提高植物转化效率的载体和方法

专利名称：：提高植物转化效率的载体和方法提高植物转化效率的载体和方法本申请要求于2005年9月6日提交的美国临时申请No.60/714,501的优先权，其全部内容作为参考并入本申请中。1.发明领域本发明主要涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及改善了2:
背景技术：
t'、…'用土壤杆菌介导的方法来转化植物细胞涉及将植物细胞及组织暴露在含有特定DNA质粒的土壤杆菌细胞悬浮液中。对这些质粒进行了专门的构建使其含有可在植物细胞中表达的转基因(参见，例如，USNo.5,034,322)。更常见地，一个或多个转基因是阳性选择标记转基因，可使植物细胞在存在诸如抗生素或除草剂这样的阳性选择化合物时生长。可对这些细胞进行进一步操作使其再生成完整的可繁殖的植物。通过土壤杆菌介导的转化方法将转基因转入植物的方法通常涉及其中整合了至少一种转基因的基因元件，并可将这些基因元件转入植物基因组的T-DNA(转移DNA)。典型地，转基因构建于DNA质粒载体中，并且两翼通常是土壤杆菌Ti质粒的右边缘(rightborder)DNA区(RB)和左边缘(leftborder)DNA区(LB)。在土i裒杆菌介导的转化过程中，DNA质粒在左右边缘区通过内切酶VirD2的作用产生缺刻。在缺刻之间的被称为T链的单链DNA从土壤杆菌细胞转入到植物细胞中。相应的T-DNA区的序列被插入到植物基因组中。T-DNA整合入植物基因组中通常于RB处开始，直至T-DNA末端的LB处。不过，内切酶有时候并不在两个边缘都产生缺刻。当这种情况发生时，插入到植物基因组中的T-DNA通常含有某些或者全部质粒载体DNA。这种现象被称为"边缘连读(borderread-through)"。通常优选地，只有位于左右边缘区之间的转基因(T-DNA)才会被转入植物基因组中，而其它相邻的质粒载体DNA(载体骨架)不会转入。载体骨架DNA含有多种质粒维持元件，包括例如，复制起点、细菌选择标记基因、以及其它在表达商品化作物产品的期望性状时不需要表达的DNA片段。有很多办法可用来筛选转基因作物植物基因组中的质粒骨架DNA。诸如聚合酶链反应(PCR)及Southern印迹分析之类的方法是最为常用的，其用来鉴定外源载体骨架DNA。对于大规模筛选工作而言，这些方法既耗时又昂贵。含有载体骨架DNA的转基因植物通常不是商品化所优选的。此外，含有超过两种转基因的转基因植物在商品化开发中通常几乎没有价值。从不具有商业潜力的植物细胞培养物中再生植物会耗费大量的工作。因此，如果能够开发出可显著降低转基因植物基因组中载体骨架DNA的发生率和/或增加低拷贝转化事件频率的方法及组合物，这将会有非常大的收益。如果更多的转基因植物不含载体骨架DNA并且绝大多数植物只含有一或两个拷贝的转基因，则只需生产很少的转基因植物，这可极大增加转基因植物生产的效率。发明概述根据本发明的一个方面，提供了用于提高诸如土壤杆菌介导的植物转化之类的、细菌介导的植物细胞转化事件质量的构建体和方法。本发明的优势在于提供了更低频率的载体骨架DNA——即非T-DNA区的转化事件，并可增加有1或2个拷贝的T-DNA的T-DNA转化事件频率。本发明还提供用于转化植物的DNA构建体，其包括i)至少一个T-DNA边缘区域；ii)至少一个与边缘区相邻的异源转基因；iii)用作细菌选择标记的编码区；及iv)至少一个DNA节段，其含有顺式和/反式元件或者用于在细菌转化的植物细胞中维持低拷贝的DNA构建体的复制起点的元件。在本发明特定的实施方案中，用于在植物转化用(具有植物细胞转化能力的)细菌细胞中维持低拷贝的DNA构建体的复制起点元件包括r印j(譬如SEQIDNO:32或SEQIDNO:38)、(譬如SEQIDNO:33或SEQIDNO:39)、repC(譬如SEQIDNO:34或SEQIDNO:40)、igsl(譬如SEQIDNO:35或SEQIDNO:41)、igs2(譬如SEQIDNO:36或SEQIDNO:42)中的一种或多种。构建体也可选拷，性地包括回文序列，例如，SEQIDNO:37中16bp的回文序列。这些元件彼此间可按顺式或反式方式来排列。在某些实施方案中，单T-DNA边缘区定义为右边缘区(RB)或左边缘(LB)区。此外，在特定实施方案中，RB和/或LB序列包含SEQIDNO:43或者SEQIDNO:44。在具体的实施方案中，当异源转基因在转化的植物细胞中表达时，可使细胞或由该细胞衍生的植物呈现某种农艺学表型。在进一步的实施方案中，细菌选择标记的编码区是选自卡那霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、链霉素抗性基因、四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、杀稻痙素抗性基因、潮霉素抗性基因、噪呤霉素抗性基因或零霉素抗性基因的抗生素抗性基因。在某些实施方案中，复制起点包含选自SEQIDNOs:1、2、3或4的"/^45C序列。在一个实施方案中，至少一种DNA节段包括复制r印5和r印C。在某些实施方案中，至少一种DNA节段包括基因间序列1(igsl)和基因间序列2(igs2)。在某些实施方案中，至少一种DNA节段包括16个碱基对的回文序列。在其它实施方案中，DNA节段包括所有在土壤杆菌或其它具有植物细胞转化能力的细菌细胞中维持低拷贝数(每个细胞1-3拷贝)所必须的^;^5C序列。含有m;l45C的构建体以及它们的使用方法在下文进行更详细的描述。本发明的DNA构建体可转入任何细胞，例如，诸如具有植物细胞转化能力的细菌。这类细菌在本领域是已知的，例如，可以属于以下物种土i裏4干菌(爿groZ)a"en'M附spp.)、才艮瘤菌(i/^zoZj&mspp.)、中华根瘤菌(S/wor/n'zoZ^wmspp.)、中间根瘤菌(MesoWn'zo6^mspp.)、叶#干菌(P/^〃o6a"en'wmspp.)、苍白4干菌((9c/^oZa"n/附spp.)和'隻生才艮瘤菌(5ra办Wn'zoWwmspp.)。优选地，这类细胞可以属于土i裏杆菌。本发明的DNA构建体可进一步包括一个或多个用于在大肠杆菌中维持构建体拷贝数的复制起点。在某些实施方案中，用于在大肠杆菌中维持构建体拷贝数的复制起点是来源于pBR322和pUC中的至少一种。本发明还涉及含有本发明DNA构建体、并可用于转化植物细胞的植物细胞转化用细菌。在某些实施方案中，植物细胞转化用细菌选自土壤杆菌、根瘤菌、中华根瘤菌、中间根瘤菌、叶杆菌、苍白杆菌或慢生根瘤菌。本发明还涉及用于转化植物细胞的方法，包括使本发明的植物细胞转化用细菌与至少一个初始(first)植物细胞接触；并至少选择用至少一个异源转基因所转化的植物细胞。在某些实施方案中，植物细胞是大豆、油菜、玉米或棉花植物细胞。在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括由植物细胞再生植林。本发明还涉及生产食品、饲料或工业产品的方法，包括获得本发明的植物或其部分；并由该植物或其部分制备食品、饲料或工业产口P,本发明还包括用本发明的DNA构建体遗传转化植物，以及降低由非T-DNA载体区转化植物的频率的方法。在某些实施方案中，用非T-DNA区所转化植物的频率可定义为低于或等于约20%。在某些实施方案中，该频率低于或等于约15%,在某些实施方案中低于约10%,在某些实施方案中低于或等于约8%或5%。在本发明方法的某些实施方案中，所获得的单拷贝或双拷贝T-DNA转化事件的频率高于或等于约70%或75%。