttc 1200
ccaacagatg tatacgctat cgtccaagtc ttgtggggtt ccattggttt cacagtcggc 1260
gctctattgg gtgctactat ggccgctgaa gaacttgatc caaagaagag agttatttta 1320
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ttgactcaag acaaggactt ccaagacaac tctaagatta gaatgattga agttatgttg 1620
ccagtctttg atgctccaca aaacttggtt aaacaagctc aattgactgc cgctactaac 1680
gctaaacaat aa 1692
<210>52
<211>1692
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>52
atgtctgaaa taaccttagg taaatattta tttgaaagat tgagccaagt caactgtaac 60
accgtcttcg gtttgccagg tgactttaac ttgtctcttt tggataagct ttatgaagtc120
aaaggtatga gatgggctgg taacgctaac gaattgaacg ctgcctatgc tgctgatggt180
tacgctcgta tcaagggtat gtcctgtatt attaccacct tcggtgttgg tgaattgtct240
gctttgaatg gtattgccgg ttcttacgct gaacatgtcg gtgttttgca cgttgttggt300
gttccatcca tctcttctca agctaagcaa ttgttgttgc atcatacctt gggtaacggt360
gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc catgatcact420
gatattgcta acgctccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccaccta cactacccaa480
agaccagtct acttgggttt gccagctaac ttggttgact tgaacgtccc agccaagtta540
ttggaaactc caattgactt gtctttgaag ccaaacgacg ctgaagctga agctgaagtt600
gttagaactg ttgttgaatt gatcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct660
tgtgcttcta gacatgatgt caaggctgaa actaagaagt tgatggactt gactcaattc720
ccagtttacg tcaccccaat gggtaagggt gctattgacg aacaacaccc aagatacggt780
ggtgtttacg ttggtacctt gtctagacca gaagttaaga aggctgtaga atctgctgat840
ttgatattgt ctatcggtgc tttgttgtct gatttcaata ccggttcttt ctcttactcc900
tacaagacca aaaatatcgt tgaattccac tctgaccaca tcaagatcag aaacgccacc960
ttcccaggtg ttcaaatgaa atttgccttg caaaaattgt tggatgctat tccagaagtc 1020
gtcaaggact acaaacctgt tgctgtccca gctagagttc caattaccaa gtctactcca 1080
gctaacactc caatgaagca agaatggatg tggaaccatt tgggtaactt cttgagagaa 1140
ggtgatattg ttattgctga aaccggtact tccgccttcg gtattaacca aactactttc 1200
ccaacagatg tatacgctat cgtccaagtc ttgtggggtt ccattggttt cacagtcggc 1260
gctctattgg gtgctactat ggccgctgaa gaacttgatc caaagaagag agttatttta 1320
ttcattggtg acggttctct acaattgact gttcaagaaa tctctaccat gattagatgg 1380
ggtttgaagc catacatttt tgtcttgaat aacaacggtt acaccattga aaaattgatt 1440
cacggtcctc atgccgaata taatgaaatt caaggttggg accacttggc cttattgcca 1500
acttttggtg ctagaaacta cgaaacccac agagttgcta ccactggtga atgggaaaag 1560
ttgactcaag acaaggactt ccaagacaac tctaagatta gaatgattga agttatgttg 1620
ccagtctttg atgctccaca aaacttggtt aaacaagctc aattgactgc cgctactaac 1680
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<210>53
<211>1692
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>53
atgtctgaaa taaccttagg taaatattta tttgaaagat tgagccaagt caactgtaac 60
accgtcttcg gtttgccagg tgactttaac ttgtctcttt tggataagct ttatgaagtc120
aaaggtatga gatgggctgg taacgctaac gaattgaacg ctgcctatgc tgctgatggt180
tacgctcgta tcaagggtat gtcctgtatt attaccacct tcggtgttgg tgaattgtct240
gctttgaatg gtattgccgg ttcttacgct gaacatgtcg gtgttttgca cgttgttggt300
gttccatcca tctcttctca agctaagcaa ttgttgttgc atcatacctt gggtaacggt360
gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc catgatcact420
gatattgcta acgctccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccaccta cactacccaa480
agaccagtct acttgggttt gccagctaac ttggttgact tgaacgtccc agccaagtta540