在某些情况下，该频率可以增高到高于或等于约80%或85%,在某些实施方案中，高于约90%或95%。除了全长的oWW外，本发明包含含有on'W突变体及变异体的植物转化载体，当用于本发明时它们保留了与全长序列基本上相似的功能。例如，申请人已经鉴定出如SEQIDNO:3所示的截短序列，它适用于本发明。本领域的技术人员可很容易在on'W序列中生成其它转变、缺失、替代等，并利用本发明的方法对功能活性进行筛选。因此，本发明也包含这类变异体和突变体。本发明的其它特征及有益效果一方面可通过下文描述来阐明，一方面通过描述可以显而易见，或者可通过实施本发明来领会。可通过及有益效果。应理解无论是前述的一般性描述还是下文的详细描述均只是用来示例和说明，并不是对本发明进行限制。后附的说明书附图作为说明书的一部分阐述了本发明的不同实施方案，结合相关描述用于阐述本发明的原理。除非另外定义，本文所用的所有技术及科学术语均为本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。此处本发明描述中所用的术语只是用于描述特定的实施方案，而并非试图限制本发明。在本发明描述及附加的权利要求中，除非在上下文其它处有明确说明，否则单数形式的"a""an"和"the"也意味着包括其复数形式。附图的简要描述图1所示的是用于构建转化大豆的pMON83882和转化玉米的pMON97352的、具有5.6KbonW片段的基本载体——pMON83856的质粒图谱。图2所示的是作为示例用于大豆转化的具有5.6Kbon'W片段和5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶选择标记基因以及目的WW(gw)基因的试验载体——pMON83882的质粒图谱。图3所示的是用于构建pMON83937的、具有4.2Kbon7z'片段的基本载体——pMON83934的质粒图谱。图4所示的是作为示例用于大豆转化的、具有4.2Kbon7z'片段和CP4选择标记基因以及GOI(gws)的试验载体——pMON83937的质粒图谱。图5所示的是作为示例用于玉米转化的、具有5.6Kbon7z'片段和CP4选择标记基因以及GOI()的试验载体——pMON97352的质粒图谱。图6所示的是用作玉米转化对照的pMON92726的质粒图谱。它含有与pMON97352除复制起点外都相同的基因结构。其中onT替代了on'W。图7所示的是用作大豆转化对照的双T-DNA转化载体——pMON87488的质粒图镨。其中onT替代了on'W。图8所示的是作为示例用于大豆转化的、具有4.3KboWW片段和CP4选择标记基因以及GOI(gws)的双T-DNA转化试验载体——pMON96001的质粒图i普。图9所示的是作为示例用于大豆转化的具有5.6Kbon'W片段和CP4选择标记基因以及GOI(g^)的双T-DNA转化试-验载体——pMON96010的质粒图i普。图10所示的是玉米中复制起点的类型对于转化效率的影响。误差线表示95%置信区间；*表示在on7/(pMON97352)和onT(pMON92726)之间存在显著性差异。图11所示的是在玉米转化中复制起点的类型对骨架序列转移的影响。误差线表示95%置信区间；*表示在on'"(pMON97352)和onT(pMON92726)之间存在显著性差异。on7i/on7、RB和LB表示所用骨架探针的类型。图12所示的是在玉米转化中复制起点的类型对转基因质量的影响。误差线表示95%置信区间。0、1、2、3+表示拷贝数。图13所示的是含来自豆根瘤菌(肠油'謂CFN42p42b质粒的r印ABC复制起点及用于大豆的CP4EPSPS选择标记基因的pMON96951的质粒图谱。发明详述现在将参照附图通过具体实施方案详细描述本发明。应理解的是，本发明可表现为不同的形式，并非为下述提供的具体实施方案所限制。更确切地说，这些具体实施方案仅是解释性的，其目的是使本领域的技术人员充分理解本发明的范围。本发明部分涉及对复制中的";^45C复制起点的发现，譬如来自发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)pRi的"on7f，或"on7^r，其在诸如土壤杆菌这样的细菌中保持1-3个拷贝，可用于植物转化载体中并可提供很高的所需的转化事件。本发明的载体可以，例如，显著降低转移非T-DNA区一_即载体骨架DNA的转化事件的频率，并且可以，例如，显著提高单拷贝或双拷贝T-DNA——即转化事件中目的基因的数目。现有技术中并没有教导或者暗示使用on'W来实现这些未预料到的转化结果。本发明的载体和方法改良了制备转基因作物植物中的转化事件。在本文用法中，转基因作物植物含有外源多核苷酸分子或者插入到作物植物细胞基因组中的异源转基因。作物植物细胞包括但并不限定于植物细胞，并进一步包括培养物悬浮液、胚、分生组织区、愈伤组织、叶片、根、芽、配子体、孢子体、胚珠、花粉和小孢子、种子以及果实。"外源的，，或者"异源的"是指来源于待转入所述核酸分子的植物细胞之外的多核苷酸分子。外源多核苷酸分子可具有天然的或非天然的核苦酸序列。本领域的技术人员知道外源多核苦酸分子可以是来源于任何其它生物的不同种，或来自待导入所述多核苷酸分子的植物之外的植物种的异源分子，也可以是来源于与待导入的植物相同的植物种的多核苷酸分子。当外源多核苦酸(异源转基因)在转化植物细胞中表达时，可使细胞或者来源于该细胞的转化植物呈现某种农艺学性状。这些目的基因(GOI)给作物植物提供了有益的农艺学性状，例如，包括但并不限定于下述遗传元件除草剂抗性(US5，633，435;US5，463，175)、增加的产量(US5,716，837)、昆虫控制(US6，063，597、US6,063,756、US6，093,695、US5，942，664、US6,110,464)、真菌病害抗性(US5，516，671、US5,773,696、US6，121,436和US6,316,407以及US6，506,962)、病毒抗性(US5，304,730和US6，013,864)、线虫抗性(US6,228，992)、细菌病害抗性(US5,516，671)、淀粉产量(US5，750，876和US6，476,295)、改良油类的产量(US6,444，876)、高油类产量(US5,608，149和US6，476，295)、改良的脂肪酸含量(US6,537,750)、高蛋白产量(US6，380，466)、果实成熟(US5，512,466)、增强的动物和人类营养(US5,985，605和US6,171，640)、生物多聚物(US5,958，745和US2003/0028917)、环境胁迫抗性(US6,072，103)、药物肽(US6，080，560)、改良的加工性状(US6，476，295)、改良的可消化性(US6，531,648)、低棉子糖(US6,166,292)、工业酶产量(US5,543,576)、改良的风味(US6,011,199)、固氮作用(US5,229，114)、杂合种子产量(US5,689,041)、及生物染料生产(US5，998，700)的基因元件，上述的基因元件和转基因作为参考并入本申请。本发明提供了用于生产转基因作物植物的植物重组DNA构建体。可使用本领域技术人员所熟知的方法来制备本发明的作物植物重组DNA构建体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术及体内基因重组。这些技术在SambrookW(1989)中有所描述。利用这些方法生成的外源多核苷酸分子可以通过诸如土壤杆菌这样的植物转化用细菌或通过植物转化领域中技术人员已知的其它方法来转入作物植物细胞中。向植物中转入基因可使用不同的细菌物种，如BroothaertsWa/.(2005)和美国临时申请60800872中所述的那些，其作为参考并入本申请。本发明的重组DNA构建体可使用苜蓿中华根瘤菌、根瘤菌、百脉根中间根瘤菌、或其它能够转化植物细胞的细菌通过转化转入作物才直物细胞中。本发明包括用于土壤杆菌介导的植物转化的、植物转化载体。本发明的载体通常是质粒，但是复制起点可被来自r印ABC家族的其它复制起点所替代，用于在土壤杆菌中维持极低的拷贝数(每细胞l-3个拷贝)。此外，没有土壤杆菌-维持用复制起点的载体能够通过T-DNA上的、可整合到根癌土壤杆菌中的Ti质粒、发根土壤杆菌中的Ri质粒、或经同源重组整合到土壤杆菌染色体上的序列从而在土壤杆菌中得到维持。这可产生与减少非T-DNA插入相同的效果，并增加低拷贝数转化事件，因为染色体、Ti或Ri质粒均以单拷贝形式存在。当根瘤菌或非土壤杆菌用于植物转化时，含有GOI的T-DNA可以整合到染色体上，或者整合到宿主细菌的"/^4万C质粒上，可产生与使用土壤杆菌相同的效果。本发明的载体含有土壤杆菌Ti质粒的右边缘或者左边缘区中的至少一个。载体也可含有至少一对边缘区域。载体可包括4对边缘区域，但载体通常只含有1或2对。本发明的载体可以进一步含有用于在细菌宿主中维持存在的选择标记的编码区。选择标记的编码区包括可赋予壮观霉素或链霉素抗性的、编码Tn7氨基糖苷腺苷转移酶()的Spec/Strp、或庆大霉素(Gm,Gent)选择标记基因。其它抗性标记包括羧千青霉素、氨卡青霉素及卡那霉素抗性基因。本领域的技术人员公知其它抗性基因也可用于本发明。本发明的载体也可包含用作植物选择标记基因的编码区，典型地，它位于T-DNA中，可4吏用相应的试剂来选4奪转化的才直物细胞。植物选择标记可提供针对阳性选择化合物的抗性，例如，抗生素抗性(譬如，卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素等)或除草剂抗性(例如，包括但并不限定于草甘膦、麦草畏草胺磷、磺酰脲、咪唑啉酮、溴苯腈、茅草枯、环己二酮、原卟啉原氧化酶抑制剂及异嚅唑草酮除草剂)。编码涉及除草剂耐受性的蛋白的多核苷酸分子在本领域是已知的，其包括但并不限定于编码a)赋予对草甘膦耐受性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS;US5，627，061、US5，633,435、US6,040，497、US5,094，945、WO04074443和WO04009761)、草甘膦氧化还原酶(GOX;US5，463,175)、草甘膦脱羧酶(WO05003362和US申请20040177399)、及草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT;US20030083480)等；b)赋予对诸如麦草畏这样的植物生长素样除草剂耐受性的麦草畏单加氧酶(DMO,由^ZmC编码)(US申请20030115626、20030135879;Hermane"/.，2005);c)赋予对草丁磷或草胺磷耐受性的草丁磷乙酰转移酶(6ar)(US5,646，024、US5,561，236、欧洲专利275,957、US5，276,268、US5，637，489、US5,273，894);d)赋予对2，2-二氯丙酸(茅草枯)耐受性的2,2-二氯丙酸脱卣素酶(W09927116);e)赋予对诸如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基氧基苯甲酸盐(pyrimidyloxybenzoates)及稻疸酞这样乙酰乳酸合酶抑制剂耐受性的乙酰轻基酸合酶或乙酰乳酸合酶(US6，225,105;US5，767,366;US4，761，373;US5,633,437;US6，613,963;US5,013,659;US5，141,870;US5,378，824;US5,605,011);f)赋予对溴苯腈耐受性的卤代芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)(Bxn)(WO8704181A1;US4,810，648;WO8900193A);g)赋予对环己二酮(稀禾定)及芳氧基苯氧基丙酸盐(氟吡甲禾灵)耐受性的修饰的乙酰辅酶A羧化酶(US6,414，222);h)赋予对石黄酰胺类除草剂耐受性的二氢叶酸合酶""/1)(US5,597,717;US5,633，444;US5,719，046);i)赋予对三嗪除草剂耐受性的32kD的光系统II多肽(psbA)(Hirschberge"/.,1983);j)赋予对5-甲基色氨酸耐受性的氨基苯曱酸盐合酶(US4,581,847);k)赋予对氨乙基半胱氨酸耐受性的二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)(W08911789);1)赋予对诸如达草减这样的哒溱酮类除草剂耐受性的八氢番茄红素去饱和酶(C7tl)(曰本06343473);m)赋予对诸如异-恶唑草酮这样的环丙基异喁唑耐受性的羟苯基丙酮酸加双氧酶(WO9638567;US6,268，549);n)赋予对原卟啉原氧化酶抑制剂耐受性的修饰的原卟啉原氧化酶I(protox)(US5，939，602);以及o)赋予对含芳氧基链烷酸盐基团的除草剂耐受性的芳氧基链烷酸盐加双氧酶(AAD-1)(WO05107437)的多核苷酸分子。这些除草剂的实施例包括含苯基的植物生长素(譬如2,4-D和2，4-滴丙酸)、吡啶基氧基植物生长素(譬如氟草烟和绿草定)、芳氧基苯氧基丙酸盐(AOPP)乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂(譬如氟吡曱禾灵、精喹禾灵和二氯苯氧基苯氧基丙酸)、以及5-取代的苯氧基乙酸盐原卟啉原氧化酶IX抑制剂(譬如吡草醚和氟烯草酸)。除了植物选择标记外，在某些实施方案中需使用报告基因。在某些情况下，报告基因可以与选择标记一起或不一起使用。报告基因是典型地不存在于受体生物或组织中、并且编码可引发某些表型改变或酶的性状的蛋白基因。在WisingWa/.(1988)中提供了这些基因的实施例，作为参考并入本文中。优选的报告基因包括大肠杆菌uidA基因座的P葡糖醛酸酶(GUS)、来自大肠杆菌Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、来自生物发光水母维多利亚多管水母(^e^/o"av/"oWa)的绿色荧光蛋白、基来自北美萤火虫(/^o"m^/yrafe)的荧光素酶基因。可在上述基因导入到受体细胞后的适当时间进行检测报告基因表达的实验。优选地，这类实验均如JeffersonWa/.(1987)所述使用大肠杆菌uidA基因座编码的(3葡糖普酸酶(GUS)的基因来鉴定转化细胞，本文中用GUS来指示。在某些实施方案中，本发明的载体包含一个用于在大肠杆菌中维持其存在的复制起点。这些复制起点可以来源于，例如，pBR322或者pUC。这种复制起点的一个实施例是Co/El。本发明的载体可以包括任何可在大肠杆菌中维持至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100或者更多个质粒拷贝的复制起点。在某些实施方案中，ori在大肠杆菌中可维持更高拷贝数(譬如，多于5、10、15、20、25或30，在某些进一步的实施方案中，多于10、15、20、25或30)。这些高拷贝数载体使得扩增用于转化的DNA的量更为容易。