ttggaaactc caattgactt gtctttgaag ccaaacgacg ctgaagctga agctgaagtt600
gttagaactg ttgttgaatt gatcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct660
tgtgcttcta gacatgatgt caaggctgaa actaagaagt tgatggactt gactcaattc720
ccagtttacg tcaccccaat gggtaagggt gctattgacg aacaacaccc aagatacggt780
ggtgtttacg ttggtacctt gtctagacca gaagttaaga aggctgtaga atctgctgat840
ttgatattgt ctatcggtgc tttgttgtct gatttcaata ccggttcttt ctcttactcc900
tacaagacca aaaatatcgt tgaattccac tctgaccaca tcaagatcag aaacgccacc960
ttcccaggtg ttcaaatgaa atttgccttg caaaaattgt tggatgctat tccagaagtc 1020
gtcaaggact acaaacctgt tgctgtccca gctagagttc caattaccaa gtctactcca 1080
gctaacactc caatgaagca agaatggatg tggaaccatt tgggtaactt cttgagagaa 1140
ggtgatattg ttattgctga aaccggtact tccgccttcg gtattaacca aactactttc 1200
ccaacagatg tatacgctat cgtccaagtc ttgtggggtt ccattggttt cacagtcggc 1260
gctctattgg gtgctactat ggccgctgaa gaacttgatc caaagaagag agttatttta 1320
ttcattggtg acggttctct acaattgact gttcaagaaa tctctaccat gattagatgg 1380
ggtttgaagc catacatttt tgtcttgaat aacaacggtt acaccattga aaaattgatt 1440
cacggtcctc atgccgaata taatgaaatt caaggttggg accacttggc cttattgcca 1500
acttttggtg ctagaaacta cgaaacccac agagttgcta ccactggtga atgggaaaag 1560
ttgactcaag acaaggactt ccaagacaac tctaagatta gaatgattga agttatgttg 1620
ccagtctttg atgctccaca aaacttggtt aaacaagctc aattgactgc cgctactaac 1680
gctaaacaat aa 1692
<210>54
<211>70
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>54
aatcaatctc aaagagaaca acacaataca ataacaagaa gaacaaaatg agattgtact60
gagagtgcac 70
<210>55
<211>70
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>55
gtaaaaaaat acacaaacgt tgaatcatga gttttatgtt aattagctta ctgtgcggta60
tttcacaccg 70
<210>56
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>56
ctcgatcaat atactgtagt aagtcc26
<210>57
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>57
caattattta cctaaacatc tataac26
<210>58
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>58
caaatatcgt ttgaatattt ttccg 25
<210>59
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>59
tacactaatg cagtttcagg gtttt25
<210>60
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>60
aatgacgacg agcctgaagc tggcg25
<210>61
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>61
ggtaagcagc tgaaagataa taagg25
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>62
atgtctgaaa taaccttagg 20
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>63
ttattgttta gcgttagtag 20
<210>64
<211>1716
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>64
atgaagtaca tggtagtcag ctcgcctata caagaggttt taagattaca taaatatatt 60
gagatctcta ctaccacaat cacagttaaa attacaaata agatgtcctc tccagtgatt120
ggtatcacct ttggtaacac ctcttcttct attgcctaca tcaacccaaa gaacgatgtt180
gatgtcattg ccaacccaga tggtgagcgt gccattccat ccgctttatc ctatgtcggt240
gaagatgaat accacggtgg tcaagctttg caacaattaa tcagaaatcc taagaatact300
atcattaact tccgtgactt cattggtttg ccatttgaca agtgtgatgt cagcaagtgc360
gctaacggtg ccccagctgt cgaagttgat ggcaaagttg gatttgttat ttcaagaggc420
gaaggtaagg aagaaaaact tactgtagat gaagtggtct ccagacattt aaacagatta480
aagttagccg cggaagatta catcggttct gccgtaaagg aagctgtatt gacagttcca540
acaaacttca gtgaagaaca aaagactgca ctaaaggctt ctgccgccaa aattggtctg600