因此，在某些实施方案中，本发明包括含有可在大肠杆菌中提供高拷贝数的on'的载体，以及第二，譬如属于";ABC家族的on'——例如on7/，它在土i襄杆菌中维持才及低的拷贝数，例如1-3个。本发明的载体也包括至少一个含有顺式和/或反式元件的DNA节段，这些元件对于在诸如土壤杆菌这样的植物转化细菌中的拷贝质粒的维持(1-3个拷贝)是必要且足够的。优选地，这种至少一个DNA节段含有来自r印ABC家族的复制起点。此外，这种至少一个DNA节段可以包括发根土壤杆菌的Ri质粒复制起点(on^)和/或来自豆根瘤菌的质粒p42b的r卬ABC起点。更进一步地，"/ABC家族优选地含有复制基因^p丄re;Jg和"pC。这种至少一个节段也可以含有基因间区域序列——igsl和igs2。更进一步地，这种至少一个DNA节,殳可在r印C后包括16-bp的回文序列。在本文用法中，Vej^5C"质粒的"复制起点"，即质粒利用这些序列在细胞中复制并分配，可以定义为含有(譬如，来自发根土壤杆菌中pRi的SEQIDNO:32;来自豆根瘤菌中p42b的SEQIDNO:38)、，5(譬如，来自发才艮土壤杆菌的SEQIDNO:SEQIDNO:33;来自豆根瘤菌中p42b的SEQIDNO:39)、"pC(譬如，来自发根土壤杆菌的SEQIDNO:SEQIDNO:34;来自豆根瘤菌中p42b的SEQIDNO:40)、igsl(譬如，来自发根土壤杆菌的SEQIDNO:35;来自豆根瘤菌中p42b的SEQIDNO:41)、igs2(譬如，来自发根土壤杆菌的SEQIDNO:36;来自豆根瘤菌中p42b的SEQIDNO:42)，并可以选择性地含有回文序列(譬如，SEQIDNO:37)。在其它实施方案中，复制起点可含有在植物细胞转化用细菌细胞中维持低拷贝数(例如，1到约3个拷贝)所必需的那些序列。这些m/7^8C复制起点的实施例可在SEQIDNOs:l-4中、在发根土i泉杆菌中pRi质粒的or/及/中、在豆根瘤菌的p42b质粒中、以及其它来源中找到。在一个实施方案中，上述至少一个节段如SEQIDNO:l所示。在其它实施方案中，这种至少一个节段主要上由下列序列所组成如SEQIDNO:2所示的pMON83882碱基中5618个bp(633-6250)的on'iz'。在另一个实施方案中，这种至少一个节段含有和/或主要由如SEQIDNO:3中所示的序列组成。在另外一个实施方案中，这种至少一个节)殳可以是如SEQIDNO:4所示的来自豆4艮瘤菌的p42b的repABC。那些与本文所定义的任意核酸或多肽序列有着特定程度的相似性的序列也包含在本文所定义的任意核酸或多肽序列定义内。例如，应注意到本文虽然给出了明确的核酸序列，但可在不偏离本发明范畴的情况下对所述序列进行修饰。具体地，与本文给出的核酸序列基本上一致的核酸序列可用于本发明。如果一个初始的核酸序列与其它核酸序列(或其互补链)进行优化比对(在比对窗口中适当的核苷酸插入或者缺失总数低于参考序列的20%)时，在至少有200个核苷酸位点——优选地为至少300个核苷酸位点、更优选地为至少400个核苷酸位点、最优选地是覆盖第一个核酸全长的比对窗口中，它们有至少约75%的核普酸序列同一性，优选地为至少约80%的同一性，更优选地为至少约85%、86%、87%、88%或89%的同一性、最优选地为至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，则第一个核酸序列与参考核酸序列表现出"基本上同一的"。可以根据PearsonandLipman(1988)的相似性方法对在比对窗口中所比对的序列进行优化比对；优选地可通过用计算机来执行WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0,GeneticsComputerGroup,Madison,WI中的这些算法来进行。参考核酸可以是全长分子或者更长分子的一部分。或者，如果两个核酸可以在严谨杂交条件下彼此杂交则它们具有实质上的同一性。术语"严谨杂交条件"定义为试验序列可特异性与靶序列杂交而不会同非靶序列杂交的条件，可根据经验来确定。术语"严谨条件"就其功能而言定义为与通过特定杂交程序的一个核酸探针与耙核酸(即，与感兴趣的特定核酸序列)的杂交有关(参见，例如SambrookWa/.,1989,在9.52-9.55,Sambrook"a/"1989在9.47-9.52，9.56-9.58;Kanehisa，1984;及WetmurandDavidson,1968)。适合用于DNA杂交的严谨条件为，例如，约45。C的6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC),然后于50。C用0.2xSSC清洗。这类方法的细节对于本领域的技术人员而言是已知的，可在包括但并不限定于CurrentProtocolsinMolecularBiology(1989)这样的实验室手册中找到。在某些实施方案中，可通过将清洗改变成50°C、约2.0xSSC而使用更低的严谨条件。此外，清洗步骤中的温度可以从低严谨条件时的室温——约22°C，增加到更高严谨条件时的约65°C。温度和盐均可变化，或者温度与盐浓度中的一个保持恒定，而改变其它变量。例如，对于高严谨度而言，使用DNA或RNA探针或引物的杂交可于65°C在6xSSC、0.5%SDS、5xDenhardt，s、100jag/mL非特异DNA(譬如，超声破碎的鲑鱼精DNA)中进行，然后于65。C在0.5xSSC、0.5%SDS条件下清洗。如果一个核酸分子与另一个核酸分子表现出完全的互补性，则说它们"互补"。在本文用法中，当一个分子中的每个核苷酸均与其它分子中的核苦酸互补时，则说分子表现出"完全的互补性"。如果两个分子彼此杂交后具有足够的稳定性可使它们在至少是常规的"低严谨度"条件下彼此保持退火，则说这两个分子"最低程度上互补，，。类似地，它们彼此杂交后具有足够的稳定性可使它们在常规的"高严谨度"条件下彼此保持退火，则说分子是"互补的"。可以预料到，只要探针或引物与靶序列结合的特异性仍有保留，诸如更低杂交和/或清洗温度这样的低严谨度杂交条件可用于鉴定具有更低程度序列相似性的相关序列。因此，可使用本发明的核苷酸序列，它们可与互补的延展DNA片段选择性地形成双螺旋分子。通过杂交来检测DNA片段对于本领域的技术人员而言是周知的，因此依赖于预设好的用法，人们期望使用不同的杂交条件来获得程度不同的探针对靶序列的选择性，所选择的方法依赖于所期望的结果。在Sambrook，"a/.(1989)中由HaymesWa/.(1985)描述了常规的严谨条件。本发明中DNA构建体可以通过合适的土壤杆菌介导的植物转化方法引入到所需植物宿主的基因组中。通过根癌土壤杆菌介导的转化来转化植物的方法包括Fraley"a/"(1985)和Rogers"(1987)。通过使用基因工程改造过的属于土壤杆菌属的土壤细菌可实现土壤杆菌介导的转化。有几个土壤杆菌物种可介导称为"T-DNA"的特定DNA的转移，T-DNA经基因工程改造后可携带任意所需的DNA片段进入到许多植物物种中。推进T-DNA介导的发病机理的主要事件是导入致病基因，然后进一步发展并转入T链。其可参阅许多综述文章(Ream,1989;HowardandCitovsky,1990;Kado,1991;Winans,1992;Zambryski,1992;Gelvin，1993;BinnsandHowitz，1994;HooykaasandBeijersbergen,1994;LesslandLanka，1994;ZupanandZambryski,1995)。诸如苜蓿中华根瘤菌，根瘤菌、百脉根中间根瘤菌这样的非土壤杆菌物种，也可用于使用本发明的DNA构建体来转移基因(Broothaerts"a/.，2005以及美国临时申请60/800,872,作为参考并入本文中)。也可使用其它将DNA导入细胞的方法。这些方法对于本领域的技术人员而言是周知的，并可包括诸如显^(鼓注射、电穿孔及基因枪法这样的化学方法及物理方法。植物细胞再生技术依赖于控制好组织培养物生长培养基中特定的植物生长素，也典型地依赖于与所需核苷酸序列一起导入的生物杀灭剂和/或除草剂标记。对于来自豆科(丄egwm'wosae)(紫花苜蓿、大豆、苜蓿等)、伞形科(t/mZ)e〃^rae)(胡萝卜、芽菜、欧洲防风草)、十字花科(0"c(/^ae)(甘蓝、萝卜、油菜/油菜籽等)、葫声科(CM，6/,a固e)(各种瓜和黄瓜)、禾本科((7ra油eae)(小麦、大麦、水稻、玉米等)、茄科OSo/awaceae)(马铃薯、烟草、番茄、胡椒)、诸如向日葵这样的多种开花作物、诸如杏、腰果、胡桃及美洲山核桃这样产坚果的树木的宿主，已有具有合适流程的方法可供选择。参见，例如，AmmiratoWa/.(1984);ShimamotoW(1989);Fromm(1990);Vasil"a/"(1990);VasilWfl/.(1992);Hayashimoto(1990);andDatta^a/.(1990)。在KleeWa/.(1987)中有关于这类再生技术的一般性描述。在本发明实践中通过向植物基因组中引入转基因DNA构建体的方式来转化植物的方法及组合物可包括任何众所周知的及阐释过的方法。例如，在US5,824,877、5，591，616和6,384,301中阐明了土壤杆菌介导的转化，它们作为参考并入本文中。植物:包括:并不限定于刺槐:紫花苜蓿、小^香、苹果、:、洋蓟、、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆子、甜菜、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、油菜、香瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芽菜、大白菜、樱桃、芫荽叶、柑橘、克莱门氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、宽叶莴苣、桉树、茴香、无花果、森林树木、葫芦、葡萄、柚子、蜜露、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松、芒果、瓜、蘑菇、坚果、燕麦、秋葵、洋葱、桔子、观赏植物、木瓜、香芽、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松树、波萝、车前草、李子、石榴、白杨、马铃薯、南瓜、榲梓、智利松、菊苣、萝卜、覆盆子、水稻、黑麦、高梁、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、糖、甘蔗、向日葵、甘薯、楓香、橘子、茶、烟草、番茄、草皮、蔓生植物、西瓜、小麦、山药及绿皮西葫,。在优选的实施方案中，植物是大豆、玉米、油菜或棉花植物。在具体的实施方案中，所述植物是玉米植物。在具体的实施方案中，植物是大豆植物。在其它实施方案中，植物是棉花植物。在更进一步的实施方案中，植物是油菜植物。本方法给出了改良后的转化效率，显著降低了用载体骨架DNA——或"非T-DNA"转化的植物的频率。在某些实施方案中，用非T-DNA转化的植物的频率低于或等于约20%。在某些实施方案中，用非T-DNA转化的植物的频率低于或等于约15%，或低于等于约10%,或低于或等于约8%或5%。此外，本发明的方法给出了非常高的单拷贝或双拷贝T-DNA转化事件。例如，在某些实施方案中，使用Southern印迹测量时，单拷贝或双拷贝T-DNA转化事件的频率大于或等于约70%或75%。在某些实施方案中，使用Southern印迹测定时，该频率大于或等于约80%或85%,在某些情况下，为90%或95%。在某些实施方案中，用非T-DNA载体区转化植物的频率比用不的同样植物变种中T-DNA的频率低约50°:、40%、20%、15%、10%。在其它实施方案中，单拷贝或双拷贝T-DNA转化事件的频率比转化的同样植物变种中单拷贝或双^"贝T-DNA转化事件的频率高约50%、40%、20%、15%或10%。因此，本发明中特定的实施方案提供了使用含有本文所示的序列在内的、诸如来自发根土壤杆菌的onW及来自豆根瘤菌中质粒p42b的r印A8C起点这样的repABC元件，降低非T-DNA载体区所转化的植物的频率的方法。本发明还涉及含有本文所示的序列在内的、诸如来自发根土壤杆菌的on7^及来自豆根瘤菌中质粒p42b的";^45C起点这样的repABC元件在增加单拷贝或双拷贝T-DNA转化事件的频率中的用途。在某些实施方案中，可同时使用两种方法以实现具有更低骨架整合频率以及更高单拷贝或双拷贝T-DNA转化事件频率的转化事件。实施例提供下述实施例是为了更好低阐明本发明，不应以任何方式理解为限制了本发明的范畴。本领域的技术人员知道在不背离本发明思想及范畴的情况下，可对本文所述的方法及基因进行多种修饰、添加、取代、截短等。实施例1载体的制备按照SambrookWa/.(1989)所述的标准流程来进行克隆步骤。使用经Dml消化从pCGN1589上切下的5.6kb的片段来替换经PshAI和BstXI消化并用T4DNA聚合酶补平的pMON67438上的oriV片段。从而生成基于on'i^的载体pMON83856(图1)。通过将来自onT控制载体pMON67438的gws和CP4片段用Accl(平端化)/BamHI消化后插入到已用Pmel/BamHI打开的pMON83856中，从而生成5.6kb的on^试验载体pMON83882(图2)。为了截短on7/片段，合成了5，CACGTGTACAAGGTAGAATCCGCCTGAG3'(5，启动子上游；SEQIDNO:5)和5，GTATACAGGCTCTCCTTCACGATCAAC3，(onT/3，端，在r印C后面；SEQIDNO:6)，并使用高保真pfu聚合酶以pMON83856为模板进行PCR。纯化PCR产物并插入到经Afel和Xhol消化并用T4DNA聚合酶补平的pMON83930中，以替换片段。然后将所获得的具有截短的on7/的载体pMON83934(图3)通过DNA测序进4亍确认。为了生成具有截短的on'W的试-验载体pMON83937(图4),使用Kpnl打开pMON83934，用T4DNA聚合酶补平，随后经BamHI消化；然后将来自oriV控制载体pMON67438的和Cp4片段用Accl消化，用T4DNA聚合酶补平，之后进一步用BamHI消化。将两个片段用T4DNA连4妻酶连接后形成pMON83937。为了构建玉米转化载体pMON97352(图5)，将两个寡聚物5'-AGCTTGGGCCCCTCGAGGCTAGCACTAGTG-3，(SEQIDNO:7)和5'-GATCCACTAGTCCTAGCCTCGAGGGGCCCA-S'(SEQIDNO:8)退火合成含有Spel和PspOMI位点的连接物序列，插入到经BamHI和HindIII消化的pMON83856中。用Spel和PspOMI打开所获得的中间on'"载体，与经Notl和Spel消化从pMON92726(图6)上切下的CP4及gus表达盒连接(参见图5,pMON97352)。使用onT亲代载体pMON992726作为对照载体与玉米on'W试验载体pMON97352进行比较。