caaattgttc aattcatcaa tgaaccttct gctgctttat tagcccacgc tgaacaattc660
ccatttgaaa aagatgttaa cgttgttgtt gctgacttcg gtggtattag atctgacgct720
gctgtcattg ccgttcgtaa cggtattttc actattttgg ccactgctca tgacctcagc780
ttaggtggtg acaatttgga tactgaatta gtcgaatatt ttgctagtga gttccaaaag840
aagtatcaag ccaatccaag aaagaacgct agatccttgg ccaagttaaa ggctaactct900
tcaattacca agaagacttt gtccaacgca acttctgcca ctatttccat cgattcctta960
gctgatggtt tcgactatca cgcttctatc aacagaatga ggtacgaatt ggtagctaac 1020
aaggtcttcg cccaattttc ctctttcgtt gattctgtca ttgccaaggc tgaattagac 1080
ccattggaca tcgatgctgt tcttttgact ggtggtgtat catttactcc aaaattaacc 1140
actaacttgg aatacacttt accagaatca gtcgaaattc ttggtccaca gaacaagaac 1200
gcttctaaca atccaaacga attagctgca tccggtgccg cattacaagc aagattgatt 1260
agcgattacg atgctgacga attggctgaa gctttacaac cagttatcgt caatactcca 1320
catttaaaga agcctattgg tttgattggt gctaagggcg aattccaccc agtattgttg 1380
gctgaaactt cgttccctgt acaaaagaaa ttgactttga aacaagccaa gggtgatttc 1440
ttgattggtg tttacgaagg tgaccatcac atcgaggaaa agactttgga gccaattcca 1500
aaagaagaaa atgctgaaga ggacgatgaa agtgaatggt ccgacgatga acctgaagtc 1560
gtcagagaaa aactatacac tttgggtacc aagttgatgg aattgggaat taaaaacgct 1620
aacggtgttg aaattatctt taacattaac aaagacggtg ctttaagagt caccgctaga 1680
gatttgaaaa ctggtaatgc tgtaaagggt gaatta 171权利要求
1.导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母。
2.权利要求1所述的酵母，其中编码L-乳酸脱氢酶的基因是编码来自人(Homo sapiens)的L-乳酸脱氢酶的基因。
3.权利要求1所述的酵母，其中编码L-乳酸脱氢酶的基因是编码来自非洲爪蟾(Xenopus laevis)的L-乳酸脱氢酶的基因。
4.权利要求1或2所述的酵母，其中编码来自人的L-乳酸脱氢酶的基因是具有序列编号1所示核酸序列的基因。
5.权利要求1或3所述的酵母，其中编码来自蛙的L-乳酸脱氢酶的基因是具有序列编号2所示的核酸序列的基因。
6.权利要求1～3中任一项所述的酵母，其中编码L-乳酸脱氢酶的基因被导入到可表达编码L-乳酸脱氢酶的基因的启动子的下游。
7.权利要求1～3中任一项所述的酵母，其中编码L-乳酸脱氢酶的基因是以可表达的状态被导入到染色体上的丙酮酸脱羧酶1基因的启动子下游。
8.权利要求1～3中任一项所述的酵母，其具有突变型PDR13基因，所述突变型PDR13基因包含对野生型PDR13基因的DNA序列的一部分通过缺失、插入或替换而被突变的、可翻译成野生型PDR13基因编码的蛋白质的一部分的DNA序列。
9.权利要求8所述的酵母，其中野生型PDR13基因的碱基序列包含序列编号64所示的碱基序列的基因。
10.权利要求8所述的酵母，其中突变型PDR13基因为包含序列编号22所示的碱基序列的基因。
11.权利要求8或9所述的酵母，其中野生型PDR13基因或突变型PDR13基因编码的蛋白质的一部分包含序列编号23所示的氨基酸一级序列。
12.权利要求1～3中任一项所述的酵母，其是具有突变型醇脱氢酶的酵母，该突变型醇脱氢酶包含野生型醇脱氢酶的氨基酸序列的一部分被替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，该突变型醇脱氢酶表现出通过改变培养温度，细胞内的醇脱氢酶活性消失或降低的温度感受性。
13.权利要求12所述的酵母，其中突变型醇脱氢酶当培养温度在摄氏34度以上时表现出温度感受性。
14.权利要求12所述的酵母，其中突变型醇脱氢酶当培养温度在摄氏30度以上时表现出温度感受性。
15.权利要求12所述的酵母，其中突变型醇脱氢酶是包含在序列编号39所示的野生型醇脱氢酶1的氨基酸序列中1个至数个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的突变型醇脱氢酶。
16.权利要求12所述的酵母，其中突变型醇脱氢酶是包含序列编号40、序列编号41或序列编号42中任一序列所示的氨基酸序列的突变型醇脱氢酶。
17.权利要求1～3任一项中所述的酵母，其中编码丙酮酸脱羧酶1的基因缺失、具有包含编码野生型丙酮酸脱羧酶5的基因的碱基序列的一部分被缺失、插入、替换和/或添加的碱基序列的突变型丙酮酸脱羧酶5基因。
18.权利要求17所述的酵母，其中酵母细胞内的丙酮酸脱羧酶的比活性降低到野生型酵母细胞内的比活性的3分之1以下。
19.权利要求17所述的酵母，其中突变型丙酮酸脱羧酶5是温度感受性的。
20.权利要求17所述的酵母，其中突变型丙酮酸脱羧酶5在摄氏34度以上表现出温度感受性。
21.权利要求17所述的酵母，其中编码野生型丙酮酸脱羧酶5的基因的碱基序列是包含序列编号51所示的碱基序列的基因。
22.权利要求17所述的酵母，其中编码突变型丙酮酸脱羧酶5的基因是包含序列编号52或53中任一序列所示的碱基序列的基因。
23.权利要求1～3中任一项所述的酵母，其中酵母属于酵母属(GenusSaccharomyces)。
(Saccharomyces cerevesiae)。
25.L-乳酸的制造方法，其包括培养权利要求1～24中任一项所述的酵母。
26.L-乳酸的制造方法，其包括在25～37℃对权利要求1～24中任一项所述的酵母进行培养。
27.L-乳酸的制造方法，其包括在30～34℃对权利要求1～24中任一项所述的酵母进行培养。
全文摘要
本发明的酵母是导入了编码来自人或蛙的L-乳酸脱氢酶的基因的酵母。如果使用本发明的酵母以及用使用该酵母制造乳酸的制造法来制造乳酸，由于可以有效地制造有广泛用途的乳酸，所以可以提供价格更便宜的乳酸。
文档编号C12N1/21GK101287833SQ20068003831
公开日2008年10月15日 申请日期2006年9月4日 优先权日2005年10月14日
发明者泽井秀树, 泽井健司, 园木和典, 畠平智子 申请人:东丽株式会社