为了构建on72T对照载体pMON87488(图7),从pMON51676上切下章鱼碱右边缘，用T4DNA聚合酶补平后插入到经Sall/Spel打开、T4DNA聚合酶补平并用CIP处理的pMON87485中。为了生成onT2T载体——pMON96001(图8)和pMON96010(图9)，用Afel和Xhol除去pMON87488上的onT,将载体用T4DNA聚合酶补平，然后插入通过用Pmll和BstZ171消化pMON83934从pMON83934获得的4.2kb的on7/复制子，生成pMON96001。插入通过用Dral消化获得的来自pCGN1589的5.6kb的on^复制子以生成pMON96010。实施例2大豆作物转化可使用本领域已知的多种方法通过土壤杆菌介导的转化来转化大豆细胞并将细胞再生成完整的可繁殖的植林。一种用于大豆转化的方法(譬如，US6,384，301和7,002,058)使用了器官形成方法。将本发明所述的DNA构建体(譬如，如图2中充分所示的质粒pMON83882、如图4中充分所示的质粒pMON83937)转化到无害的土i裏杆菌菌4朱ABI中。将两个oriV对照载体——pMON67438和pMON83898(GOI相同但方向不同)也转入到土壤杆菌细胞中。前述的双T-DNA构建体以及各自的对照也用来转化大豆。DNA构建体通过电穿孔方式转入土壤杆菌中。在含50mg/1(对于onT^'载体)或75mg/1(对于onT载体)壮观霉素及50mg/1卡那霉素的LB培养基上挑取单克隆，并在20-50ml含有相同选择物的液体LB培养基中于摇床上以200rpm温育。通过来自10ml培养物的少量制备的质粒的限制性内切酶消化来鉴定土壤杆菌中的质粒。剩余的液体培养基与甘油混合，终浓度为20%，分装后作为菌种培养物保藏在-80。C。为了制备用于转化的土壤杆菌接种物，将0.25-1ml冷冻的菌种培于26。C-28。C、200:m振荡培i过夜至中对数-生长期。在分^光i^度计上测定OD66o约0.3时将培养物离心，并直接悬浮在接种培养基(INO培养基)中。按照描述(譬如，US7，002,058)使用大豆栽培种A3525来进行土壤杆菌介导的转化。将大豆种子于室温下在BGM培养基中生长少于14小时，然后利用如US申请20050005321中所述的机器从大豆成熟种子中切下分生组织外植体。为了分批超声裂解，将约100个PLANTCON盖子中的外植体与20mlINO培养基中的土壤杆菌悬浮液混合，然后在W-113Sonicator上超声20秒。对于大批超声裂解，将约1000个PLANTCON盖子中的外植体与100mlINO培养基中的土壤杆菌悬浮液混合，然后超声20秒。超声后，在同一个PLANTCON中的外植体于23°C、16/8小时光照/黑暗周期的条件下共培养2-4天。然后将外植体转移到含75pM草甘膦的WPM选择培养基表面。每个PLANTCON含有约50个外植体。2周后，将外植体与插入到培养基中的初生胚根再次转移到75草甘膦固体WPM培养基上，每个PLANTCON含有约25个外植体。将接种6-10周后获得的具有完全延展的三片叶子的幼芽定植在含有0.1mg/1IAA和25(iM草甘膦选择物的BRM培养基中。将生根的幼苗转移到温室中至成熟。大豆转化中所用的多种培养基详细列于下面表1中。上述转化和再生方法可使植物明显降低出现载体骨架DNA。此外，减少插入的T-DNA的拷贝数也使植物获得额外收益。通过这种方法生成的植物是本发明的一个方面。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>通过本领域已知的植物转化与组织培养方法可转化其它双子叶植物细胞。在本领域，使用土壤杆菌介导的方法来转移本发明的质粒的T-DNA是众所周知的。例如棉花(US5，004，863、5,159,135、5,518,908、5,846,797和6，624，344，作为参考并入本文中)和芸苔(US5，750，871)。实施例3玉米作物转化将两个含有相同的均在水稻肌动蛋白启动子控制下的植物选择标记基因CP4和gw基因盒的载体(图5)——pMON97352(on7/，在土壤杆菌中单拷贝)和pMON92726(onT，在土壤杆菌中多拷贝作为对照)，电穿孔转入根癌土壤杆菌菌林ABI中以用于玉米转化。将甘油储液中的、含有载体的土壤杆菌在添加了抗生素(均为活性成分)卡那霉素(40mg/L)、壮观霉素(31mg/L)、链霉素(38mg/L)和氯霉素(25mg/L)的固体LB培养基上划线，然后于28。C培养2天。在用土壤杆菌接种玉米未成熟胚前两天，从土壤杆菌平皿上挑取一个克隆或者一小环土壤杆菌，接种在250mL烧瓶内的25mL添加了62mg/L壮观霉素及40mg/L卡那霉素的液体LB培养基中。将烧瓶置于摇床上于27-28。C以约150-200rpm过夜。然后在同样的液体培养基中将土壤杆菌培养物进行稀释(1到5)，并放回摇床。几个小时后，在接种前一天，于3500rpm、15分钟离心土壤杆菌细胞。将细菌细胞沉淀重悬在含200jliM乙酰丁香酮和50mg/L壮观霉素及25mg/L卡那霉素的诱导培养基中，调整细胞在OD柳的密度为0.2。然后将细菌细胞培养物(每个250mL烧瓶50mL)放回摇床并培养过夜。在接种曰的早晨，将细菌细胞离心并用添加了200pM乙酰丁香酮的液体1/2MSVI培养基(表2)清洗。再一次离心后，将细菌细胞沉淀物重悬在添加了200MM乙酰丁香酮(表2)的1/2MSPL培养基(表2)中，调整细胞在OD柳的密度为1.0以进行接种。试剂均为商品，可从许多厂商(参见，例如SigmaChemicalCo.，St.Louis,Mo)购买。表2实施例3中使用的培养基<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>培养基1/2MSVI和yzMSPL以液体来使用共培一所有其它培养基用3g/L植物凝胶来凝固用于草1^养基用5.5mg/L低EE0琼脂糖来凝固。i"膦选择。在本研究中使用的是玉米谱系LH244(US6,252，M8)。收集含有未成熟胚的穗并在使用前于4。C冷藏保存。从表面灭菌的穗上分离未成熟的胚，直接置于微离心管中已制备好的土壤杆菌细胞悬浮液中，温育5到20分钟。用细头的灭菌的移液管吸除土壤杆菌细胞悬浮液后，将未成熟的胚转移到共培养培养基上(表2)。于黑暗培养箱中培养胚(23°C)约24小时。共培养后，将胚转移到添加了500mg/L羧千青霉素和O.lmM草甘膦的改良的MS培养基上(诱导MS,表2)，于30。C生长2星期，然后在黑暗培养间于27-28。C再生长1周。然后将所有的愈伤组织小块分别转移到第一种再生培养基上一一与上述相同的培养基，只是2,4-D和毒莠定被替换为3.5mg/LBAP(MS/6BA，表2),并且羧爷青霉素的水平下调为250mg/L。将培养物移到光周期为16小时光照/8小时黑暗及27。C的培养间中。5-7天后，将愈伤组织小块转移到第v二种再生培养基(MSOD,表2)上。在另外两周后，将已经具有再生的芽的愈伤组织小块转移到Phytatrays的同样不含激素的培养基中以进一步生长。将具有一个或多个健康根的再生植物(R0)移到温室内泥炭罐中的土壤里。7到10天后，将它们移植到12英寸的罐中并移到条件适于普通玉米植物生长的暖房中。植林可以自花授粉或与野生型植林杂交。实施例4对骨架DNA及拷贝数的分子分析A.用单T-DNA构建体转化大豆从使用本发明的DNA质粒转化的、在暖房中生长的植物上所采集的组织样品中提取DNA。利用分析DNA的PCR方法使用正向引物5一ACAAGGTAGAATCCGCCTGAG-3'(Xd487b;SEQEDN0:11)和re^4反向引物5-TTCAACTCTGGCATCTCAGAC-3'(Xd488;犯QIDN0:12)来检验on7^'序列用作载体骨架的指示物。该DNA与LB相邻，并且在从再生植物所提取的DNA中有其存在表明发生了越过LB的载体序列的转移。可通过许多方法，例如CTAB法(RogersWa/.,1985)或DNAeasy96PlantKit(Cat.#69181，QiagenInc.,Valencia,Calif.)按照所附的使用说明从植物组织中分离DNA。Taqman(PEAppliedBiosystems,FosterCity,Calif.)是一种检测及鉴定DNA序列存在的方法，可根据厂商提供的手册来完全理解它。在所述方法中使用DNA引物分子(SEQIDNO:ll和12)来鉴定来自植物提取物的onTz'DNA。本领域中的技术人员可改进条件与仪器以获得相同的结果。用对照DNA质粒(pMON67438或pMON83898)和本发明的质粒(pMON83882或pMON83937)转化从成熟种子中切离的大豆分生组织茎轴，然后再生成完整植抹。分析完整植林是否存在目的基因(CP4)以及非T-DNAon7/和onT序列。表3给出了分析结果。在检验的39个植抹中，只有3个具有载体骨架序列，频率为7.7%。相比之下，对照质粒(onT质粒)的载体骨架频率为21%到25%(依赖于所考虑的样本)。这一差异是相当出乎意料的。已商品化的转基因植物的另一个重要特征是存在低插入复杂性(lowinsertcomplexity)。这通常是指"低拷贝数"。如果插入的拷贝数过高则很难选择后代并成功培育转基因性状。理想地，在转基因事件中只有单个拷贝的转基因。可通过本领域已知的几种分子生物学方法来确定拷贝数。Southern印迹分析是最为常用的方法。使用Invader⑧技术(ThirdWaveInc.Madison，WI)的方法也用来确定转基因植物中T-DNA插入的拷贝数。转化大豆植物细胞:然后如上所述再生成完整的植;朱。用两种方法来分析所获得的转基因植抹中的拷贝数1)"lnvaderCP4"方法及2)Southern印迹。结果如表3所述。表3.pRiori载体骨架影响转化频率、拷贝数及大豆转化中的插入片段。a来自三个并列实验的混合数据。b并列比较的植物数。所产生的pMON67438植抹的混合的植物数。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>使用"InvaderCP4"方法，本发明的质粒——pMON83882可导致41%的单拷贝转化事件，相比之下，对照质粒pMON67438的单拷贝转化事件在使用其它实验的混合样本时仅有25%，或者在并列实验中仅为37%。将单拷贝和双拷贝事件一起考虑，pMON83882导致了79.5%的所述事件，相比之下，使用对照质粒，在并列实验中为60%，在混合样本中为63%。使用Southern印迹比较，pMON83882产生的单拷贝事件为56.4%,双拷贝事件为33.3%,合并起来就是总共约90%的单拷贝及双拷贝事件。此外，这些结果均是相当出乎预料的。B.在大豆双T-DNA转化子中转基因拷贝数的分子分析。为了分析onT^'对2T-DNA转化子的影响，6次并列比较了4.2kb的2T载体pMON96001和2T载体pMON87488。5.6kb的2T载体pMON96010也包括在这些预实验的最后两次比较实验中(表4,组A)。从采自暖房成熟种子的种子碎片中提取总DNA,并通过利用CP4探针和NOS探针的Invader技术来确定转基因拷贝数。CP4Invader⑧4企测实验使用下述序列作为靶位点5，TCGCTTTCCTTGACGCGGAGTTCTTCCAGACCGTTCATCACGG3,(SEQIDNO:13〉，以GTAGGTGATTGGCGTTG(SEQIDNO:14)作为探针序列。NOSInvader⑧4企测实验使用下述nos3，序列作为靶位点TGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACT(SEQIDNO:15)，以GTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGA(SEQIDNO:16)作为NOSInvader⑧探针序列。单和/或双拷贝转化子从对照onT载体中的35%增加到两个载体中的超过40%。在RO植林中没有标记物的植抹的频率(没有标记物的事件/总R0植林)从对照oriV载体中的4,76%,在两个载体中分别增加到16.4%和18.4%。总的说来，在双on7/2T载体中，没有标记物的转化的频率(没有标记物的事件/最初移植的数目)与onT2T载体中的相比要高两倍。用其它有着更大最初移植数目的平行实验进一步来比较onT对照2T载体与4.2kb的onW2T载体(表4，组B)。on/2T载体重现了上述结果l+2拷贝事件频率和没有标记物的频率(MF%)均增加了，并且没有标记物的转化频率比on'W载体中的要高两倍。这些结果表明通过增加低拷贝事件以及提高没有标记物的转化频率，oWW2T载体明显比2T载体可更加有效地产生没有标记物的植抹。表4.复制起点的类型对于2T-DNA载体转化大豆的影响。注1)TF:转化频率=R0植林/总外植体；2)1+2拷贝Co-T:1和/或2个拷贝的gus和CP4标记的2T-DNA共转化子。只有1-2个拷贝事件进一步用来分析种子中标记物的分离；3)MF事件通过种子分离分析来自l+2拷贝的共转化子中的gus基因阳性、没有标记物的事件；4)MF。/。植抹gus阳性、没有标记物的植林/RO植抹并；5)没有标记物的转化频率(MFTF)=不连锁事件#/起始外植体#。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>C.单T-DNA构建体转化的玉米中载体骨架DNA与转基因拷贝数的分子分析为了研究复制起点对玉米转化的作用，将含有均在水稻肌动蛋白启动子控制下的gws和CP4基因的5.6kb的载体pMON97352与带有含gus和CP4基因的相同T-DNA构建体的onT载体pMON92726进行比较。将来自栽培种LH244的玉米未成熟胚与含有on'W或含有onT载体的土壤杆菌同时进行温育。每个处理组均由约110个胚组成。进行了总共16个并列比较实验(sidebysidecomparisonexperiments)。on7/载体比oriV对照载体明显表J见出更低的转化频率(图10)，对于onT/和onT载体平均TF分别为9.5%和16.3%。不过，on'W和on7载体的全部转化效率是相同的。通过EndpointTaqMan检验(AppliedBiosystems，FosterCity,CA)来确定转基因玉米植物中是否存在骨架序列一一针对on'W或on'F序列、靠近LB缺刻位点的简短通读(shortread-through)3，侧翼区的LB序列以及在RB缺刻位点前的用于通读完整骨架的5，侧翼区的RB序列。onT引物为5'AACGCCTGATTTTACGCGAG3，(正向；SEQIDNO:17)和5'CAATACCGCAGGGCACTTATC3,(反向；SEQIDNO:18)以及用荧光染津牛6-FAM在5，末端进行标记的揮针CCCACAGATGATGTGGAC(SEQIDNO:19)。oni^'引物为TGGCAAGGAATGGGTTTGAG3，(正向；SEQIDNO:20)和5，CTACAACTACAGGCGCTGCTTTT3,(反向；SEQIDNO:21)及探针6-FAM-TGGCGAAGTCTGTCC(SEQK)NO:22)，用于4企测LB缺刻4立点下游621bp处的on7^'序歹'J。RB5，侧翼引物为5'GCCAAGGGATCTTTTTGGAAT3,(正向；SEQIDNO:23)和5'CCACCCAAACGTCGGAAA3，(反向；SEQIDNO:24)及探针6FAM-TGCTCCGTCGTCAGG(SEQ]DNO:25)，用于4全测RB缺刻位点前186bp的RB侧翼。用于纟企测LB缺刻位点下游35bp处的LB的引物为5'GCACCCGGTGGAGCTT3，(正向；SEQIDNO:26)和5，TCTGCCTAACCGGCTCAGT3，(反向；SEQIDNO:27)以及在5，末端标记荧光染料6-FAM的探针CATGTTGGTTTCTACGCAG(SBQIDNO:28)。根据厂商的说明书(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)，约10ngDNA用于EndpointTaqMan⑧反应。如图11所示，约95%的来源于on'W载体的转基因植物是不含骨架的，这明显优于表现出约78%不含骨架频率的onT载体对照。由于载体骨架起始于缺刻位点后的LB终止于RB缺刻位点前，在来源于植物的onW和onT载体中使用三种不同的骨架探针(LB下游、on7^7oriV和RB上游)可揭示绝大多数转移的载体骨架含有完整的载体骨架序列。根据厂商的说明书(ThirdWaveTechnologiesInc.Madison,WI)使用CP4序列通过Invader⑧检验来确定CP4转基因拷贝数。使用TaqMan⑧!支术(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)通过确定gus盒转录终止子(如图5和6中的Pis4所示)来测定gus转基因拷贝数。/^/7TaqMan⑧引物为5'ATGAAATAAAAGGATGCACACAT3，(正向；SEQIDNO:29)和5，ACAACTTTGATGCCCACATT3，(反向；SEQIDNO:30)以及在5，末端标记荧光染料6-FAM在3，末端标记MGBNFQ的探针TGACATGCTAATCAC-(SEQIDNO:31)。图12所示的是转基因拷贝数试验结果。on7!'载体比对照onT载体显著地增加了单拷贝植抹频率，在on'&载体中2或多拷贝事件的频率却降低了。用两种不同探针的TaqMan和Invader⑧检验给出了类似的结果。由于不含单拷贝骨架的植抹在研究与开发上是最具价值的，因此在玉米中增加了单拷贝频率并降低了含有骨架事件的onTz'载体标志着在转基因项目生产品质上的一个重大改进。实施例5构建含有来源于根瘤菌的m/^45C复制起点的植物转化载体为了克隆来自豆根瘤菌CFN42林的re;ABC复制起点，从USDARhizobiumCollectionCenter获取USDA菌林。通过PCR使用引物5，CGASeiSAGTTACGGCTGATCGACCAGAC3'(Xd745;犯QIDNO:9)和5，GSeiAQSACGTCAACTCCAACCGCACCGT3,(Xd746;SEQIDNO:IO)/人在菌才朱CFN42中发现的豆根瘤菌质粒p42b上扩增4.3kb的repA8C片段，并连接到TOPO平端克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)上，获得pMON96941，通过测序来进行确认。用Pmll和AvrII(在引物序列中用下划线标出)消化"/7J5C片段，并连接到用Smal和AvrII打开的pMON96948上。直接将连接产物转入到根癌土壤杆菌AB2(卡那霉素敏感抹)感受态细胞中，涂布在含有50mg/l卡那霉素的LB平皿上。将kan抗性克隆在含有50mg/1卡那霉素的液体LB培养基中温育，并用miniprep制备质粒DNA。通过限制性消化来确认构建体。由于载体pMON96951不含有大肠杆菌复制起点，它无法在大肠杆菌内维持。如上所述使用pMON96951(图13)来转化植物物种。通过实施例4中所述方法来分析减少了质粒骨架整合以及高频率的低拷贝转化事件的转基因事件。通过对本文所述的说明及实践进行仔细思考，对于本领域的技术人员而言本发明的其它实施方案是显而易见的。应注意到说明和实施例只是用来作为示例，本发明的真正范畴与主旨如下面的权利要求所示。参考文献以下作为参考并入本文中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>AmmiratoefIn:恥/必。。左o/P/。WWCW紋e--Oop命e由，MacmilkoPubl.Co"1984.Ausubel"。/.，7w.'CWreWProtocolJ^fo/ecw/ar5fotogj;,John^Wiley&S咖,lac,NY，6.3,1-6.3.6，l鄉.BinnsandHowitz，In:5acter&rfjPa/Aoge6siyo/p/a/itoamijw&waiy,Dang(Ed.),Berlin:StringerVerla&119-138,1卯4.Broothaerts"Matore,433:629-633,2005.Datta扭。/.,别o/Tec/z"o/ogv,8:736-740,19卯.Fraleyaa/.,所o/Tec/wofos/，3:629-635,1985.Fromm,UCLASymposiumonMolecularStrategiesforCropImprovementjApr.16-22,CO，1990.Gelvin,In:2V。/wg幼fc/Vh'!to，KungandWu(Eds.)，AcademicPress,SanDiego，49-87，1993,Hayashimoto,P/a"f/^;w'o/.,93:857-863，1990.Haymesfl/"In:饰c/針'cJciV/孙6r她。ft'ow,爿PracftWi4,oacA,IRLPress,Washingt叫D.C"1985Herman"CA柳.，280(26):24759-24767,2005.HooykaaaandBeijersberg叫j朋.及ev./T^〖cpflfAoZ.，32:157-179,1994.HowardandCitovsky,别oos，，12:103-108,l柳.Jefferson祐a/.，5iocA抓.Soc.7>wm.，15:7,19,1987.Kado,C他及ev.WonfSc/.，10:1-32'1991.Kanehis^WwcUCT'^yitej.,12:203-213,1984.Klee"。/.,Z肌及ev.Ptowfi%j.，38:467-486,1987.LesslandLanka,Ce",77:321-324,1994.PearsonandLipman,外oc.Wfld爿c。rf.5c《.85(8):2444>2448,1988.Ream;i4nw.及ev.jP/i"cpaf/io"27:583-61S,1989.Rogerseffli，il/erto必五m;ymoZ,，153:253-277,1987.RogersP/加Mo/.飾Z.,5:69-76，1985.Sambrook"ai，Ih:油/鄉te^a/a6oratoy鹏/iua/,2ndEd，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1诉9.SambrookWMo/ecuZ。rc/owiKg:oJ。6o"cftwy欲朋wa/,2ndEd.'ColdSpringHarborLaboratoryPress,Col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